有机类饮用水毒副产物毒理学研究方法进展.docx

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有机类饮用水毒副产物毒理学研究方法进展

有机类饮用水消毒副产物毒理学研究方法进展

杨帆，楚文海，张永吉，尹大强

同济大学环境科学与工程学院，长江水环境教育部重点实验室，上海200092

摘要：

基于国内外对有机类饮用水消毒副产物（DBPs）毒理学效应的研究成果，以及消毒技术的发展过程，系统划分了有机类DBPs的种类：

含碳消毒副产物（C-DBPs）和含氮消毒副产物（N-DBPs）。

并对一些典型DBPs的毒理学研究方法进行了归类总结，分析了相关研究的发展趋势和不足，并且对今后的研究方向提供了相关建议。

关键词：

饮用水；消毒副产物；毒理学

ResearchAdvanceofToxicologyResearchMethodsaboutOrganicDisinfectionBy-products（DBPs）inDrinkingWater

YangFan,ChuWenhai,ZhangYongji,YinDaqiang

CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,TongjiUniversity,KeyLaboratoryofYangtzeRiverWaterEnvironment,MinistryofEducation,Shanghai200092,China

Abstract:

Nitrogenousdisinfectionby-products（N-DBPs）haveincreasinglybecomeapublichealthconcerninthedrinkingwaterindustrybecausetheyhavebeenfoundtobemoregeno-andcytotoxicthanmostofthecurrentlyregulatedcarbonaceousDBPs（C-DBPs）.Inthisstudy,thetypeofDBPs,includingN-DBPsandC-DBPs,wasintroduced.Also,thetoxicologicalresearchmethodfortheseDBPswassummarized.Moreover,thedevelopmenttrendandcurrentshortageofthismethodwereanalyzed,andthecorrespondingrecommendationandcountermeasureproposed,whichwashopedtobehelpfulintheresearchofDBPstoxicology.

Keywords:

drinkingwater;disinfectionby-products（DBPs）;toxicology

1引言

对饮用水消毒副产物（disinfectionby-products,DBPs）的研究始于1974年，研究发现用氯作为消毒剂时，将会产生许多DBPs，研究较集中于三种含碳DBPs（C-DBPs），即挥发性三卤甲烷（Trihalomethanes,THMs），难挥发性卤乙酸（Haloaceticacids,HAAs）[1]以及其它一些C-DBPs如卤化醛酮等，其中以卤代呋喃酮（mutagenX,MX）最为典型[2]。

同时，毒理学家对于这些DBPs的毒性作用展开研究，结果表明THMs和HAAs在一定程度上都具有致畸、致癌和致突变的“三致”作用[3]，MX也有较强的致诱变性[4]。

近年来，随着替代消毒剂的单独或联合使用，以及相关研究的不断深入，在饮用水中又发现了越来越多的新兴DBPs，这些化合物以含氮消毒副产物（nitrogenousdisinfectionby-products,N-DBPs）为主。

如：

卤化硝基甲烷（Halonitromethanes,HNMs）[5]，卤化乙腈（Haloacetonitriles,HANs）[6]，卤化乙酰胺（Haloacetamides,HAcAms）[7]，N-亚硝胺类物质（N-nitrosamines,NMs）[8]，卤化氰（Cyanogenhalides,CNXs）[9]等。

随着饮用水消毒副产物种类的多样化，其生物毒性和健康风险也越来越受到人们的关注。

国内目前对DBPs生物毒性的研究起步较晚，并且在研究方法和内容上都有一定的局限性，而只有在明确DBPs的毒理学特征后，才能使学者在今后的相关研究中分清主次。

本文根据国内外的相关研究，对DBPs进行了归纳分类，讨论分析了几种典型DBPs的毒性研究所采用的毒理学研究方法，为进一步进行DBPs的毒理学特性研究提供借鉴和依据。

2饮用水消毒副产物

液氯用于饮用水消毒已有百余年的历史，目前，我国采用氯消毒剂的水厂占99.5%以上[10]，美国等发达国家的氯消毒剂利用率也多在90%以上[11]。

在消毒过程中，氯消毒剂在水体中与有机物或无机物发生取代、加成等一系列化学反应产生相应的DBPs，较典型的有THMs，HAAs和MX。

由于这些DBPs会产生一定的健康风险，各国对于饮用水DBPs中相关物质的含量限制越来越严格，使得许多饮用水单位不得不更换新的消毒技术。

现在所选用的饮用水消毒方式主要有二氧化氯消毒、氯胺消毒和臭氧消毒，同时也加强了物理消毒技术和组合消毒技术的应用。

随着新兴消毒技术的运用以及现代分析技术的不断发展，在饮用水中检测出多种含氮消毒副产物（N-DBPs）[2,8]。

表1对这些DBPs进行了归纳小结。

表1DBPs的分类

Table1ClassificationofDBPs

分类

代表物质

英文缩写

结构式

C-DBPs

三卤甲烷（Trihalomethanes,THMs）

[1,8,12,13]

三氯甲烷

TCM

溴二氯甲烷

BDCM

二溴氯甲烷

DBCM

三溴甲烷

TBM

二氯碘甲烷

DCIM

溴氯碘甲烷

BCIM

卤乙酸（Haloaceticacids,HAAs）

[1,8,12]

一氯乙酸

CAA

二氯乙酸

DCAA

三氯乙酸

TCAA

溴氯乙酸

BCAA

溴二氯乙酸

BDCAA

二溴氯乙酸

DBCAA

溴乙酸

BAA

二溴乙酸

DBAA

三溴乙酸

TBAA

一碘乙酸

IAA

溴碘乙酸

BIAA

致诱变化合物

（mutagenX,MX）[2]

及其同系物

3-氯-4-（二氯甲基）-5-羟基-2-（5氢）呋喃酮

MX

（Z）-2-氯-3-（二氯甲基）-4-氧化丁烯酸

ZMX

（E）-2-氯-3-（二氯甲基）-4-氧化丁烯酸

EMX

N-DBPs

卤化硝基甲烷（Halonitromethanes,HNMs）

[5,14]

一氯硝基甲烷

CNM

二氯硝基甲烷

DCNM

三氯硝基甲烷

TCNM

一溴硝基甲烷

BNM

二溴硝基甲烷

DBNM

三溴硝基甲烷

TBNM

二溴一氯硝基甲烷

DBCNM

一溴二氯硝基甲烷

BDCNM

一氯一溴硝基甲烷

CBNM

卤化乙腈（Haloacetonitriles,HANs）

[6]

氯乙腈

CAN

二氯乙腈

DCAN

三氯乙腈

TCAN

溴乙腈

BAN

二溴乙腈

DBAN

溴氯乙腈

BCAN

碘乙腈

IAN

卤化乙酰胺（Haloacetamides,HAcAms）

[7,15]

一溴乙酰胺

BAcAm

二溴乙酰胺

DBAcAm

氯乙酰胺

CAcAm

二氯乙酰胺

DCAcAm

三氯乙酰胺

TCAcAm

N-亚硝胺

（N-nitrosamines,NMs）

[16]

N-亚硝基二甲胺

NDMA

N-亚硝基吡咯烷

NPYR

N-亚硝基吗啉

NMOR

N-亚硝基吡啶

NPIP

N-亚硝基二苯胺

NDPHA

N-亚硝基甲基乙基胺

NMEA

N-亚硝基二乙基胺

NDEA

N-亚硝基二丙胺

NDPA

N-亚硝基二丁胺

NDBA

卤代氰

（Cyanogenhalides,CNXs）[9]

氯化氰

CNCl

溴化氰

CNBr

3消毒副产物的毒理学及其方法研究进展

由于DBPs的种类越来越多样化，其生物毒性和健康风险也越来越受到人们的关注，许多专家对各类DBPs毒性作用都展开了一定研究，研究方法也各有不同和侧重。

本文主要对表1中几类典型（C-DBPs）和新兴（N-DBPs）的DBPs毒理学特征及研究方法进行探讨。

3.1含碳消毒副产物毒理学及其方法研究进展

3.1.1THMs

THMs是最早发现的饮用水消毒副产物[17]，它们对龋齿类动物具有较强的致癌作用，可以作用于肝脏，大肠和肾脏，产生较强的毒性[18]，并且已被确认为致癌物。

在过去三十多年中，已有诸多学者对THMs的毒性以及作用机理展开了较深入的研究。

1994年，Melnick等[19]以大鼠（rat）为模式动物，对大鼠进行口暴露实验表明较高剂量的BDCM能使90%的雄鼠诱发腺癌，体外实验表明溴代THMs比氯代THMs对直肠癌的毒性强。

1997年，DeMarini等[20]对BDCM，TBM，DBCM，DCM（二氯甲烷）四种THMs在谷胱甘肽-S-转移酶存在的条件下作用于沙门氏菌（S.typhimurium）所引起的基因突变进行了研究。

选取HisG46为突变基因位点，检测突变光谱的变化情况，测得在谷胱甘肽-S-转移酶存在时，G-C转变为A-T的概率为96%-100%，且诱变能力的大小为：

TBM≈CDBM>BDCM≈DCM。

类推到人体，BDCM，TBM，DBCM三种物质受谷胱甘肽转移酶的调控，而不同于其他含氯THMs[21]，所以两类物质对人体的作用机制不同。

Lilly等[13]在1997年测定了TCM和BDCM分浓度注射入雄性F-344大鼠体内，测定毒物对大鼠肾毒性和肝毒性的影响，选用的指标有丙氨酸转氨酶（alanineaminotransferase,ALT），天冬氨酸转氨酶（aspartateaminotransferase,AST），脲氮（ureanitrogen,BUN），肌酸酐（creatinine,CRE），乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH），总蛋白（totalprotein,TPR），血清山梨醇脱氢酶（Serumsorbitoldehydrogenase,SDH）和尿A-乙酰葡萄糖胺酶（urineA-acetylglucosaminidase,NAG）的活性。

实验结果表明BDCM在低剂量的作用下对肾脏的急性毒性比TCM要强，并且对肾脏的慢性毒性要比TCM的作用要持久。

这与Lilly等[12]在1994年的研究结果符合。

由于碘代三卤甲烷正在成为科学界新兴的研究热点，Richardson等[22]对DCIM和BCIM的毒性展开了研究，他们选取中国仓鼠卵巢细胞（CHO）AS52为受试细胞，来测定DCIM和BCIM的慢性细胞毒性和急性遗传毒性，同时也将结果与一些含碘乙酸和一些新兴的碘代酸类物质的毒性进行综合比对。

用测定细胞密度的变化来确定慢性细胞毒性，选取的指标为%C1/2，即细胞密度为负对照的50%时的DBPs的浓度；用单细胞凝胶电泳（SCGE）测定急性遗传毒性，指标为拖尾率。

细胞毒性的大小排序如下：

TIM（三碘甲烷）>BDIM（溴二碘甲烷）>DBIM（二溴碘甲烷）>BCIM≈CDIM（氯二碘甲烷）。

3.1.2HAAs

早期动物生物检测数据表明HAAs不仅对生殖系统有影响，而且还有胚胎毒性和致畸作用，主要表现为多种生殖损害和发育损害[23]。

1997年，Giller等[24]运用三种方法测定比较了几种HAAs的细胞毒性作用，首先对大肠杆菌（E.coli）PQ37进行SOS显色实验，测定β-牛乳糖甘酶和碱性磷酸化酶的活性；然后通过对S.typhimuriumTA100菌株进行Ames变异反应突变实验，运用比色法定性；最后对伊比利亚肋突螈（Pleurodeleswaltl）进行微核实验，由红细胞中微核数的多少来确定这些物质的毒性大小。

最后得出结果：

BAA>CAA>DBAA>DCAA>TCAA>TBAA。

2002年，Kargalioglu等[25]用同样的物质对S.typhimuriumTA100进行微孔板细胞毒性测试，测定细胞经HAAs暴露210分钟后在595nm处的光密度，即OD595的值，定量测定这些HAAs的细胞毒性大小，结果为：

BAA>DBAA>CAA>TBAA>TCAA>DCAA。

同时对这些物质在经过细胞毒性因素调整之后的遗传毒性比较为：

BAA>DBAA>DCAA>CAA，而TBAA和TCAA没有诱变性。

2002年，Plewa等[26]采用CHOAS52为受试细胞，用微孔板实验测定细胞密度在暴露前后的变化以确定慢性细胞毒性，细胞密度为负对照的50%时的DBPs的浓度%C1/2为测试指标，结果为：

BAA>>DBAA>CAA>TBAA>DCAA>TCAA，用SCGE实验确定急性遗传毒性，以拖尾率为指标，结果表明：

BAA>>CAA>DBAA>TBAA，而DCAA和TCAA几乎没有遗传毒性。

2010年，Attene-Ramos等[27]对人体小肠上皮细胞FH74进行实验，除了测定比较了CAA，BAA，IAA的细胞毒性大小为：

IAA>BAA>CAA；用SCGE测得的遗传毒性大小为：

IAA>BAA>CAA；并且进一步合成cDNA，用实时定量PCR分析其基因表达，具体检测的基因表达功能包括：

损伤DNA结合，DNA修复，细胞周期调控和细胞凋亡等。

比较相关实验所得结果[25-27]，发现细胞毒性和遗传毒性之间有一定的相关性[28]，而对S.typhimurium实验所得的结果与选用CHO为受试细胞所得出的结果无相关性，表明用S.typhimurium为受试细胞所得的数据无法准确预测DBPs对哺乳动物细胞产生的毒性效应。

3.2含氮消毒副产物毒理学及其方法研究进展

3.2.1HNMs

早期研究表明，THMs对于龋齿类动物具有较强的致癌作用，可以作用于肝脏，大肠和肾脏，产生毒性作用[18]，同时也有胚胎毒性和致畸作用。

然而，有研究表明[28]，与THMs对应的HNMs的诱变性远大于THMs，产生的细胞毒性至少10倍于THMs，所采用的方法是将S.typhimuriumTA100菌株与HNMs培育三天之后，测定突变体克隆子的数量。

2004年，Kundu[29]用相同的实验方法对9种HNMs分别作用于S.typhimuriumTA98,TA100,TA104,TPT100,RSJ100在非代谢活化（-S9）和代谢活化（S9）两种情况下的诱变能力进行排序，并得出结果。

在非代谢活化时，（TBNM≈CBNM≈DBNM）>（BNM≈BDCNM）>（TCNM≈DCNM≈CNM）；在代谢活化时，（DBNM≈CBNM≈TBNM）>BNM≈BDCNM）>（DCNM≈CNM>TCNM），而DBCNM未观察到细胞毒性。

同年，Plewa[14]用CHOAS52做实验，采用酶标仪在595nm波长下测定细胞的吸光度值并进行单细胞凝胶电泳实验，检测了9种HNMs的慢性细胞毒性和急性遗传毒性。

当CHO暴露于HNMs毒物72小时之后，毒性大小为：

DBNM>DBCNM>BNM>TBNM>BDCNM>CBNM>DCNM>CNM>TCNM，而DNA的遗传损伤为DBNM>BDCNM>TBNM>TCNM>BNM>DBCNM>CBNM>DCNM>CNM。

在此基础上，2009年Liviac[30]利用彗星实验和微核实验结合的方法，测定了TCNM和BNM两种典型的HNMs作用于人类淋巴细胞（lymphocyte）TK6的毒性大小。

结果显示溴代物的毒性明显强于氯代物，同时DNA的损伤由氧化作用引起，并且不能转化为永久的遗传损伤。

3.2.2HANs

最新研究表明，HANs的毒性比同类的含碳消毒副产物例如HAAs要强许多[12]，同时随着新消毒方式的广泛应用，HANs作为改进的饮用水消毒方式产生的含氮DBPs的一种，其毒理学效应越来越受到人们的重视。

早在1991年，Osgood[31]就对果蝇在HANs作用下的毒性效应进行研究，发现HANs具有诱变性和致癌性，同时发现DCAN而非DBAN是黑腹果蝇卵母细胞非整倍体的有效诱导物。

在1995年，Curieux等[32]对CAN、DCAN、TCAN、BAN、DBAN、BCAN这六种物质的毒性进行研究，首先采用SOS显色反应确定了DCAN、DBAN、BCAN三种物质对于E.coliPQ37的DNA损伤都存在一定程度的诱导作用，但响应值较低，可见SOS方法虽然简单快速，但其局限性在于对毒物敏感性较弱。

其次，Curieux对S.typhimurium进行了Ames变异反应突变实验，以观察颜色的方法定性检测到CAN、DCAN、TCAN、BAN、BCAN这五种物质的诱变性，诱变能力大小排序为：

DCAN>BCAN>BAN>TCAN>CAN，这种方法较敏感，并且十分适于检测水样品的诱变性；最后，用微核实验检测到所有这六种物质均能对Pleurodeleswaltl周边血液红细胞的染色体断裂产生效应。

为了选用更合适的模式生物来模拟HANs作用于人体的毒性情况，Muellner[6]采用CHOAS52为模式细胞，运用测试细胞密度变化的毒性分析法和单细胞凝胶电泳两种方法系统分析了7种HANs作用于CHO的慢性细胞毒性和急性遗传毒性作用，细胞毒性大小次序为：

DBAN>IAN≈BAN>BCAN>DCAN>CAN>TCAN；遗传毒性大小次序为：

IAN>BAN≈DBAN>BCAN>CAN>TCAN>DCAN。

从结果可以看出细胞毒性和遗传毒性具有一定的相关性，并且碘代物的毒性要大于溴代物的毒性大于氯代物的毒性。

3.2.3HAcAms

2008年，Plewa[15]对13种HAcAms作用于CHOAS52的慢性细胞毒性和急性遗传毒性进行了比较研究，细胞毒性的大小次序为：

DIAcAm（二碘乙酰胺）>IAcAm（碘乙酰胺）>BAcAm>TBAcAm（三溴乙酰胺）>BIAcAm（溴碘乙酰胺）>DBCAcAm（二溴氯乙酰胺）>CIAcAm（氯碘乙酰胺）>BDCAcAm（溴二氯乙酰胺）>DBAcAm>BCAcAm（溴氯乙酰胺）>CAcAm>DCAcAm>TCAcAm。

遗传毒性的大小次序为：

TBAcAm>DIAcAm≈IAcAm>BAcAm>DBCAcAm>BIAcAm>BDCAcAm>CIAcAm>BCAcAm>DBAcAm>CAcAm>TCAcAm。

DCAcAm没有遗传毒性。

同年，Plewa等[33]通过试管哺乳细胞试验系统分析和对比了THMs、HAAs、HANs、HNMs和HAcAms等卤代DBPs的细胞毒性和遗传毒性，结果发现，上述卤代DBPs的细胞毒性由高到低依次为：

HAcAms>HNMs>HANs>HAAs>THMs；遗传毒性由高到低依次为：

HAcAms≈HANs>HNMs>HAAs>THMs。

可见HAcAms具有更高的致畸和致突变性。

3.2.4NMs

随着亚硝胺类物质在消毒饮用水中的出现，它作用于人体所产生的安全效应越来越受到关注，亚硝胺类物质也逐渐被认为是一种致癌物。

而在亚硝胺类物质当中，二甲基亚硝胺（NDMA）是唯一在饮用水中被发现的化学物质，在九十年代，科学界关于亚硝胺类物质的所有研究重点几乎都集中于NDMA的存在和毒理学效应[34]。

NDMA最早在加拿大安大略湖消毒饮用水中发现的浓度为0.3µg/L[35]，而最新的测定数据显示，NDMA在饮用水消毒之后的浓度一般不会超过10ng/L[36]。

而有关NDMA的毒理学研究，在1996年时，Couratier等[37]就对NDMA作用于神经细胞（neuralcells）的急性和慢性毒性作用进行了相应的研究，采用了免疫印迹法，并且应用荧光显微镜观察残存神经元数量来表征NDMA毒性大小，研究认为，NDMA的神经毒性作用可以导致神经元磷酸化和免疫反应。

1999年，Taniguchi等[38]通过测定大鼠肝脏内的谷胱甘肽（GSH）和金属硫蛋白（MT）在暴露于NDMA一段时间之后含量的变化研究了NDMA对老鼠肝脏的氧化作用。

结果显示，NDMA重复施毒所产生的氧化和肝毒素效应大于单剂量投药的效应。

2010年，一项最新的研究[39]评估了亚硝基二乙胺（NDEA）和亚硝基二甲胺（NDMA）两种亚硝胺类物质作用于lymphocyteTK6的细胞毒性和遗传毒性作用。

此实验首先测定了细胞暴露于NDMA和NDEA之后的稳定度来确定细胞毒性，其次采用单细胞凝胶电泳测定DNA损伤，采用微核实验来测定染色体断裂等其他遗传损伤。

结果表明NDEA和NDMA无论浓度的高低均不体现细胞毒性，而只有在添加了S9之后，NDMA在10mM的高浓度下才能显示出遗传毒性，NDEA在5mM浓度时显示出遗传毒性。

3.3消毒副产物的毒理学研究方法概况

近三十年来，科学界对DBPs毒理学效应的研究正在不断深入，已有的毒理学研究也运用不同的受试生物和不同的检测方法阐述并比较了多种DBPs的毒理学大小。

表2对这些毒理学研究方法进行了总结概括。

表2DBPs的毒理学研究方法

Table2ToxicologyresearchmethodologiesofDBPs

物质

受试生物

测试方法

测试指标

文献

C-DBPs

THMs

maleratF-344

口头暴露

ALT,AST,BUN,CRE,LDH,TPR,SDH,NAG

[13]

S.typhimuriumRSJ100

hisG46突变光谱

G-C→A-T

[20]

CHOAS52

测细胞密度

%C1/2

[22]

单细胞凝胶电泳

拖尾率

HAAs

S.typhimuriumTA100

Ames变异反应突变实验

定性观察颜色

[24]

E.coliPQ37

SOS显色实验

β-牛乳糖甘酶和碱性磷酸酶活性

Pleurodeleswaltl

微核实验

红细胞微核数

S.typhimuriumTA100

微孔板细胞毒性实验

OD595

[25]

CHOAS52

测细胞密度

%C1/2

[26]

单细胞凝胶电泳

拖尾率

人小肠上皮细胞FH74

测细胞密度

%C1/2

[27]

单细胞凝胶电泳

拖尾率

RT2-PCR

DNA结合、修复，细胞周期调控与细胞凋亡

N-DBPs

HNMs

S.typhimurium

致突变试验

突变体的数量

[29]

CHOAS52

测细胞密度

%C1/2

[1