儿茶素类化合物抗氧化评价方法及作用机制的研究现状Word格式文档下载.docx
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中图分类号：
R979.9文献标志码：
A文章编号：
R285.5；
文献标志码：
1003-9783（2016）02-
doi:
10.3969/j.issn.1003-9783.2016.02.
ReviewonAnti-oxidativeEvaluationMethodsandMechanismofCatechins
LiWeixi1,LiYifang2,HeRongrong3*（1CollegeofTraditionalChineseMateriaMedica,YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming,650500,China;
2InstituteofTraditionalChineseMedicineandNaturalProducts,JinanUniversity,Guangzhou,510632,China）
Abstract：
Freeradicalsarenecessaryforlife.Sincetheyareconstantly
generated
andconstantly
scavenged
in
organism,theycanmaintainatanaveragephysiologicallevel.Freeradicalsplayanimportantroleinanumberofbiologicalprocesses,suchasengulfing
pathogens,involvinginbiochemical
reactions
andregulating
cellproliferation
and
differentiation.However,excessivefreeradicalsareinjurioustoDNAandproteins,andcaninducediseases.Theanti-oxidationsysteminvivotogetherwiththeantioxidantsprotectthebodyagainstoxidativedamage.Catechinsfoundwidelyinteaplantshavepotentanti-oxidativeactivity,whichhavebeenseriouslyconcerned.Manyresearcheshavebeendoneinrecentyearsconcerningtheeffectsandmechanismofcatechinsonanti-oxidative.However,differentresultsstemfromdifferentevaluationmethods.Thisarticleintroducestheadvancesonthestudyofcatechinsfromtheaspectofthecurrentusedcommonlyanti-oxidativeevaluationmethodsandtheanti-oxidativemechanismofcatechins.Itisaimedtoprovidebeneficialreferencetotheapplicationofcatechins.
Keywords:
Catechins;
Anti-oxidation;
Freeradicals
自由基（Freeradicals）是指游离存在于自然界中的带有未配对电子的分子、离子、原子或原子团。
尽管各种自由基存在时间极为短暂，但化学性质十分活泼，易发生化学反应。
在生物机体内的自由基常以氧自由基（Oxygenfreeradical，OFR）和氮自由基（Nitrogenradical）
收稿日期：
2015-11-18
作者简介：
李维熙，女，博士，讲师，研究方向：
茶叶活性。
Email：
liweixi1001@。
基金项目：
国家自然科学基金资助项目（81560661）。
的形式存在，目前研究最多的是OFR。
自由基在机体内具有双重生物学效应，在正常生理条件下，少量的自由基具有杀伤外来微生物，舒张血管和参与部分神经讯号传导等积极的生理过程。
但过多的自由基会与体内核酸、脂质、蛋白质及生物膜上的多元不饱和脂肪酸等发生反应，破坏DNA的碱基结构，改变蛋白质的一级结构，诱发蛋白质发生交联聚合，使蛋白质失去某些生理功能，最终引起机体组织的过氧化性损伤[1]，影响组织和细胞的正常生理功能。
在正常的生理状态下，机体依赖酶促系统和非酶促系统维持体内的自由基水平。
其中，酶促系统包括超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化物酶（POD）及过氧化氢酶（CAT），等.通过它们之间的协同作用有效地清除细胞在新陈代谢过程中产生的超氧化物和过氧化物等自由基，完成细胞内的抗氧化作用和维持正常生理机能。
非酶促系统则是利用抗氧化剂清除机体内多余的自由基，有益于疾病的预防和治疗。
自然界中的抗氧化剂大多为多酚类化合物，其中应用较多是儿茶素类化合物。
儿茶素类化合物是含有黄烷-3-醇（Flavan-3-ol）结构的一大类物质，广泛存在于茶、可可等多种植物中，该类化合物因分子中具有多个酚羟基而显示强抗氧化活性。
茶叶中富含的儿茶素类物质主要为儿茶素（Catechin，（+）-C）、表儿茶素（Epicatechin,EC）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin,EGC）、表儿茶素没食子酸脂（Epicatechingallate,ECG）、没食子儿茶素酸酯（Gallocatechingallate，GCG）和表没食子儿茶素酸脂（Epigallocatechingallate,EGCG），等.其中EGCG含量最高。
由于儿茶素类多酚化合物来源丰富，抗氧化作用效果明显，而备受人们的关注，因此本文将儿茶素类化合物的抗氧化活性评价方法、原理以及作用机制的研究现状综述如下，旨在为其深入研究和产业化应用提供有益的参考。
1儿茶素类化合物抗氧化作用的研究方法
目前，人们根据生物活性水平将儿茶素类化合物的抗氧化作用研究方法分为体外抗氧化活性、细胞抗氧化活性及体内抗氧化活性评价的3种类型，具体的研究方法、作用特点及应用概述如下。
1.1体外抗氧化作用的评价体外抗氧化活性评价是利用适当的方法对实验条件下激发的自由基进行直接测定，具有操作简单、检测速度快、价格低廉等优点，是目前使用最为广泛的活性筛选方法之一[2]，该类方法主要包括电子自旋共振（ElectronSpinResonance，ESR）、抗氧化能力指数（Oxygenradicalabsorbancecapacity，ORAC）、总自由基捕获抗氧化参数（Totalradical-trappingantioxidantparameter，TRAP）、Trolox等效抗氧化容量分析法（Troloxequivalentantioxidantcapacityassay，TEAC）、总氧自由基清除能力（Totaloxyradicalscavengingcapacity，TOSC）、亚铁还原能力（Ferricreducing/antioxidantpowerassay，FRAP）以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl,DPPH）法等。
ESR又称顺磁共振（ParamagneticResonance），该方法是利用电子自旋运动产生的磁矩与外磁场之间的作用，定性和定量检测物质原子或分子中所含的不配对电子。
该方法具有灵敏度高，稳定性和重复性好，能获得复杂被测物中的自由基信息等特点，是研究自由基最直接和最有效的方法和技术之一。
应用ESR法，Guo等人[3]评价了EGCG、EGC、EC、GCG、GC和（+）-C清除超氧阴离子（Superoxideanion，
）、单线态氧（Singletoxygen，1O2）、DPPH和偶氮化合物2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（2,2'
-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，APPH）自由基的活性，发现EGCG和GCG这两个在结构上连有没食子基的化合物活性强于不含没食子基团的EGC、GC、EC和（+）-C。
研究结果提示，含有相同平面结构的表型和非表型儿茶素类化合物在高浓度和低浓度时的自由基清除能力强弱不尽相同，在高浓度时两者之间没有明显差异，而在低浓度时GCG、GC和（+）-C的自由基清除能力强于其对应的表型儿茶素EGCG、EGC和EC，即表现为GCG＞EGCG＞GC＞EGC＞（+）-C＞EC。
说明在低浓度时，儿茶素类化合物的立体结构对其自由基清除能力有一定的影响。
Gardner等人[4]利用该方法评价了不同儿茶素类化合物在乙醇中清除加尔万氧自由基（2,6-二叔丁基-（3,5-二叔丁基-4-氧代-2,5-环己二烯）-对甲苯氧自由基）和在水中清除亚硝基过硫酸钾自由基（Fremy’ssalt）的活性，发现在水中此类化合物清除加尔万氧自由基的顺序为EGCG＞ECG＞GA＞EC≈（+）-C＞EGC，在乙醇中清除过硫酸钾自由基的活性强弱则是EGCG＞ECG＞EC＞EGC＞C＞GA。
Kurihara等人[5]利用该方法有效地评价了乌龙茶的抗氧化作用，结果表明乌龙茶提取物具有显著的抗氧化活性，IC50仅为19.9μg∙mL-1。
ESR方法不仅能有效地评价被测物的抗氧化作用，也能够用于研究和筛选新的抗氧化物质。
在进行乌龙茶的抗氧化作用研究中，Kurihara等[6]注意到可可茶和传统茶在清除自由基反应中的ESR信号不同，推测这两种茶叶中含有不同类型的多酚类物质，在进一步追踪信号后，从可可茶中分离得到1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA两种新的儿茶素类化合物。
ORAC作为衡量蔬菜、水果及食品添加剂等抗氧化能力的评价方法现已被广泛使用[7,8]。
ORAC分析方法是根据AAPH可在37°
C下的生理温度释放过氧自由基破坏荧光探针荧光素钠，使其在527nm处所发射的荧光强度产生变化为原理，以维生素E水溶性类似物Trolox为定量标准，使用荧光微孔板分析仪进行分析。
ORAC水平反映抗氧化剂直接清除自由基的能力。
Henning等人[9]利用ORAC方法有效的评价并比较了不同儿茶素类化合物的抗氧化能力，结果表明儿茶素类化合物中ORAC指数（mmol/mmol）最高的是ECG，ORAC指数为10.4，其次为EGCG，ORAC指数为8.2，再次为EC和GCG，ORAC指数分别为6.7和6.4。
ORAC也常用于给药后体内活性氧自由基的分析，包括亲水过氧基（Hydrophilicperoxylradical）、亲脂过氧基（Lipophilicperoxylradical）、羟基（Hydroxylradical）、过氧亚硝基（Peroxynitrite）、
和1O2等。
虽然ORAC方法广泛应用于体内外抗氧化活性的评价，但由于抗氧化活性物质容易受到体内环境及生物利用率等影响，因此体内ORAC水平所反映的应是一种包括外源抗氧化物质在内的机体抗氧化能力水平。
Prior等人[10]利用ORAC方法测定了GC、EC、（+）-C和GCG的体内ORAC指数，结果分别为1.74，2.36，2.49和2.43（μmol/μmol）。
Kurihara等人[11]利用ORAC方法比较了儿茶素类化合物和乌龙茶提取物的抗氧化能力，ORAC指数由大到小的顺序为EC＞（+）-C＞EGCG＞乌龙茶提取物，结果提示乌龙茶提取物通过富含的EC及EGCG等儿茶素类化合物提高拘束应激小鼠血浆的ORAC水平，达到抗氧化作用。
涂云飞等[12]采用二次通用回旋设计，以流动注射化学发光法考察了ECG、EC、EGCG和EGC之间清除羟基自由基能力的强弱及其协同作用，认为单体化合物清除羟基自由基能力为：
ECG＞EC＞EGCG＞EGC，在协同作用时ECG的贡献率超过了43%，EGC的作用相对不明显。
此外，硫代巴比妥酸反应物法（Thiobarbituricacidreactivesubstances，TBARS）也是常用的脂质过氧化评价方法。
赵文红等人[13]利用TBARS法，测定了（+）-C体外对大鼠血清和肝匀浆脂质过氧化的抑制作用，发现（+）-C在低浓度时就能够抑制血清自氧化和肝匀浆自氧化水平。
1.2细胞抗氧化作用的评价鉴于体外分析方法不能完全地反映抗氧化物质在体内的活性，WolfeKL等[14]建立了细胞抗氧化活性评价方法（Cellularantioxidantactivity，CAA）。
CAA法是利用细胞为实验材料，负荷2'
7'
-二氯荧光二乙酸盐
（2'
-dichlorofluorescindiacetate，DCFH-DA），在细胞内酯酶分解作用下，DCFH-DA脱掉乙酰乙酸基团，形成还原型二氯荧光素（DCFH）。
然后，再利用AAPH（APPH）释放过氧自由基ROO·
攻击DCFH，使其氧化成荧光物二氯荧光素（DCF）。
抗氧化剂在细胞膜内部与活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）和ROO·
结合而阻断DCFH氧化成DCF，从而减少DCF的形成。
因此，通过测定细胞的荧光强度就可以有效反映细胞内的自由基水平，评价受试样品的抗氧化能力。
与传统的体外化学分析方法相比，CAA法具有更好的生物相关性。
除测定细胞内的ROS生成量，还可以测定细胞中SOD、GSH-px、丙二醛（MDA）等指标，来衡量儿茶素类化合物对细胞内抗氧化系统的保护作用。
在H2O2诱发巨噬细胞损伤模型中，儿茶素类化合物EGCG能显著降低受损细胞中的ROS水平，并能降低脂质过氧化物MDA水平，提高细胞内抗氧化酶系统SOD、GSH-px水平[15]。
EGCG还能显著降低中波紫外线（UVB）辐照人表皮角质形成细胞中的ROS生成量，显著提高SOD和GSH-px水平，提高细胞存活率[16]。
在农药百草枯致人神经母细胞瘤细胞损伤实验中，EGCG同样能抑制细胞内的ROS以及MDA生成，并能提高SOD水平[17]。
牛丽等人[18]还考察了EGCG和EGC对高糖诱导的人晶状体上皮细胞的保护作用，实验结果证实两者均能降低高糖造成的MDA和一氧化氮（NO）升高，提高SOD、CAT和GSH-px的活性，以及SODmRNA的表达水平，显示出较好的对高糖致损细胞的保护作用。
1.3体内抗氧化活性动物和临床实验无疑是评价儿茶素抗氧化活性的最好方法，原因是这些实验不仅可以反映儿茶素的体内抗氧化活性和其它多种作用效果，还能够评价血液及组织器官中的MDA、谷胱甘肽（GSH）和同型半胱氨酸等指标，及SOD、GSH-Px等酶活性和基因表达，同时也能够获得受试物的生物利用度、代谢及作用机制等多方面信息，因而被广泛应用于儿茶素抗氧化作用的评价[19-20]。
糖尿病是与氧化应激密切相关的疾病，EGCG在降低自发2型糖尿病Goto-kakizaki大鼠血糖水平的同时，能显著血清SOD和GSH-px水平，降低MDA水平[21]。
对链脲佐菌素所致实验性糖尿病大鼠肾脏的氧化应激状态EGCG也有很好的改善作用，具体表现为提高肾脏SOG和GSH-px水平，降低MDA水平与血浆同型半胱氨酸水平[22]。
葛斌等[23]检测了EGCG对高脂性脂肪肝大鼠肝脏MDA和SOD水平的影响，发现EGCG能降低MDA水平，提高SOD水平，表现出一定的保护肝脏，改善高脂性脂肪肝的作用。
除对代谢性疾病造成的氧化应激有改善作用，儿茶素类化合物还能有效缓解因辐射造成的肺损伤、肿瘤、帕金森症等疾病导致的氧化应激。
在大量体外、细胞和动物实验的基础上，人们也非常关注对儿茶素类化合物的临床研究。
滕倩等[24]检测了40名健康志愿者服用EGCG和叶黄素后的血浆抗氧化指标，发现EGCG能有效的协同叶黄素提高受试者血浆SOD和GSH-px水平，降低MDA值，其效果优于单单独使用叶黄素。
KimuraM等[25]检测了健康志愿者连续服用儿茶素类化合物的血药浓度，发现血浆结合态儿茶素类化合物浓度显著升高，他们还以FRAP法测定了血浆抗氧化水平，发现在连续服用儿茶素类化合物可有效提高内源性抗氧化能力。
GomikawaS等[26]的研究也证实在饮用绿茶能显著提高血浆结合态儿茶素类化合物及维生素C水平，同时也显示抑制低密度脂蛋白氧化的作用。
SungH等[27]在为期3周的实验中发现，受试者饮用绿茶饮料后有效提高血浆抗氧化能力，并显示一定的剂量相关性。
另一项随机双盲的实验中，所有受试者给予不含黄酮和儿茶素饮食，实验组每天补充含18.6mg儿茶素类化合物的绿茶提取物，实验持续3周，与对照组相比，绿茶提取物负荷能有效提高餐后血浆抗氧化能力[28]。
综上所述，目前人们研发了多种用于评价儿茶素类化合物抗氧化活性的方法，且不同方法间显示各自特点和优势，其检测结果间也存有一些差异。
其差异性的原因不排除与不同儿茶素的体外抗氧化能力在浓度，与不同类型自由基反应时所显示的一定特异性。
而在临床实验中，此类化合物的剂量和生物利用度也会在一定程度上影响到该类化合物的抗氧化活性。
2儿茶素的抗氧化机制
有关儿茶素的抗氧化机制人们也进行了很多探讨，下面将主要从儿茶素类化合物中酚羟基清除自由基的动力学机制、自由基清除量以及影响反应速率的因素等方面来介绍此类化合物的抗氧化机制。
2.1酚羟基清除自由基反应动力学机制酚羟基是儿茶素类化合物产生自由基清除和抗氧化作用的主要活性基团。
动力学研究表明，酚羟基清除自由基的反应机制有氢转移、电子转移-质子转移、质子优先损失的电子转移3种。
2.1.1氢转移机制酸性条件下，酚类化合物的活性基团以酚羟基形式存在，并通过将酚羟基上的氢原子转移到活泼自由基上来清除活泼自由基。
通过对前线轨道的进一步研究发现，其作用机制分为两种，即氢原子转移（H-atomtransfer，HAT）与质子耦合电子转移（Proton-coupledelectrontransfer,PCET）。
在这两种情况下，质子和电子的转移都是一步完成的。
HAT是酚羟基上的氢原子及其携带的电子转移到活泼自由基的同一轨道上，自身形成比较稳定的酚氧自由基[11]。
PCET与HAT的区别在于氢原子与其携带的电子转移到了自由基的不同轨道上。
PCET通常发生在能形成氢键的化合物中，质子沿着氢键转移到自由基中氧原子的未共用电子对上，并伴随着电子从未共用电子对上转移到自由基的半占据轨道（Singlyoccupiedmoleculeorbital，SOMO）[29,30]。
由于结构中大多存在氢键，儿茶素类化合物清除自由基并伴随氢转移时大多遵循PCET机制[31,32]。
图1氢转移机制
Figure1ThemechanismofHATandPCET
2.1.2电子转移-质子转移（electrontransfer−protontransfer，ET-PT）ET-PT是两步反应。
首先酚羟基上的电子转移到自由基上，接着是质子的释放转移。
由于质子转移非常快，ET-PT也可以看作近似氢原子转移HAT过程[33-34]。
图2ET-PT转移机制
Figure2ThemechanismofET-PT
2.1.3质子优先损失的电子转移（Sequentialprotonloss-electrontransfer，SPLET）与ET-PT反应顺序相反，SPLET反应第一步是酚羟基失去质子形成酚氧负离子，接着酚氧负离子上的电子转移到自由基上，通过电子的转移来清除自由基。
这种反应发生在碱性条件下，酚氧负离子能够稳定存在，电子转移可以在酚氧负离子重质子化之前完成[35-36]。
图3SPLET转移机制
Figure3ThemechanismofSPLET
由于反应物与产物是相同的，3种反应机制在热力学平衡上是一致的。
3种反应机制间的竞争是由限速步骤的动力学来决定的。
对于PCET来说，限速步骤为氢原子的转移，对于ET-PT和SPLET来说，限速步骤为电子的转移。
DiMeo等[29]应用量子化学的方法进一步对多酚化合物清除自由基的动力学研究发现，不论在何种极性的溶剂中，由于
不稳定（核对书写形式），除了在清除高活性自由基如•OH时，ET-PT机制都无法发生。
在非极性环境中，如脂质双分子层中，儿茶素类物质主要遵循PCET机制清除自由基，这就意味着在清除脂质过氧化物时PCET是儿茶素类化合物的主要作用机制。
在极性溶剂中，由于儿茶素类化合物去质子化增强，PCET与SPLET两种作用机制相互竞争，随着pH值升高，去质子化趋势增加，儿茶素类化合物清除自由基的机制以SPLET机制为主，因此，在碱性条件下，儿茶素类物质更容易氧化，不仅能与反应活性高的自由基反应，还能被反应活性低的自由基氧化。
2.2儿茶素类化合物清除自由基能力如果从化学角度来评价抗氧化剂的抗氧化能力，有必要从两个方面进行探讨，其一是抗氧化剂以多大的反应速率清除自由基，即清除速率的问题；
另一方面是一个抗氧化剂分子能够清除几个自由基，换言之是清除量的问题。
2.2.1茶素类化合物清除自由基速率由于结构上的差异，儿茶素类化合物清除自由基能力的强弱与反应速率常数不尽相同。
研究表明，该类化合物清除自由基能力的强弱以及反应速率常数与酚羟基的数目以及位置有关。
为了更好的探讨儿茶素结构与自由基清除速率之间的关系，人们将儿茶素的结构分为A环与B环，其中A环的结构与间苯二酚类似，B环的结构与邻苯三酚和儿茶酚相似。
因此，在研究中大都以间苯二酚与间苯三酚作为A环的模式化合物，邻苯三酚作为B环模式化合物，探讨A环与B环对儿茶素自由基清除速率的影响（见图4）。
Senba等[37]用停流法测定了模式化合物以及儿茶素类化合物清除DPPH的反应速率，发现A环模式化合物间苯二酚与间苯三酚的反应速率非常低，表明含有间位酚羟基的化合物虽然具有自由基清除能力，但反应活性较低。
而儿茶酚与间苯二酚含有的酚羟
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