细胞免疫组化.docx

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细胞免疫组化

细胞爬片的免疫组化

1.细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色定。

2.PBS清洗标本3次各1min。

3.冰丙酮固定15min（或4%多聚甲醛固定30min）。

4.空气干燥5min。

5.PBS清洗标本3次各2min。

6.0.5%TritonX-100（DPBS配）孵育1次20min。

7.PBS清洗标本3次各2min。

8.3%H2O2（试剂A）孵育15min。

9.DPBS清洗标本3次各2min。

10.封闭血清孵育（试剂B）20min。

11.一抗孵育（滴度1：

200，湿盒）4℃过夜或37℃60min。

阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液

12.PBS清洗标本3次各5min。

13.二抗工作液孵育（湿盒试剂C）37℃30min。

14.PBS清洗标本3次各5min。

15.试剂D（湿盒）37℃30min。

16、PBS清洗标本3次各5min。

17、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。

18、蒸馏水洗2次1min。

19、苏木素复染0.5~1min。

20、自来水洗返蓝。

21.梯度酒精脱水75，85，95，100%各3min。

22.二甲苯透明2次3min。

23、中性树胶封片。

注意事项：

1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：

a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；

b接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜，若密度太高5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；

2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。

3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）

4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜

5、TritonX-100表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。

细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？

1.如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些，但是做的时候要防止脱落。

如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在24孔，或6孔板里做才可以。

中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看细胞本身的荧光。

2.孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。

细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞贴在玻片上爬片。

3.我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦，偶这样做很少掉片。

先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上，由于液体的表面张力，细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概贴壁后，不同细胞贴壁时间稍有不同，大概6、7个小时，差不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下，到固定时细胞生长到80％左右比较合适。

偶是在盖玻片上做的，首先细胞要爬的匀一些，象dongwp战友的就很好。

然后倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。

擦干盖玻片的背面，在玻片背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，这一点很重要，在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。

细胞爬片的保存和抗原修复问题总结

　　1.细胞爬片可以用含叠氮钠PBS液保存.但不知道具体浓度,请告知.多谢!

!

　　加在液体中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为0.04--0.08%。

但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题!

　　2.louischenwrote:

但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了-20度，还能用于免疫组化吗?

!

　　应该没有问题，但是还是现作先染好些，以防抗原的丢失

　　3.mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。

其它建议用甲醇固定。

-20度保存

　　4.如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存两周没问题。

时间再长就没试过了。

　　5.丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置4度保存过夜应该是没有问题。

不要固定过夜，蛋白质固定过度，会影响抗原的暴露，影响免疫组化结果。

如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果，可考虑应用0.5%的triton-100孵育30分钟，渗透细胞膜。

如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会

　　6.丙酮固定后，PBS洗涤3次，即可保存至4度冰箱备用。

　　7.

（1）细胞爬片先用TBS洗3次，每次5分钟

（2）4%多聚甲醛固定，室温，20分钟

　　（3）70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80度保存。

2周没有问题的，我保存过2个月都有信号，不过还是保存时间短一点的好

　　8.我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以放了一个月后去拍,还是很好

　　9.细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS冲洗后，晾干，放在-20度保存一个月没有问题的。

　　10.细胞爬片，有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静置2min左右，弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70℃长期保存。

解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达室温时取出标本，再用PBS冲洗，在做以后的步鄹

　　11.我也做过细胞爬片的组化染色，不过没有遇到类似的问题。

细胞培养好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4度固定15分钟，自然风干。

室温保存几周内都可以用的。

我想这可能与抗原的类型有关，有的对氧化等损伤比较敏感，有的差一些。

最好避光保存在4度，同时尽量隔绝空气。

免疫荧光与普通DAB显色差别只再二抗的标记，样品的保存应该是没有多大差别的。

　　12.细胞爬片丙酮固定后-20度保存，现在要再做免疫荧光，将保存的爬片拿出37度复温然后常规操作就可以了

　　14.4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用无水酒精的，固定好后放-20度，2-3个月是没有问题的。

　　15.对于一般的细胞免疫组化，我的做法是：

细胞爬片用冰的纯丙酮固定20MIN，再在通风柜将丙酮吹干，—-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强，保存抗原的免疫活性好。

所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。

当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。

　　如：

1.多聚甲醛（常用4%）：

可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。

主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇（CD）、主要组织相容性抗原等

　　2.乙醇。

优点：

穿透性强、抗原性保存较好。

缺点：

但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解;染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度

　　3.甲醛（福尔马林）应用最广优点：

形态结构保存好，且穿透性强，缺点：

甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色;分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。

可造成假阴性的染色结果。

　　16.4度是不能保存这么长时间（1个月）的，如果抗原已被分解，再修复也没用!

　　17.弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70℃长期保存。

　　18.爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。

同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

　　将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。

注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在-20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

　　19.固定后放点PBS，然后放在4度冰箱中保存，我最长保存两个月的，然后再做免疫组化，应该没有太大的问题的。

　　20.固定后4度可以存放一周，-20度存放半年，我现在也要做这个，实验室老师教的。

　　21.四度放1周应该没问题的，你最好放在-20度，我在-20度放一个月都还出结果的.很多人作的片子很多，不可能一次作完，一个月没问题.

　　22.最佳的固定及保存方法：

（1）中性缓冲福尔马林（不必调pH）：

　　福尔马林（40%甲醛，用时加入过量碱式MgCO3中和）10.0ml

　　Na2HPO4.12H2o1.9653g

　　NaH2PO4.2H2O0.5460g

　　加0.85%NaCl溶液溶解，定容至100ml。

（2）细胞固定：

待细胞接近长成单层时，用镊子取出盖玻片，迅速于37℃PBS中漂洗2次，每次3-5秒，以清除血清。

　　（3）将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定30min。

　　（4）用镊子取出盖玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒，晾干保存于-20℃备用。

可长期保存，做实验时，取出片子，入PBS湿润后即可进行你的实验。

　　可以用于做免疫细胞化学（H.E.）或免疫荧光。

（本帖没有加分）

　　23.细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1个月内可以用.

　　24.skywalkerzzwrote:

过氧化氢处理这一步，用三蒸水稀释商品浓度为30%的过氧化氢，然后室温下玻片放在其中浸泡10min，是不是过氧化氢导致细胞严重脱片?

　　爬片应该用甲醇/双氧水，你的细胞极可能是过氧化氢导致严重脱片

　　25.本人比较喜欢用4%得多聚甲醛，20分钟很好用的。

保存的时候注意片子最好晾干，不要挤压，防止粘片和碎裂。

　　26.细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在4度，最长半年没问题。

　　27.1、用新鲜配制的预冷的4%多聚甲醛缓冲液室温固定15min，PBS（0.01mol/l,pH7.4）洗涤3遍后是否就可以进行免疫细胞化学染色了

　　2、爬片PBS（0.01mol/l,pH7.4）洗涤3遍后是否能保存，怎样保存?

　　1、洗过就可以做免疫组化了。

　　2、固定过后自然干燥，不要洗，-20度保存。

做之前再洗。

　　28.细胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。

细胞固定后可室温保存在丙酮中，不使之干燥。

　　29.如果是检测膜上的物质,好象不能用酒精,

　　30.适当密度后取出固定（丙酮-20固定10～20min），再进行免疫染色。

　　31.一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定15-20分钟，然后放-20度，没有问题。

　　如果细胞爬片是在24孔板或6孔板里进行，冷丙酮会腐蚀板子，最好4%多聚甲醛。

　　32.细胞爬片用纯丙酮固定10分钟，取出干燥后用锡纸包裹，-70度保存。

　　33.4%多聚甲醛固定后PBS水洗，自然干燥后用锡纸包裹，-20度冻存不超过1月。

　　34.如果细胞贴壁困难，可将片子先用纯血清挂一层，凉干后再养细胞。

　　35.可以买NUNC公司的专用细胞培养用盖玻片，商品名Thermanox™Coverslips。

高分子材料，耐高温灭菌，经过特殊表面处理，细胞容易贴附。

可以用剪刀任意裁剪，使用效果好。

　　上海生工有现货，不用国外定货。

我使用后，觉得效果比玻璃盖玻片效果好很多。

　　36.我们通常是把细胞玻片固定好后，用PBS冲洗干净，然后用酒精脱水（80%，90%，100%，100%酒精各一次，每次10分钟左右），然后放在烘箱里烘干，这是就相当于石蜡切片了，可以保存一定的时间。

　　这个方法我们试过的，保持一段时间后做，效果还是可以的。

免疫细胞化学染色操作规程

一、材料和

1、玻片：

须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。

2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。

3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。

4、0.01MPH7.4PBS

5、1%BSA-PBS（含0.05%Tween20）

6、AEC底物

（1）底物缓冲液（20X）PH4.6

醋酸（分子量60.6）30.6ml

Triton-100

醋酸钠3H2O（分子量136.1）66.68克

加蒸馏水到960ml，调PH到4.6，最后加蒸馏水到总体积1000ml

（2）AEC（20X）

AEC15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH（CH3）2分子量73.10中）

（3）0.6%H2O2（20X）

临用时，

（1）

（2）（3）各50ul，在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。

7、DAB（即DAB-4HCL）

（1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X）

（2）1MTris（20X），用HCL调PH到7.4

（1）

（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鲜配，避光，30分钟内有效。

溶解后（可加热到500C），加水合氯醛50克（水合氯醛ChloralHyclrate，分子量165.4），枸橼酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室温或40C保存。

8、苏木素复染液

苏木素1克

碘酸钠0.2克

钾矾50克

水1000ml

9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。

10、3%H2O2：

30%H2O21份，加9份双蒸水，临用时配。

11、细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板（见ICCprotocol04）

12、封片液：

1克明胶，溶于30ml350C水中，加入35ml甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。

二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断）

1、从冰箱取出细胞片或细胞板，置室温或370C10-15分钟，使恢复温度。

2、加3%H2O2，细胞片20ul/孔，培养板100ul/孔，使充分覆盖住细胞。

3、室温10分钟后，甩掉H2O2，用PBS轻轻淋洗2分钟。

用滤纸吸干细胞周围水份，96孔在滤水纸上扣干，但注意保持细胞湿润。

三、封闭

细胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），细胞板用2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔，置370C孵育30分钟后甩掉封闭液，不洗。

四、免疫化学染色

1、分别加一抗和所有对照一抗，细胞法10-20ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分覆盖细胞。

37℃1小时或4℃冰箱过夜；

2、弃去一抗，如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1次后，浸于100mL含PBST洗杯，漂洗（最好在慢速摇床上）3-5分钟，转入第二杯PBS（1000ml），如上法漂洗3-5分钟。

擦干细胞片周围水分，96孔板则倒掉一抗后，每孔加满PBST在摇床上摇洗3-5分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞湿润，反复3-4次；

3、加S.P（S.P法，即放大法）

（1）加已优选好的浓度的Biotin标记二抗，细胞片10ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分复盖细胞。

37℃温和孵育30分钟；

（2）按免疫化学染色“2”所述方法洗涤和擦干；

（3）加已优选好浓度的S.P，用量同“

（1）”，37℃孵育30分钟后按免疫化学染色“2”法洗涤及擦干；

4、间接法加二抗（不放大法）

方法同S.P法，但不用Biotin标记二抗，而改用HRP直接标记二抗。

并省略（3）步骤；

5、加底物显色

（1）、加足量的AEC显色液，充分覆盖细胞层，细胞玻片20ul/孔，板50ul/孔，置于37℃恒温箱孵育5-10分钟，一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到满意的结果（阳性对照显色程度为“+++”），用自来水即可终止反应；

（2）、复染：

苏木素染液（使用时间最好不超过两个月）加苏木素复染液1-2滴，1分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素，再浸于PBS中约30秒钟返蓝色，最后在蒸馏水中漂洗。

6、封片

洗后细胞片擦去周围水分，滴加1滴甘油—明胶封片液，加盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。

五、结果判断

KSHV阳性——诱导后BCBL-1细胞有10%-30%显红色，强度不一，未诱导BCBL-1阳性细胞（1-30%）

阴性——诱导和未诱导BCBL-1细胞完全不显色（排除边缘效应）

MCMV/HVMV阳性——感染病毒的细胞有病灶反应，显红色，强度不一，未感染细胞不显红色（排除非特异性染色）

阴性——感染细胞和未感染细胞不显红色

注意：

1、一抗、二抗的稀释采用1%BSA/PBS，Sterptavidin-HRP的稀释采用PBS

2、整个反应过程在湿盒中进行（细胞片）

3、洗涤时应使用染色缸（细胞片）六、说明

1、测血时一抗血清稀释度要求

项目KSHVMVMVHCMV其它

稀释度1:

50，1:

100,1:

2001:

50，1:

100,1:

2001:

100，1:

500,1:

10001:

100，1:

500,1:

1000

可融合标准1:

100阳性时1：

100阳性1：

500阳性1：

500阳性2、S.P法使用二抗的不同情况

项目MCMVHCMV其它

样品母、亚上清血清、母、亚上清血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清

一抗为IgG型，

Biotin标记二抗Biotin-AntimouseIgGF（ab`）2,SIGMA,CAT:

B6774

一抗为IgM型，

Biotin标记二抗Biotin-AntimouseIgGAM,ZYMED,CAT:

62-6440

稀释度1：

2003、间接法（不放大法）使用二抗的不同情况

项目MCMVKSHV

样品血清血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清

一抗为IgG型，

HRP标记二抗HRP-AntimouseIgGFc,1:

100,SIGMA,CAT:

A-0168

一抗为IgM型，

HRP标记二抗HRP-AntimousePOLYVALENT,1:

100,SIGMA,CAT:

A-0412

稀释度1：

1004、对照系统，必须要做的对照系统如下：

阳性对照：

标准一抗，阳性血清，阳性上清

阴性对照：

（1）阴性一抗对照：

小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆上清液

（2）阴性抗原细胞对照：

未感染病毒的细胞，每个待测及对照均须做阴性细胞对照

空白对照：

不加一抗，用1%BSA替代

无关对照：

与本项目无的第一