生化实验三--果蔬中蛋白质含量测定.ppt

生化实验三--果蔬中蛋白质含量测定.ppt

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生物化学实验第一部分果蔬成分的生化分析,综合实验一：

果蔬成分的生化分析,实验一果蔬中维生素C的定量测定（4学时）实验二果蔬中总糖及还原糖含量的测定（4学时）实验三果蔬中蛋白质含量的测定（4学时）实验四果蔬中过氧化物酶分析（12学时）,实验材料：

冬枣柚子14组梨（2个品种）58组盘菜萝卜912组,实验三果蔬中蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）,一、目的1、掌握蛋白质测定的方法和技术。

2、了解果蔬中蛋白质的含量。

二、原理考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。

在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

三、实验器材1、可见光分光光度计2、旋涡混合器3、试管16支,四、实验试剂1、标准蛋白质溶液牛血清清蛋白（bsa）：

配制成1.0mg/mL和0.1mg/mL的标准蛋白质溶液。

2、考马斯亮兰G-250染料试剂：

称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50mL95%的乙醇后，再加入120mL85%的磷酸，用水稀释至1L。

3、0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8）4、各种果蔬,五、操作1、标准曲线绘制：

取6支试管，按下表加入各试剂。

加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。

以各管相应标准蛋白质含量（g）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。

2、样品制备：

称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mLH2O或0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2mL水或缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm离心1520min，其上清液即为蛋白质提取液，供分析用。

（注：

盘菜，萝卜稀释至10mL）,3、样品测定：

试管中加自制蛋白质样品1.0mL，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。

根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。

注意事项：

、如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

比色反应需在1h内完成。

、测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。

不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，测定完后可用95%的乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

实验三果蔬中蛋白质含量的测定（Folin-酚试剂法）,一、目的1、掌握蛋白质测定的方法和技术。

2、了解果蔬中蛋白质的含量。

二、原理Folin-酚试剂法是双缩脲法的发展。

其试剂由甲、乙两部分组成。

甲试剂相当于双缩脲试剂，可与肽键起呈色反应。

乙试剂（即Folin-酚试剂）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色（钼蓝和钨兰的混合物），其颜色深浅与蛋白质的含量成正比，因此通过比色可测定蛋白质的浓度。

本方法最大的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍，较紫外分光光度法灵敏1020倍。

三、实验器材1、分光光度计2、电热恒温水浴箱3、试管15150mm4、刻度吸管0.5mL、1mL、5mL5、试管架6、容量瓶500mL7、坐标纸,四、实验试剂1、甲试剂：

2g无水碳酸钠，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液100mL混匀；：

称取CuSO45H2O0.5g，加入1%（35mmol/L）酒石酸钾钠溶液100mL，混匀。

使用前将与按50:

1混合即成碱性硫酸铜溶液。

（混合后，试剂只能使用一天，但碱性溶液和0.5%CuSO45H2O溶液可分别长期保存）,2、乙试剂：

在2L磨口回流装置中加入100g钨酸钠，25g钼酸钠及700mL蒸馏水，再加入50mL85%磷酸及100mL浓HCl，充分混合后用小火回流10小时。

回流完毕冷却后，加入150g锂，50mL蒸馏水及液体溴数滴，摇匀后再开口沸腾15分钟，以驱逐过量溴。

溶液冷却后稀释至1000mL，溶液呈透明淡黄色，置于棕色瓶中暗处冰箱内可长期保存。

使用前用标准NaOH溶液标定，以酚酞为指示剂，标定其酸度为1mol/L，此为乙试剂应用液，置冰箱中可长期保存。

3、牛血清白蛋白标准液（200g/mL）：

准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/LNaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到250mL。

4、0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8）5、各种果蔬,五、操作1、标准曲线绘制：

取7支试管，按下表加入各试剂。

迅速混匀，2025（或室温下）放置30min，用分光光度计，在波长500nm下，以“0”号管调零，测定各管吸光度。

以各管吸光度为纵坐标，各标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2、样品制备：

称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mLH2O或0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2mL水或缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm离心1520min，其上清液即为蛋白质提取液，供分析用。

（注：

盘菜，萝卜稀释至10mL）,3、样品测定：

取2只试管编号，按下表加入试剂：

迅速混匀，2025（或室温下）放置30min，用分光光度计，在波长500nm下，以“0”号管调零，测定各管吸光度六、结果处理根据测定管吸光度，在标准曲线上查出对应的标准蛋白质的浓度，再乘以稀释倍数，即为每克鲜果蔬中蛋白质的微克数。

注意事项：

1、Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，在加入到碱性的铜离子-蛋白质溶液中时（pH约10），必须立即混匀，以便在磷钼酸、磷钨酸试剂破坏之前，即发生还原反应。

2、本法受多种因素干扰，凡对双缩脲反应起干扰作用的基团以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲液均可干扰Folin-酚反应。

3、所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸也会干扰Folin-酚反应。

在测试时应排除干扰因素或作空白试验。

浓度较低的尿素、胍、三氯乙酸、乙醚等（各0.5%左右）、硫酸钠、硝酸钠（各1%）、乙醇（5%）等溶液对显色无影响。

但含量高时，必须做校正曲线。

含硫酸铵的溶液只需加浓碳酸钠-氢氧化钠溶液即可。

若样品酸度很高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度12倍。

另外此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。