霍乱实验室检测技术.ppt

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霍乱弧菌实验室检测技术,北京市海淀区疾病预防控制中心,霍乱的流行情况霍乱的生物学性状样本的采集检验操作程序荧光定量PCR方法检测O1群、O139群霍乱弧菌及霍乱毒素,提纲,由O1群、O139群霍乱弧菌引起的霍乱以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征，被世界卫生组织列为国境卫生检疫传染病，也是我国传染病防治法中规定强制管理的甲类传染病。

O1群霍乱弧菌的流行情况1817年1923年发生六次霍乱的世界大流行均由O1群霍乱弧菌古典生物型引起1820年古典生物型引起的霍乱首次传到我国1961年开始了第七次霍乱的世界大流行均由O1群霍乱弧菌埃尔托生物型引起（1905年发现）1961年埃尔托生物型霍乱首次传到我国,O139群霍乱弧菌的流行情况1992年印度马德拉斯发生O139霍乱并迅速传播1993年6月我国新疆发现O139霍乱流行。

1994年我市发现O139霍乱疫情,O1群和O139群霍乱弧菌与其他霍乱弧菌的最大区别是能产生相同的霍乱毒素,弧菌的分类形态与染色抗原结构、血清群生长与培养特性生化反应特性对外界的抵抗力药物敏感性,霍乱的生物学性状,弧菌的分类（包括5个属）弧菌属霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、河弧菌等等气单胞菌属邻单胞菌属发光菌属水栖菌属,霍乱的生物学性状,形态与染色革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲呈弧形或逗点状暗视野显微镜下，霍乱弧菌运动活泼，呈穿梭状或流星状培养基上菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润,霍乱的生物学性状,革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平,单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲成弧形或逗点状,抗原结构、血清群H抗原和O抗原根据O抗原不同，分为200多个血清型根据O抗原成分的不同分群特异性抗原因子和型特异性抗原因子O1群据型特异性抗原成分不同分为小川、稻叶、彦岛三个血清型小川型含A、B抗原因子，也含少量C因子成分稻叶型含A、C因子彦岛型含A、B、C因子,霍乱的生物学性状,生长与培养特性好氧同时兼性厌氧，最适生长温度37钠离子可刺激生长耐碱不耐酸初次分离时常用碱性蛋白胨水（pH8.8-9.0）增菌培养，霍乱弧菌经68h增菌后可在液体表面大量繁殖，形成菌膜,霍乱的生物学性状,生化反应特性两个生物型的霍乱弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖产酸不产气迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖氧化酶试验弧菌属细菌大多为阳性粘丝实验弧菌属细菌大多为阳性,霍乱的生物学性状,对外界的抵抗力在河、井、海水中可存活13周以上食物和海产品上存活7天左右对低温和碱耐受力强（在食品上的弧菌于冰箱保存（05度）比室温存活时间长）对热、干燥、太阳直射敏感对含氯制剂、碘制剂敏感对酸和强氧化剂极敏感煮沸100度12min即可被杀死药物敏感性细菌带有可传递的耐药质粒近年产生多重耐药株（丁胺卡那霉素、强力霉素、复方新诺明）诺氟沙星和环丙沙星对霍乱弧菌保持较高的敏感性,霍乱的生物学性状,霍乱的致病性主要毒素霍乱肠毒素CT小带联结毒素zot辅助霍乱肠毒素ace溶血素、溶细胞素、志贺样毒素O139群除具有上述O1群的致病物质外，还存在荚膜多糖和特殊LPS毒性决定簇，可抵抗血清中杀菌物质和黏附到小肠黏膜上。

霍乱的生物学性状,腹泻患者样本采集水样便采13ml，成形便取指甲大小量肛拭子：

生理盐水浸湿采便管由肛门插入直肠内35cm处旋转取出呕吐物采13ml标本和碱胨水比例为1：

5水样及液体标本采集采集相对静止表层水（30cm内）500ml其他液体标本采集500ml23小时内送检涂抹样本采集23支无菌棉签涂抹35只以上水生动物表面、腮部及泄殖腔23支无菌棉签涂抹食品或物品表面（地沟口，下水管口，水池壁涂抹，餐盘内外侧）直接放入10ml碱胨水送检,样本的采集,典型的米泔水样便,动力试验水样便：

取一滴在玻片上，盖盖玻片，暗视野显微镜直接观察成形便：

取适量在生理盐水中研磨，盖盖玻片，镜下观察高度可疑样本：

取增菌的碱胨水在玻片上，盖盖玻片，镜下观察镜下有穿梭样运动为动力试验阳性动力抑制试验取O1群、O139群霍乱弧菌诊断血清，取适量标本在其中研磨穿梭样运动消失，菌体凝集成块为动力抑制试验阳性,检验操作程序,增菌及分离培养碱性蛋白胨水pH8.8-9.0注意标本和胨水的比例要适当分离培养基分两类选择性强的培养基四号琼脂、TCBS、庆大培养基选择性弱的培养基碱性琼脂和碱性胆盐琼脂,检验操作程序,霍乱弧菌在庆大培养基上菌落形态。

（菌落呈现无色、圆形半透明、湿润、扁平或稍突起、边缘整齐，由于亚碲酸钾的作用，菌落中央常呈灰色或灰黑色）,型霍乱弧菌在号平板和上的菌落形态,病人粪便标本,增菌6-8h,庆大平皿划线培养18-24h,每皿挑取9-10个可疑菌落血清凝集试验,向医院属地CDC报告医学观察病例,霍乱分群诊断（单克隆抗体）,群,群,二次增菌6-8h,1、悬滴动力试验（+），动力抑制试验（+）2、有明确流行病学史，动力试验（+），动力抑制试验（+）,症状典型但服药患者便,检验操作程序,菌株的初步鉴定血清凝集试验复核及鉴定血清凝集试验革兰氏染色氧化酶试验粘丝试验动力试验,检验操作程序,菌株的初步鉴定血清凝集试验挑取可疑菌落与O1群、O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验，很快出现均匀沙粒样凝集颗粒为阳性（一般不超过10s）注意：

菌液浑浊，似凝非凝不能判定为阳性同时做生理盐水对照在1min内不出现凝集为阴性结果可疑时需要做PCR鉴定,检验操作程序,菌株的复核及分型血清凝集试验用O1群、O139群霍乱弧菌诊断血清与挑取的菌落进行玻片凝集O1群霍乱弧菌分型用小川型和稻叶型单价血清进行玻片凝集结果分3种情况同时做生理盐水对照,检验操作程序,菌株的复核及分型氧化酶试验弧菌属大部分为阳性，作为弧菌的简易辅助鉴定方法用氧化酶试剂（1%盐酸二甲基对苯二胺）湿润滤纸取营养琼脂上菌落涂抹于有试剂的滤纸上反应部位在12min内出现粉红-紫红-紫蓝色判为阳性肠杆菌科细菌不变色或变粉后很快退色注意不使用过期试剂和金属接种针,检验操作程序,菌株的复核及分型粘丝试验弧菌属大部分为阳性作为弧菌的简易辅助鉴定方法在玻璃平皿上滴一大滴0.5%去氧胆酸钠溶液取营养琼脂上新鲜培养物研磨后与试剂研磨混合混悬液变清亮粘稠，可拉出细长丝者为阳性阴性者呈均匀悬液状态动力试验革兰氏染色,检验操作程序,药敏试验根据美国临床实验室标准委员会（NCCLS）推荐的Kirby-Bauer（K-B）氏法进行。

检验操作程序,药敏试验注意事项每次药敏试验必须用ATCC25922大肠杆菌做质控使用的MH培养基不能太薄使用的MH培养基PH值应为7.3抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限不可用过期的试剂和药敏纸片,检验操作程序,荧光定量PCR方法鉴定探针和引物,检验操作程序,荧光定量PCR方法鉴定模板的制备：

挑取数个菌落加入装有100去离子水的1.5mL管中,混匀后10010分钟，12000转/分钟离心5分钟，取上清液作为模板。

检验操作程序,荧光定量PCR方法鉴定反应体系的配制（20体系）（PemixExTaqTMTaKaRa生物公司提供）2PCR反应混合物：

10/份上游引物（10M）：

0.4/份下游引物（10M）：

0.4/份探针（10mol/）：

0.4/份模板DNA：

2/份DDw：

6.8/份Total:

20,检验操作程序,荧光定量PCR方法鉴定荧光定量PCR反应条件：

9510s955s6020s结果判定：

Ct值在10-30之间且有典型的“S”形曲线,检验操作程序,谢谢,