生物工程下游技术思考题答案.docx

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生物工程下游技术思考题答案

一．绪论

1、从某一动物培养的细胞中分离某一抗体（一蛋白的代表）的一般工艺过程。

答：

生物工程下游技术的一般工艺过程（p12）

2、分离纯化某一酶制剂的主要步骤和结果如下表：

分离步骤

分离体积/ml

总蛋白含量/mg

总活力单位/IU

离心分离

1400

10，000

100，000

硫酸铵盐析和透析

280

3000

96，000

离子交换层析

90

400

80，000

亲和层析

6

3

45，000

（1）根据上述结果，计算第2~4步骤中，每步的比活力和纯化倍数。

（2）亲和层析的原理是什么？

3、产品的分离提取工艺应考虑那些因素？

答：

生物分离过纯化过程的选择准则（P16）

①步聚少，成本低②次序合理③产品规格（注射，非注射）④生产规模⑤物料组成⑥产品形式固体：

适当结晶，液体：

适当浓缩⑦产品稳定性⑧物性溶解度，分子电荷，分子大小，功能团，稳定性，挥发性⑨危害性⑩废水处理

第二章发酵液预处理

1．沉降速度离心的原理。

（p15）

答：

沉降速度法：

主要用于分离沉降系数不同的物质。

2．沉降平衡离心的原理。

（p15）

答：

沉降平衡法：

用于分离密度不同的物质。

如梯度密度离心。

3．差速离心的概念。

（p15）

答：

采用不同的转速将沉降系数不同的物质分开的方法。

4．rpm与RCF的换算关系。

5.已知某一离心机的转子半径为25cm，转速为1200r/min，计算相对离心力为多大？

第三章细胞破碎

1除去发酵液杂蛋白质的常用方法有那些？

答：

杂蛋白质的除去（p6）

（1）沉淀法：

蛋白质是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子（三氯乙酸盐、水扬酸盐）形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子（Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等）形成沉淀。

（2）变性法：

使蛋白质变性的方法很多，如：

加热，调节pH，有机溶剂，表面活性剂等。

其中最常用的是加热法。

（3）吸附法：

加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。

2产品的分离提取工艺应考虑那些因素？

答：

（1）是胞内产物还是胞外产物；

（2）原料中产物和主要杂质浓度；

（3）产物和主要杂质的物理化学特性及差异；

（4）产品用途和质量标准；

（5）产品的市场价格；

（6）废液的处理方法等。

3发酵液过滤与分离的困难的原因及解决方法。

答：

第一节发酵液过滤特性的改变

微生物发酵液的特性可归纳为：

（P3）

①发酵产物浓度较低，大多为1％一10％，悬浮液中大部分是水；

②悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；

③固体粒子可压缩性大；

④液相粘度大，大多为非牛顿型流体；

⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。

这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。

改善发酵液过滤特性的物理化学方法（P4）

一、降低液体粘度：

加水稀释法和加热法

二、调整pH：

等电点沉淀法

三、凝聚与絮凝：

可是悬浮颗粒间连接而体积增大，便于去除

四、加入助滤剂：

助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。

如：

硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等。

五、加入反应剂：

不影响目的产物，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，提高过滤速率。

4、论述利用离心法和过滤法进行固液分离的原理、常用设备及优缺点。

答：

一、离心分离（P8）

原理：

利用转鼓高速转动所产生的离心力，来实现悬浮液、乳浊液的分离或浓缩。

优点：

分离速率快、分离效率高、液相澄清度好等。

缺点：

设备投资高、能耗大。

此外，连续排料时，固相干度不如过滤设备。

种类：

多，按其作用原理不同，可分为过滤式离心机和沉降式离心机两大类。

1．瓶式离心机：

常用于微生物菌体、蛋白质的分离等。

2．多室离心机：

常用于抗菌素液―液萃取分离、果汁和酒类饮料的澄清等。

3．碟片式离心机：

左侧：

液-固分离右侧：

液-液-固分离

二、过滤

原理：

目的：

悬浮液———过滤介质——分离。

分为两种：

澄清过滤：

过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭等，填充于过滤器内即构成过滤层；也有用烧结陶瓷、烧结金属、粘合塑料及用金属丝绕成的管子等组成的成型颗粒滤层。

滤饼过滤：

过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布;毡、石棉板、玻璃纤维纸、合成纤维等无纺布。

滤饼过滤按推动力的不同可以分为四种，即重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤。

1．板框过滤机2过滤式离心机甩干式离心机（a）分批立式轴；（（c）连续锥型滤网

5、影响细胞壁破碎难易程度的主要因素。

答：

6、发酵液预处理的目的是浓缩目标产物是否正确，为什么？

（p2）

答：

目的：

分离不溶物（菌体、悬浮颗粒），除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质。

第四章萃取法

第五章沉淀法和吸附法

第六章、膜分离过程

本章知识体系

液膜的概念

★液膜的膜相组成

乳化液膜的制备

★乳化液膜的分离机制

乳化液膜分离技术的工艺流程

★乳化液膜技术的应用

1-8章习题

名词解释：

凝聚：

沉淀：

膜：

两相之间的不连续区间。

是指分隔两相界面并以特定的形式限制和传递各种化学物质。

它可以是均相的或非均相的，对称型的或非对称型的，中性的或荷电性的，固体的或液体的。

表面扩散：

絮凝：

浸取：

选择：

1.生物工业下游技术是指C。

A“物质分离”B“产品加工”C“物质分离”和“产品加工”

2.在过滤分离中，滤液通过滤饼的速率与其黏度成。

A正比B反比C无关

微生物代谢产物大多。

A分泌到细胞外B存在于细胞内

判断：

分离是混合的逆过程，是一个熵增加的过程，是一个自发的过程。

絮凝剂须有长链的线性结构，越长越好。

多级逆流萃取的特点是：

萃取剂消耗少，产物收率高，萃取较完全。

高浓度的中性盐能破坏蛋白质、酶等的胶体性质，防止蛋白质等发生沉淀或絮凝现象。

分离过程，是一个墒增加的过程，不能自发进行，需要作功才能实现。

有机溶剂能分解细胞壁中的多聚糖。

通量和压力成正比，和粘度成反比。

简答：

微生物发酵液有那些特性？

影响吸附作用的因素有那些？

1、吸附剂的性质；（容量大、速度快、机械强度高）

2、吸附物的性质；（极性宜从非极性中吸附极性物）

3、溶液pH的影响；（非极性宜从酸性中吸附有机酸）

4、温度的影响；（吸附热越大，受温度影响越大）

5、溶液中其他溶质的影响。

（一般使吸附量下降）

与目的产物混合的杂质主要包括那些成分？

答：

1.副产物；2.剩余的原料3.生产过程中加入的化学试剂；4.生产设备材料物质。

乳化液膜的优点？

溶解过程的能量变化分那三个过程？

柠檬酸钙盐沉淀提取法的化学反应式

论述：

影响蛋白质立体构象的环境因素？

一个良好萃取溶剂要满足的要求？

论述反渗透、超滤、微孔过滤、纳米过滤的特点？

外加压力差大于渗透压，就会发生溶剂倒流，高浓度溶液进一步浓缩，反渗透。

使不溶物浓缩过滤的操作为微过滤；分离溶液中微粒和大分子的膜分离操作为超滤；从溶液中分离出溶剂的膜分离操作为反渗透。

第七章电泳技术

1名词解释

电泳：

带电粒子，在一定电场强度下移动的现象——电泳。

电渗：

在电场的影响下，带电荷的液体对携带相反电荷的固定介质进行相对运动的现象。

/指在电场作用下液体（通常是水）相对于和它接触的固定的固体相作相对运动的现象（XX）

免疫电泳：

免疫电泳（immune electrophoresis）是将琼脂电泳和双向琼脂扩散结合起来，用于分析抗原组成的一种定性方法。

（XX）

迁移率：

单位电场强度下的泳动速度。

不连续凝胶电泳：

在一个凝胶电泳系统中不同部位的pH、离子强度、缓冲液成分或凝胶孔隙大小不同的凝胶电泳。

其目的在于提高电泳分离的范围和分辨率。

（XX）

2影响泳动度的主要因素有哪些？

答：

影响迁移率的因素

（1）样品a.电荷b．大小c.形状

（2）电场a．电流b．电压c.电阻（3）缓冲液成分浓度pH（4）支持介质（5）其它

3一个质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳上跑电泳时结果应为几条带？

阐述原因。

答：

4如何制备聚丙烯酰胺凝胶？

答：

5不连续电泳样品压缩成层原理。

答：

6SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

答：

十二烷基硫酸钠（SDS），是解离剂，蛋白质分子变性（解离）电泳结果是其亚单位

SDS的作用*：

一、使蛋白质解离成亚基；

二、电荷屏蔽作用，消除电荷对迁移率的影响；

三、消除了形状的影响：

结合SDS后蛋白变成短棒状，不同蛋白短轴一样，长轴不同，只与分子量有关。

7采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？

如何测定蛋白质等电点？

答：

分子量测定SDS-PAGE

测定蛋白质等电点：

等电聚焦电泳（IEF）

8．聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基本原理及缓冲液的选择方法。

答：

一、原理

单体：

丙烯酰胺（Acr），聚合成链状物

双体：

甲叉双丙烯酰胺（Bis）（交联剂）交联成网状

催化剂：

过硫酸铵（Ap）——化学催化；

光照下，核黄素也能催化称光催化。

加速剂：

N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）

二、缓冲体系的选择

•在选择缓冲系统时可主要从下列三方面来考虑：

pH范围、离子种类和离子强度。

•选择的pH值偏离蛋白质的等电点。

9．何为连续体系与不连续体系？

•答：

连续体系

指电泳槽中缓冲系统的pH、离子浓度与凝胶中的相同或整个胶面的孔径大小相同。

•不连续体系

指槽中与凝胶中的缓冲系统pH值、离子浓度是不同或整个胶面的孔径大小不同。

•不连续系统可将样品浓缩成极薄的带从而提高分辨率。

10．琼脂糖凝胶电泳在核酸分析中的作用？

答：

主要用于分离、鉴定、纯化DNA片段，用溴乙锭（简称EB）染色。

12．何为免疫电泳？

答：

将琼脂（或琼脂糖）作支持介质的区带电泳和专一性免疫沉淀反应相结合的免疫化学方法称为凝胶免疫电泳。

12．等电聚焦的原理。

答：

在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上。

13．电泳染色的方法有哪些？

答：

1．氨基黑/2．考马斯亮蓝R－250/3、考马斯亮蓝G－250/4．荧光染色法/

5、银染色法/6、酶活性染色法/7、专一性与配体结合检测法8、用荧光标记的抗体检测

14．如何鉴定出来我们提取出的酶是否有活性，举例说明。

答：

15．核酸分离鉴定有哪些方法？

答：

16．要配制聚丙烯酰胺凝胶T为30％，C为6.7％50ml，需丙烯酰胺多少g，甲叉双丙烯酰胺多少g？

答：

17.样品缓冲液中为何加入溴酚蓝和甘油（或蔗糖）？

答：

溴酚蓝：

前沿指示剂

甘油和蔗糖：

增加黏度，防止扩散，便于样品在加样孔中沉积

第八章层析技术

1.凝胶过滤层析技术的原理。

（P5）

答：

一、原理

被分离物流经凝胶层析柱时，进行着两种不同的运动：

垂直向下的移动和无定向的扩散运动。

分离原理：

它主要根据分子大小不同来分离蛋白质及测定其分子量。

2．离子交换层析的原理及缓冲液如何选择？

（P25）

答：

分离原理：

根据被分离物带电性不同来分离的。

层析缓冲液的选择：

（P34）

缓冲液的种类和pH大小，决定于在此缓冲液的情况下待分离组分的稳定性和溶解度。

阴离子交换剂，选阳离子型缓冲液（Tris胺盐、吡啶）

阳离子交换剂时，选阴离子型缓冲液（磷酸、醋酸）

根据交换剂上交换基团的pK值确定所用pH

（回忆等电点的概念回答）

用阴离子交换剂时，pH

用阳离子交换剂时，pH>pK，带负电

同时保证被分离组分不失活，有足够大的溶解度

缓冲液绝不能干扰洗脱液的测定。

在用紫外吸收法测定蛋白质时，不能使用带苯环的缓冲离子；

在215m～225nm范围内测定肽键含量时，则不能用含有羧基的缓冲液。

离子强度增加洗脱：

缓冲液的浓度尽可能不提高的情况下洗脱，可加入非缓冲盐如NaCl、KCl等。

尽可能不用pH梯度，

改变pH蛋白质易变性

同时也会降低溶液的缓冲能力。

3.亲和层析的原理。

（P41）

答：

通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。

被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。

4．吸附层析的原理。

（P38）

答：

吸附是表面的一个重要性质之一。

任何两个相都可以形成表面。

其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在其表面密集现象称为吸附。

能够将其它物质聚集在自己表面上的物质，都称为吸附剂；

吸附过程和脱附过程可同时进行（可逆的）

同一吸附剂对不同物质吸附力不同，对同一物质的吸附力也会因条件的改变而改变。

5．用分子筛法测定分子量与SDS－PAGE测定分子量在原理和方法上有何不同？

答：

凝胶过滤层析法、SDS－PAGE法

6．以含有肽聚糖为载体的填料分离溶菌酶属还是吸附层析，理由何在？

答：

亲和层析

7．凝胶过滤层析分离蛋白质时的洗脱行为可用什么来表示？

是如何表示的，范围一般在多少？

答：

分配系数，（实验）

8．凝胶过滤层析的分辨率如何表示？

要想使几个组分分开，分辨率应为多少？

答：

（实验）

9、以含有OligodT为载体的填料分离mRNA属什么层析技术，理由何在？

答：

亲和层析，mRNA

10、以羟基磷灰石为填料分离DNA属什么层析技术，试说明其原理？

思考与讨论

哪些因素会影响层析的效果？

答：

第九章核酸的分离纯化与检测技术

1．核酸含量测定有哪些方法?

答：

一、紫外光吸收法二、定磷法三、定糖法

2.核酸提取的注意事项有哪些？

答：

RNA的提取注意事项

⏹1．溶液的处理

⏹二乙基焦碳酸（DEPC）处理，

⏹但含Tris的溶液不用DEPC处理

⏹2．玻璃和塑料器皿的处理

⏹玻璃器皿可在300℃烘烤4小时，

⏹塑料制品可用氯仿冲洗，

⏹不耐氯仿的可用0.2%的DEPC溶液浸泡然后高压，

⏹不耐高压的需用DEPC处理过的水反复冲洗。

3．进行RNA操作时必须戴手套，因为手上有极丰富的RNA酶。

第三节核酸提取中的注意事项

一、低温操作，防止核酸酶降解核酸.

二、加入EDTA螯合金属离子，防止核酸酶降解核酸.

三、组织DNA提取时，为了防止一些色素有机酸的干扰，可加入高氯酸、乙醇除去。

四、防止核酸酶的降解（主要指植物中DNA酶对DNA的降解），提取时加入柠檬酸盐。

五、防止DNA被打断，加入冰乙醇要缓慢加入。

3．DNA的浓缩有哪些方法？

答：

4、在DNA提取中加入氯仿、苯酚、SDS和乙醇等试剂，说明其作用。

答：

SDS:

蛋白质的变性剂。

/酚：

使蛋白质变性，使变性的蛋白质溶在其中。

/氯仿：

蛋白质变性剂，可去除脂质，并且能促进两相分离。

/乙醇：

核酸在乙醇溶液中溶解度很低，乙醇有沉淀核酸的作用。

5、如何证明DNA中含有杂质RNA?

答：

6、如何证明RNA中含有DNA杂质？

答：

电泳

第十章蛋白质的分离与测定技术

1、蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法？

答：

溶解度不同：

如盐析、有机溶剂分级沉淀法

⏹分配系数不同：

如分配层析法

⏹吸附性不同：

如吸附层析法

⏹在电场中运动速度不同：

如电泳法

⏹沉降系数或密度不同：

如离心法

⏹分子量不同：

如凝胶过滤层析法、SDS－PAGE法

⏹生物学特性不同：

如亲和层析法

⏹以上提取纯化方法的适当结合，在多数情况下，足以获得纯化的蛋白质。

2、蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项。

⏹答：

（1）材料的选择和预处理；

⏹

（2）破碎生物组织（原料是细胞外分泌物时无需此步），并用适当的缓冲液将蛋白质提取出来；

⏹⑶用离心法将细胞的亚细胞颗粒及细胞碎片与溶液分开；

⏹（4）应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来；

⏹（5）进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开；

⏹（6）结晶或制成冻干粉。

3、举例说明沉淀分离蛋白质的方法。

答：

盐析法有机溶剂法

4、蛋白质含量测定的方法有哪几种?

原理如何?

答：

一、双缩脲法

原理:

是铜离子与蛋白质的肽键结合，形成紫红色络合物，此物质在540nm处有最大吸收，可以比色测定，

二、Folin—酚试剂法（Lowry法）

原理:

在碱性条件下，蛋白质与碱性铜溶液中的铜络合使得肽键伸展，暴露出的酪氨酸和色氨酸与磷钼钨酸反应，产生深蓝色,500nm处比色

三、紫外吸收法测定蛋白质含量

是利用物质在紫外光区（200～400nm）特有的吸收光谱

⏹1.280nm紫外吸收法/2．280nm和260nm处的吸收差法/3．215nm和225nm的吸收差法

四、考马斯亮蓝染色法（Brodford法）

蛋白质通过范德华键与染料考马斯亮蓝G—250结合，引起染料最大吸收峰的改变（颜色由棕红色变为蓝色），从465nm变为595nm处的光吸收值增加，即可进行定量。

五、凯氏定氮法

被测样品与浓硫酸共热时分解产生氨，氨和硫酸结合生成硫酸铵。

硫酸铵在强碱作用下分解产生氨。

用水蒸气蒸馏法将氨收集于过量的硼酸中，然后用标准酸溶液滴定。

根据所测得的含氮量，利用蛋白质中氮的含量约为6.25％，计算样品的蛋白质含量。

5、蛋白质纯度鉴定的方法有哪几种？

⏹答：

一、电泳法/二、通过层析性质的检测/三、免疫化学法/四、蛋白质化学结构分析法/

6、蛋白质结晶的方法有哪几种？

●答：

盐析法

●有机溶剂法

●等电点结晶

●温差结晶

●脱盐结晶

●金属离子

7、蛋白质干燥的方法有哪几种？

•答：

常压吸收干燥/冷冻干燥/真空干燥/喷雾干燥/滚筒干燥/红外线干燥/微波干燥/高压静电干燥

8、某学生分离提取得到某一个酶，测定其活性发现没有活性，分析其可能原因。

答：

9、向一蛋白质溶液中加入有机溶剂，该蛋白沉淀下来，该蛋白的活性是否受到影响？

为什么？

答：

10、一个蛋白质的提取物，SDS-PAGE后发现有多条带，试分析可能原因。

答：

11、欲使1L溶液的硫酸铵饱和度从20％升到75％，需加入饱和硫酸铵多少？

答：

12.某一蛋白经SDS-PAGE后在标准蛋白的13000～36000D间出现了一条带，加入巯基乙醇和碘乙酸处理后，发现SDS-PAGE后仍然为一条带，且带的位置在13100D处，试推断一下该蛋白的可能结构。

（碘乙酸可以结合在巯基上）

答：

13.叙述从培养的细胞中提取纯化目的蛋白的基本程序。

⏹答：

（1）材料的选择和预处理；

⏹

（2）破碎生物组织（原料是细胞外分泌物时无需此步），并用适当的缓冲液将蛋白质提取出来；

⏹⑶用离心法将细胞的亚细胞颗粒及细胞碎片与溶液分开；

⏹（4）应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来；

⏹（5）进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开；

⏹（6）结晶或制成冻干粉。