高效液相色谱法精华总结.docx
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高效液相色谱法精华总结
高效液相色谱法的进展
在所有色谱技术中，液相色谱法（liquidchromatography，LC）是最先（1903年）发明的，但其初期进展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。
到了20世纪60年代后期，将已经进展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱取得了迅速的进展。
专门是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改良，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。
具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。
从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。
气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳固的有机化合物，而HPLC那么适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳固性差的物质。
此刻，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。
高效液相色谱的类型
广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相色谱法。
只是通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。
通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分派色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。
其实，有些液相色谱方式并非能简单地归于这四类。
表8-1列举了一些液相色谱方式。
按分离机理，有的相同或部份重叠。
但这些方式或是在应用对象上有独特的地方，或是在分离进程上有所不同，通常被给予了比较固定的名称。
液相色谱仪流程图
此刻的液相色谱仪一样都做成一个个单元组件，然后依照分析要求将各所需单元组件组合起来。
最大体的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。
另外，还可依照需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反映系统和全自动操纵系统等。
图8-1是具有大体配置的液相色谱仪的流程图。
液相色谱仪的工作进程：
输液泵将流动相以稳固的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中的分派系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处置或保留。
输液泵
高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳固的流速或压力输送到色谱系统。
关于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先通过脱气装置再输送到色谱柱。
输液泵的稳固性直接关系到分析结果的重复性和准确性。
1.对输液泵的大体要求
流量准确可调。
关于一样的分析工作而言，流动相的流速在min，输液泵的最大流量一样为5-10mL/min。
输液泵的流量操纵精度通常要求小于±%。
输液泵必需能精准地调剂流动相流量，这能够通过电子线路调剂电机转速或冲程长短来实现。
流量的测定通常采纳热脉冲流量计。
耐高压。
高效液相色谱柱是将很细颗粒（3-10粒径）的填料，在高压下填充到柱管中的，为了保证流动相以足够大的流速通过色谱柱，需要足够高的柱前压。
通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。
液流稳固。
输液泵输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器。
泵的死体积小。
为了快速改换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于。
泵的结构材料应耐化学侵蚀。
2.输液泵
输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。
对液相色谱分析来讲，输液泵的流量稳固性更为重要，这是因为流速的转变会引发溶质的保留值的转变，而保留值是色谱定性的要紧依据之一。
因此，恒流泵的应用更普遍。
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。
机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。
几种输液泵的大体性能总结于表8-2。
（1）活塞型往复泵
活塞型往复泵是液相色谱仪中利用最普遍的一种恒流泵。
单活塞往复泵：
如图8-2所示，在活塞柱的一端有一偏心轮，偏心轮连在电动机上，电动机带动偏心轮转动时，活塞柱那么随之左右移动。
在活塞的另一端有上下两个单向阀，各有1-2个蓝宝石或陶瓷球，由其起阀门的作用。
下面的单向阀与流动相连通，为活塞的溶液入口；上面的单向阀与色谱柱相连，为活塞的溶液出口。
活塞柱与活塞缸壁之间是由耐侵蚀材料制造的活塞垫，以防漏液。
活塞向外移动时，出口单向阀关闭，入口单向阀打开，溶液（流动相）抽入活塞缸。
活塞向里移动时，入口单向阀关闭，出口单向阀打开，流动相被压出活塞缸，流向色谱柱。
这种单纯往复式单活塞泵构造简单、价钱廉价。
活塞的移动距离是可变的，流量由活塞的移动距离所决定。
因为偏心轮一样每分钟转50-60次，也确实是流动相的抽入和吐出以每分钟50-60次的频率周期性转变，因此，产生的脉冲很显著。
减缓脉冲的方法确实是在泵出口与色谱柱入口之间安装一个脉冲阻尼器。
脉冲阻尼器的种类很多，但其一起特点是具有必然的容积和弹性。
最多见和最简单的脉冲阻尼器是将内径的不锈钢管绕成弹簧状，利用其绕性来阻滞压力和流量的波动，起到必然的缓冲作用。
为了减小谱带展宽，也为了便于清洗和改换流动相，阻尼器的体积应尽可能小。
演示动画
双活塞往复泵：
如图8-3（a）所示，双活塞往复泵有一个精心设计的偏心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮，偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。
偏心凸轮短半径端所对应的活塞向外伸，使该活塞的下单向阀打开吸入流动相，与此同时，偏心凸轮的长半径端所对应的另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送至色谱柱。
于是，两活塞交替伸缩，往复运动，取得的排液特性如图8-3（b）所示，即具有稳固的输出流量，如此就能够幸免单活塞泵液流脉冲的问题。
双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多。
其优势是没必要利用排除脉冲的阻尼器，幸免了阻尼器的压力消耗，但缺点是设备本钱较高，流量调剂也比单活塞泵复杂。
（2）隔膜型往复泵
隔膜型往复泵也是一种恒流泵，其结构如图8-4所示。
一块隔膜将泵缸分为两部份，一部份充满了油，另一部份充满了流动相。
活塞与油接触，当活塞往复运动时，隔膜受到油压的作用，对流动相部份产生"吸引"或"推压"，使流动相部份的单向阀吸液或排液，从而取得稳固的液流。
通过调剂泵活塞的冲程即可进行流量调剂。
隔膜泵的活塞不直接与流动相接触，故不存在活塞密封垫磨损对流动相的污染。
隔膜泵的死体积小（约），因此，改换流动相后平稳快，有利于梯度洗脱。
隔膜泵的缺点是结构比较复杂，价钱较贵，和单活塞机械往复泵一样，也产生脉冲，也需要配置阻尼装置来排除脉冲。
脱气装置
1.什么缘故要脱气
流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。
气泡进入检测器后会在色谱图上显现尖锐的噪音峰。
小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或显现流速不稳固，致使基线起伏。
气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡那么很费时刻。
在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。
溶解气体还可能引发某些样品的氧化或使溶液pH值发生转变。
2.脱气方式
目前，液相色谱流动相脱气利用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。
超声波振荡脱气：
将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。
这种方式比较简便，又大体上能知足日常分析操作的要求，因此，目前仍普遍采纳。
惰性气体鼓泡吹扫脱气：
将气源（钢瓶）中的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检测无阻碍。
真空脱气装置：
将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。
图8-5是单流路真空脱气装置的原理图。
一样的真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。
梯度洗脱装置
1.什么缘故要进行梯度洗脱？
在进行多成份的复杂样品的分离时，常常会碰着前面的一些成份分离不完全，而后面的一些成份分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。
为了使保留值相差专门大的多种成份在合理的时刻内全数洗脱并达到彼此分离，往往要用到梯度洗脱技术。
2.梯度洗脱操作
在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度成效不大，而且还会带来一些不利阻碍，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离进程中改变流动相的组成或浓度。
线性梯度 阶梯梯度 高压梯度 低压梯度
线性梯度：
在某一段时刻内持续而均匀增加流动相强度。
阶梯梯度：
直接从某一低强度的流动相改变成另一较高强度的流动相。
梯度洗脱时，流动相的输送确实是要将几种组成的溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置确实是解决溶液的混合问题，其要紧部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序操纵器。
依照溶液混合的方式能够将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。
高压梯度：
一样只用于二元梯度，即用两个高压泵别离按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵以后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的，其装置结构如图8-6所示。
高压梯度系统的要紧优势是，只要通过梯度程序操纵器操纵每台泵的输出，就能够取得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化操纵。
其要紧缺点是利用了两台高压输液泵，使仪器价钱变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。
低压梯度：
只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相较，确实是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。
因为比例阀是在泵之前，因此是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，因此低压梯度通常配置在线脱气装置，图8-7是四元梯度系统的结构示用意。
来自于四种溶液瓶的四根输液管别离与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。
多元梯度泵的流路能够部份空置。
进样器
进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式。
进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引发色谱系统的压力和流量波动要很小。
此刻的液相色谱仪所采纳的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器，其原理与气相色谱中所介绍的相同。
色谱柱
1.色谱柱的组成
色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳固。
柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和利用条件有关。
色谱填料：
通过制备处置后，用于填充色谱柱的物质颗粒，一般是5-10粒径的球形颗粒。
色谱柱管：
内部抛光的不锈钢管。
典型的液相色谱分析柱尺寸是内径，长250mm。
色谱柱：
也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所组成的,其结构如图8-8所示。
2.色谱柱的填充
干法填充：
在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直台面墩10-20次。
湿法填充：
又称淤浆填充法，利用专门的填充装置（图8-9）。
3.填料的结构
色谱填料是由基质和功能层两部份组成。
基质：
又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有必然的刚性，能经受必然的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。
经常使用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。
功能层：
是通过化学或物理的方式固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。
如图8-10是硅胶基质的冠醚大分子固定相的结构示用意，功能层冠醚分子吸附或键合在硅胶基质的表面。
填料的物理结构：
分为微孔型（或凝胶型）、大孔型（全多孔型）、薄壳型和表面多孔型四种类型，如图8-11所示。
数据处置系统与自动操纵单元
数据处置系统：
又称色谱工作站。
它可对分析全进程（分析条件、仪器状态、分析状态）进行在线显示，自动搜集、处置和贮存分析数据。
一些配置了积分仪或记录仪的老型号液相色谱仪在很多实验室还在利用，但最近几年新购买的色谱仪，一样都带有数据处置系统，利用起来超级方便。
自动操纵单元：
将各部件与操纵单元连接起来，在运算机上通过色谱软件将指令传给操纵单元，对整个分析实现自动操纵，从而使整个分析进程全自动化。
也有的色谱仪没有设计专门的操纵单元，而是每一个单元别离通过操纵部件与运算机相连，通过运算机别离操纵仪器的各部份。
液相色谱分离模式
吸附色谱（adsorptionchromatography）
原理：
基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。
固定相：
固定相一般是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，因此吸附色谱也称液固吸附色谱。
活性硅胶最经常使用。
活性硅胶：
一种多孔性物质,因-O-Si（-O-）-O-Si（-O-）-O-结合而具有三维结构,表面具有硅羟基,作吸附剂的硅胶需经加热处置,除掉其表面吸附水,使之活化。
按其孔径散布分为表面多孔和全多孔两类。
硅胶既是吸附色谱最经常使用的固定相，也是分派色谱、离子色谱等色谱固定相的经常使用基质。
流动相：
弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等等。
分离进程：
硅羟基呈微酸性，易与氢结合，是吸附的活性点。
流动相溶剂在吸附剂表面形成单分子或双分子吸附层，当样品分子进入色谱柱，样品要紧靠氢键结合力吸附到硅羟基上，与流动相分子竞争吸附点。
样品分子反复地被吸附，又反复地被流动相分子顶替解吸，随着流动相的流动而在柱中向前移动。
因为不同的样品分子在固定相表面的吸附能力不同，因此吸附-解吸的速度不同，各组分被洗脱的时刻（保留时刻）也就不同，使得各组分彼此分离。
应用：
吸附色谱在初期的HPLC中应用得最多，此刻，很多以前用吸附色谱分离的物质被更方便和更有效的化学键合相反相分派色谱所代替。
由于硅羟基活性点在硅胶表面常按必然几何规律排列，因此吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方式。
如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。
分派色谱（partitionchromatography）
原理：
要紧基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分派作用）而实现分离的液相色谱分离模式。
键合固定相：
分派色谱本来是基于样品分子在包覆于惰性载体（基质）上的固定相液体和流动相液体之间的分派平稳的色谱方式，因此也称液-液分派色谱。
因为作固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，因此重现性很差，不大为人们所采纳。
后来进展起来的键合固定相以化学键合的方式将功能分子结合到惰性载体上，固定相就可不能溶解到流动相中去了。
这种化学键合型固定相是现今HPLC最经常使用的固定相，大约占HPLC固定相的四分之三。
极性键合固定相：
键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。
非极性键合固定相：
键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。
如最经常使用的ODS（OctaDecyltrichloroSilane）柱或C18柱确实是最典型的代表，它是将十八烷基三氯硅烷通过化学反映与硅胶表面的硅羟基结合，在硅胶表面形成化学键合态的十八烷基，其极性很小。
正相HPLC（normalphaseHPLC）：
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。
其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。
吸附色谱也属正相HPLC，初期的液相色谱中曾普遍采纳这种体系。
关于一些在非极性疏水固定相中强烈保留的有机分子常常采纳正相HPLC模式。
反相HPLC（reversedphaseHPLC）：
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。
其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。
是现今液相色谱的最要紧分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。
凝胶色谱（gelchromatography）
原理：
以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的阻碍而达到分离的一种液相色谱分离模式。
样品分子与固定相之间不存在彼此作使劲（吸附、分派和离子互换等），因此凝胶色谱又常被称作体积排斥色谱、空间排阻色谱、分子筛色谱等。
比固定相孔径大的溶质分子不能进入孔内，迅速流超卓谱柱，不能被分离。
比固定相孔径小的分子才能进入孔内而产生保留，溶质分子体积越小，进入固定相孔内的机率越大，于是在固定相中停留（保留）的时刻也就越长（图8-12）。
固定相：
化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。
流动相：
在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了操纵分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。
凝胶过滤色谱（gelfiltrationchromatography,GFC）：
以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。
要紧适合于水溶性高分子的分离。
凝胶渗透色谱（gelpermeationchromatography,GPC）：
以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。
要紧适合于脂溶性高分子的分离。
如甲苯和四氢呋喃能专门好地溶解合成高分子，因此GPC要紧用于合成高分子的分子量（散布）的测定。
离子色谱法（ionchromatography,IC）
1.离子互换色谱法（ionexchangechromatography,IEC）
2.离子排斥色谱法（ICE）
3.离子对色谱（ion-pairchromatography,IPC）
1.离子互换色谱法（ionexchangechromatography,IEC）
IEC利用的是低互换容量的离子互换剂，这种互换剂的表面有离子互换基团。
带负电荷的互换基团（如磺酸基和羧酸基）能够用于阳离子的分离，带正电荷的互换基团（如季胺盐）能够用于阴离子的分离。
图8-13是阴离子互换进程的示用意。
由于静电场彼此作用，样品阴离子和淋洗剂阴离子（也称淋洗离子）都与固定相中带正电荷的互换基团作用，样品离子不断地进入固定相，又不断地被淋洗离子互换而进入流动相，在两相中达到动态平稳，不同的样品阴离子与互换基的作使劲大小不同，电荷密度大的离子与互换基的作使劲大，在树脂中的保留时刻就长，于是不同的离子彼此分离。
2.离子排斥色谱法（ICE）
因为离子排斥色谱的英文也可写作ionchromatographyexclusion，因此用ICE作为其缩写即可与离子互换色谱的缩写IEC相区别。
ICE的分离机理是以树脂的Donnan排斥为基础的分派进程。
分离阴离子用强酸性高互换容量的阳离子互换树脂，分离阳离子用强碱性高互换容量的阴离子互换树脂。
下面以阴离子分离为例（如图8-14）说明离子排斥色谱的原理。
强电解质Cl-形成H+Cl-，因受排斥作用不能穿过半透膜进入树脂的微孔，迅速通过色谱柱而无保留。
而弱电解质CH3COOH能够穿过半透膜进入树脂微孔。
电解质的离解度越小，受排斥作用也越小，因此在树脂中的保留也就越大。
3.离子对色谱（ion-pairchromatography,IPC）
无机离子和离解很强的有机离子通常能够采纳离子互换色谱或离子排斥色谱进行分离。
有很多大分子或离解较弱的有机离子需要采纳通经常使用于中性有机化合物分离的反相（或正相）色谱。
但是，直接采纳正相或反相色谱又存在困难，因为大多数可离解的有机化合物在正相色谱的硅胶固定相上吸附太强，致使被测物质保留值太大、显现拖尾峰，有时乃至不能被洗脱。
在反相色谱的非极性（或弱极性）固定相中的保留又过小。
在这种情形下，就可采纳离子对色谱。
离子对色谱也称离子彼此作用色谱，是在流动相中加入适当的具有与被测离子相反电荷的离子，即"离子对试剂"，使之与被测离子形成中性的离子对化合物，此离子对化合物在反相色谱柱上被保留。
保留的大小要紧取决于离子对化合物的解离平稳常数和离子对试剂的浓度。
离子对色谱也可采纳正相色谱的模式，即能够用硅胶柱，但不如反相色谱成效好，多数情形下采纳反相色谱模式，因此离子对色谱也常称反相离子对色谱。
液相色谱检测技术
检测器：
用来持续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量转变的装置。
检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有不同的原理，当溶质从色谱柱流出时，会致使流动相背景值发生转变，从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来。
几种要紧检测器的大体特性列于表8-3。
紫外-可见光（UV-VIS）检测器
原理：
基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。
很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很普遍的应用范围。
由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的转变不是很灵敏，因此还能用于梯度淋洗。
一样的液相色谱仪都配置有UV-VIS检测器。
用UV-VIS检测时，为了取得高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当捐躯灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。
二极管阵列检测器（diode-arraydetector,DAD）：
以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器（图8-15）。
它可组成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式同意器上的全数波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描搜集数据，取得的是时刻、光强度和波长的三维谱图。
与一般UV-VIS检测器不同的是，一般UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。
而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在同意器上被检测。
直接紫外检测：
所利用的流动相为在检测波长下无紫外吸收的溶剂，检测器直接测定被测组分的紫外吸收强度。
多数情形下采纳直接紫外检测。
间接紫外检测：
利用具有紫外吸收的溶液作流动相，间接检测无紫外吸收的组分。
在离子色谱中利用较多，如以具有紫外吸收的邻苯二甲酸氢钾溶液作阴离子分离的流动相，当无紫外吸收的无机阴离子被洗脱到流动相中时，会使流动相的紫外吸收减小。
柱后衍生化光度检测：
关于那些能够与显色剂反映生成有色配合物的组分（过渡金属离子、氨基酸等），能够在组分从色谱柱中洗脱出来以后与适合的显色剂反映，在可见光区检测生成的有色配合物。
示差折光检测器（differentialrefractometers,RI）
原理：
基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有不同，当组分洗脱出来时，会引发流动相折射率的转变，这种转变与样品组分的浓度成正比。
示差折光检测法也称折射指数检测法。
绝大多数物质的折射率与流动相都有不同，因此RI是一种通用的检测方式。
尽管其灵敏度比其他检测方式相较要低1-3个数量级。
关于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。
在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也常常利用。
RI检测器依照其设计原理可分为反射型（依照Fresnel定律）、折射型（依照Snell定律）和干与型三种类型。
荧光检测器（fluorescencedetector）
原理：
许多有机化合物，专门是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被必然强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。
荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。
有的有机化合物尽管本身不产生荧光，但能够与发荧光物质反映衍生化后检测
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