胡萝卜肉质根愈伤组织的诱导及继代增值培养实验报告.docx
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胡萝卜肉质根愈伤组织的诱导及继代增值培养实验报告
综合性实验报告
胡萝卜肉质根愈伤组织诱导
及继代增殖培养
一、实验原理及目的
（一）实验目的
1、通过MS培养基母液的配制和保存，掌握配制于保存培养基母液的基本技能。
2、通过MS固体培养基的配制，掌握培养基的制备基本技能。
3、学会和掌握诱导愈伤组织的基本技术。
4、初步掌握组织培养的无菌操作技术。
5、初步掌握外植体的消毒技术。
6、掌握组培室常用的化学试剂。
7、学会和掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。
（二）实验原理
1、配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。
2、在自然情况下，根主要为植物吸收和固定的重要器官，同时，有些植物的根亦具有繁殖的功能。
植物根生长快、代能力强、变异小，使得其在研究根的营养吸收、生长和代的变化规律、器官分化、形态建成规律等方面具有重大的理论与实践意义。
依据细胞全能性原理，即指任何具有完整细胞核的细胞（动物、植物等），都拥有形成一个完整个体所必需的全部遗传信息（DNA）。
就胡萝卜根来说，其肉质根细胞同样具有形成完整再生植株的能力。
这种由单个根衍生而来并经继代培养而保存的，在遗传上具有一致的根的培养物，称为离体根无性系。
利用这些离体根的无性系可以进行器官再生体系、苗木无性系快速繁殖和其他方面的实验研究。
3、愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。
它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官各种组织的活细胞。
在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木于接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木与接穗沟通。
在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。
其发生过程是：
外植体的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁细胞组织而形成愈伤组织。
愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。
诱导愈伤组织常用的生长素是2,4-D，IAA和NAA，常用的细胞分裂素是KT和6-BA。
愈伤组织形成的过程分为3个时期：
诱导期、分裂期和分化期（形成期），愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。
4、调节培养基的酸碱性至PH=5.8左右。
由于培养基的PH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都会对植物材料的生长有很大的影响。
此外，PH还影响到琼脂培养基的凝固情况。
所以，当培养基配制好后应立即进行PH的调整。
培养基若偏酸时用氢氧化钠（1mol/L）来调节，若过碱就用盐酸（1mol/L）来调节。
当PH值高于6.0时，培养基将会变硬；当PH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。
5、植物组织培养的优点：
①研究材料来源单一，无性系遗传背景一致；
②经济、方便、效率高；
③条件可控、误差小；
④生长快、周期短、重复性强；
⑤可全年试验或生长。
6、继代培养是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养枯竭，水分散失，并已经积累了一些代产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养。
实际上就是对来自于外植体所增殖的培养物（包括细胞、组织或其切段）通过更换新鲜培养基及不断切割或分立，进行连续多代的培养。
将诱导产生的芽、苗、愈伤组织、原球茎或胚状体等培养物重新分割，接种到新鲜培养基上进一步扩大培养的过程称为继代培养，也称为增殖培养。
该过程是植物组织培养中决定繁殖速度快慢、繁殖系数高低的关键阶段。
继代使用的培养基对于一种植物来说，每次几乎完全相同。
由于培养物在适宜的环境条件、充足的营养供应和生长调节剂作用下，排除了其他生物的竞争，繁殖速度大大加快。
二、实验所需仪器设备及其原理
（一）冰箱
用于长期贮存培养基母液、生化试剂及低温处理材料。
（二）培养箱
用于少量植物材料的培养。
有条件的话，还可采用全自动的调温、调湿人工气候箱来进行植物组织培养和试管苗快繁。
（三）超净工作台
超净工作台是为植物组织培养提供无菌操作环境，是最常用、最普及的无菌操作装置，和无菌室相比，超净工作台既方便又舒适，无菌效果又好。
超净工作台一般由鼓风机、过滤器、操作台、紫外灯和照明灯等部分组成。
它是将空气过滤后形成无菌的风，创造出一个无菌环境。
根据风幕形成的方式，超净工作台可分为水平式和垂直式两种。
在一般的植物组织培养中，两种都可以采用，而进行植物的遗传转化操作和农杆菌、大肠杆菌的接种时，最好采用垂直风幕式的超净工作台，这样可以避免细菌在空气中的扩散。
（四）高压蒸汽灭菌锅
高压蒸汽灭菌锅主要用于培养基、蒸馏水和各种器械的灭菌消毒。
高压灭菌锅有大型、中型和小型三种。
实验室最常用的是中型立式全自动灭菌锅和小型便携式美景，大型卧底式高压灭菌锅在大型工厂化植物组织培养上使用。
（五）天平
较常用的为普通天平（1/100g、1/10g），在微量元素、植物激素等的称量时，需要用分析天平（1/10000g）。
（六）蒸馏水制备装置
有蒸馏型和离子交换型两种。
需要时，还可以进行重蒸馏来获得纯度更高的蒸馏水。
三、培养基及其机制
（一）培养基
是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工培植的养料，一般含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。
（二）植物组织培养所用培养基——MS培养基
MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞设计的，其特点是：
无机盐和离子浓度高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而使用围较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
MS培养基是目前使用最普遍的培养基。
其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长，由于配方中的离子浓度较高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会打破离子间的平衡。
MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。
MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。
因此，一般情况下，不再用添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。
和其它培养基基本成分相比，MS培养基中的系哦啊酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。
1.配制MS母液培养基
（1）所需仪器
电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉、量筒、称量纸、PH试纸、冰箱
（2）所需药品
NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、KI、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Na2-EDTA·2H2O、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇（维生素B6）、盐酸硫胺素（维生素B1）、甘氨酸、蒸馏水.
①大量元素的配制（CaCl2·2H2O要在最后单独加入）
用量=放大倍数×体积×培养基中的浓度n=20v=1L
母液
化合物
规定量（mg/L）
扩大倍数（×20）
称取量（g）
培1L培养基所需母液（ml）
大量元素母液
KNO3
1900
38000
38
50
NH4NO3
1650
33000
33
MgSO4·7H2O
370
7400
7.4
KH2PO4
170
3400
3.4
CaCl2·2H2O
440
8800
8.8
依次称取，分别溶解，依次混合，定容，倒入母液瓶中，贴标签，放入4℃冰箱。
②微量元素的配制（Fe单独配制）
n=200v=1LMnSO4·4H2O:
22.3g或MnSO4·H2O：
16.9g
③铁盐母液配制
n=200配500ml
螯合态的铁，混合煮沸，PH=5.8~6.2（用NaOH溶液调其PH）
④有机物的配制（单一母液）
肌醇（10mg/ml配250ml）VB1（1mg/ml配250ml）
VB6（1mg/ml配250ml）烟酸（1mg/ml配250ml）
甘氨酸（2mg/ml配250ml）
⑤生长调节物配制
6-BA（1mg/ml配100ml）
2,4-D（1mg/ml配100ml）
NAA（1mg/ml配100ml）
注：
6-BA先用少量1mol/LHCl溶解，2,4-D和NAA先用少量mol/LnaOH或95﹪酒精溶解。
2.配制胡萝卜愈伤组织诱导培养基（MS固体培养基）
（1）配方：
MS基本培养基+2mg/LNAA+0.1mg/L6-BA+200mg/L水解酪蛋白+3﹪蔗糖+0.7﹪琼脂粉
即：
大量元素：
50ml微量元素：
5ml有机物成分：
5ml铁盐：
5ml
2mg/LNAA：
2mg（ml）0.1mg/L6-BA：
0.1mg（ml）200mg/L水解酪蛋白：
200mg
蔗糖：
30g琼脂：
7g
注：
由于配制减半，因此上述试剂均减半。
（2）要求：
每小组配制500ml，分装为20瓶，每瓶25ml。
（3）步骤：
①琼脂溶解（3.5g+350ml蒸馏水，加热煮沸2min以上）；
②把蔗糖加入琼脂溶液中（15g蔗糖）；
③把CH加入琼脂和蔗糖溶液中；
④依次量取MS培养基母液及所需生长调剂物质母液于烧杯中，最后加入到相应的容器中；
⑤PH调整为6.0~6.2，并定容到500ml；
⑥培养基分装、封口；
⑦灭菌（121℃1.1kg/cm2，15min）；
⑧保存。
3.继代培养基的配制
MS基本培养基+6-BA+NAA+2,4-D+C+CH
蔗糖15g；琼脂3g；大量元素2.5ml；微量元素2.5ml；铁盐0.5ml；肌醇5ml；VB10.5ml；
VB60.25ml；烟酸0.25ml；甘氨酸0.5ml；CH0.1g。
制500ml，分为22瓶，PH为5.8。
四、外植体消毒及无菌操作技术
（一）外植体消毒
在离体根培养中，首先芽解决外植体消毒问题，因为在自然条件下，根生长在土壤中，要进行彻底灭菌、消毒。
为了消灭这种污染源，在把植物组织接种到培养基上之前必须要进行彻底的表面消毒；部已受到真菌或细菌侵染的组织在组织培养研究中一般都淘汰不用。
胡萝卜的肉质根，其硬度较大，容易操作，可直接用灭菌剂进行处理。
①用自来水将胡萝卜冲洗干净，用解剖刀将其切成几个小段；
②用70﹪~75﹪的酒精浸泡胡萝卜2min；
③放入0.1﹪HgCl2中浸泡10min；
④用无菌水洗4次；
⑤备用：
为胡萝卜愈伤组织的诱导作准备。
（二）无菌操作技术
无菌操作技术室用于防止微生物进入实验室区的操作技术。
要求：
①在进行无菌操作前将界面上的细菌和病毒等微生物杀灭；
②操作过程中是界面与外界隔离，避免微生物的侵入。
目前，多数实验室都使用各种类型的超净工作台进行无菌操作。
步骤：
①在实验之前30min将超净工作台的紫外灯打开，进行灭菌。
工作人员要避免紫外灯的照射，做实验时将紫外灯关闭。
②用酒精喷壶或酒精棉将超净工作台进行消毒（酒精浓度为70﹪）。
③实验操作前，工作人员的手和小臂用70﹪的酒精消毒。
④使用的镊子、解剖刀等用90﹪的酒精浸泡，之后放在酒精灯上火烧灭菌，再放在灭菌支架上冷却后使用。
⑤在植入或移植材料的前后，培养瓶的瓶口需在酒精灯上火烧灭菌。
（三）实验操作的注意事项
1.进行胡萝卜愈伤组织诱导，首先要在无菌的滤纸上将已消毒的外植体的表面轻轻切去；
2.移入培养基时，打口，封口纸要小心摆正，不能乱丢乱放；
3.镊子用手拿住上端，不能去拿下端；
4.整个操作过程要尽量在超净工作台的无菌围进行；
5.禁止操作时正面大声讲话。
五、实验结果及讨论
（一）实验结果
1.胡萝卜肉质根愈伤组织诱导结果：
总接种瓶数
4
总接种块数
12
污染瓶数
1
污染块数
3
未污染瓶数
3
未污染块数
9
未污染块中愈伤组织发生块数
7
愈伤组织发生率
77﹪
2.胡萝卜愈伤组织继代增殖培养结果
这次试验总的接种瓶数为2瓶，无污染瓶；但是愈伤组织没有进行进一步的生长，增殖不是很好，呈现暗色。
（二）对试验结果的分析
1.胡萝卜肉质根愈伤组织的诱导
（1）其中一瓶接种瓶受污染，可能是由于在使用解剖刀切胡萝卜时，拿镊子的部位靠下后导致污染了细菌；也可能操作时没有在超净工作台的无菌围；也可能由于材料本身部已经收到了污染，或是在切离胡萝卜表面时，没有彻底将材料表面切干净，导致接种后受污染；也有可能所使用的工具消毒不够彻底，或是操作不规，如接种掀开培养瓶封口膜时手指碰到了封口膜里面，或是封口膜没有绑紧，导致了微生物的进入。
（2）已接种好的材料，愈伤组织发生不好的或是没有发生的。
可能是由于：
①在配制培养基时，缺乏某种物质或没有将培养基混合均匀；
②在分装培养基时，没有进行均匀倾倒；
③所使用材料没有将其表面切除，因其结构被HgCl2破坏而无法使组织材料愈伤组织化。
2.愈伤组织的继代增殖培养
（1）培养瓶没有被污染，但是愈伤组织仅在培养基上发育了一段时间后就终止其生长，其原因有：
①培养基的配制有问题，可能培养基配制时某类激素用量较少或无；
②接种时，切其愈伤组织时把本体胡萝卜切了进去。
（三）实验讨论
1.调节培养基PH时，理论上应调至5.8为宜，但因其培养基经高温高压灭菌后，蔗糖会分解，PH值会有所下降，因此PH值调至6.0可减小误差。
2.植物组织培养实验中，必须的前提是：
无菌操作，胡萝卜肉质根（外植体）经HgCl2和酒精消毒后，即认为是消毒干净，在此后的操作中，要注意对其用具彻底消毒，操作过程中动作要规实施。
3.废液进行回收处理，酒精、HgCl2浸泡完材料后，应统一倒入指定容器。
4.切胡萝卜时，下方要垫上无菌滤纸。
5.接种时，动作要轻，力度要适中，不要把接种的材料切块压入到培养基里面，以致破坏培养基；切块大小要适中，不宜太大，也不宜太小。
6.MS培养基的特点：
①无机盐浓度高；
②高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐；
③有一定数量的铵盐，营养丰富；
④不需要添加更多的有机附加物。
7.植物组织培养所需的环境条件：
与自然条件一样，组织培养中的材料的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养基的组成、PH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。
实验中要注意考虑这些条件的影响，并采取适当的措施控制好培养条件。
8.植物组织培养所需的营养成分：
植物体至少含有几十种化学元素，其部分元素在植物体的部起到了一定的生理作用：
①组成各种化合物，参与集体的建设，成为结构物质；
②构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新代；
③元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用；
④发育方面：
特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。
（四）实验总结
本次试验有成功之处，也有不足的地方。
成功是我经过此次试验，学到了很多关于植物组织培养的实际操作的知识容，并且这些东西，只有自己亲身尝试，才能体会明白。
植物组织培养实验，最重要的就是在无菌条件下对无菌的材料进行处理，因此，无菌操作技术是实验失败与否的关键；进行实验前期，我们要做好充分的准备，培养基的配制、材料的选用、植物组织培养理论知识，及操作的方法与步骤要进行预先准备，如果有一步骤出差错，尤其是培养基配制，即使后面的过程做得再好，结果也等于“0”。
实验的细节要把握好，才能取得实验的成功。
此次试验，让我深深体会到了严谨的科学态度的重要性。
实验失败是由于操作不当、培养基配制出错等原因造成的，我们在实验时必须按照步骤严格进行，否则再怎么努力，也是白做。
此次试验以小组为单位，我们分工合作，各自负责好自己分好的部分工作，合作也是实验要求的基本容，有了合作，才有了我们的成果，不管好与否，至少我们努力过。
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