简单测定种子的生活力.docx

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简单测定种子的生活力

8种子生活力测定

Z—1概述

种子生活力（Seedviability）是指种子发芽的潜在能力。

种子生活力测定在农业生产上具有重要的意义：

①测定休眠种子的生活力。

许多植物种子因存在休眠，暂时不能萌发，因此发芽率很低，尤其是新收获的和野生性较强的种子，必须进行生活力测定，才能了解种子的发芽潜力，以便合理利用种子。

播种前对发芽率低而生活力高的种子，应进行适当处理。

种子检验时，若发芽试验末期有新鲜不发芽种子或硬实种子，也应接着进行生活力测定，以正确评定种子品质。

②快速预测种子的发芽力。

休眠种子可借助于各种处理措施打破休眠，然后进行发芽试验，但所需时间较长。

而种子贸易中，有时因时间紧迫，不可能采用标准发芽试验来测定发芽力，因为发芽试验所需时间更长，如小麦需8d，水稻需14d，某些蔬菜和牧草种子需2～3周，而多数林木种子则需要更长的时间。

在这种情况下，可用生物化学速测法测定种子生活力作为参考。

种子生活力测定方法有10多种，根据其测定原理可大致分为4类：

①生物化学法，如四唑测定法、溴麝香草酚蓝法、甲烯蓝法、中性红法和二硝基苯法等。

②组织化学法，如靛蓝染色法、红墨水染色法和软x射线造影法等。

③荧光分析法。

④离体胚测定法。

本节主要介绍四唑测定法、离体胚测定法、染料染色法和软x射线造影法。

Z—2生活力测定方法

一、测定原理

   有生活力的种子，其活细胞原生质膜具有选择透性，当种子浸入染料后，染料大分子不能进入活细胞内，所以胚部等活组织不能被染料染色，而死的种胚细胞因原生质膜丧失选择吸收能力，故可被染料染色。

二、测定方法

（一）染色法

1．靛蓝染色法

   此法适用于豆类、谷类、棉花、瓜类和林木等大粒种子的生活力测定。

所用试剂为靛蓝（或称靛蓝洋红），分子式为C18H8O2N2（SO5Na）2，系蓝色粉剂，能缓慢溶于水。

测定方法如下：

   （l）种子预处理：

将种子浸人30℃水中，水稻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等种子须先去壳再浸种，浸种时间因种子不同而异，小麦、大麦、大豆、豌豆和向日葵等为3h，燕麦、芝麻等4h，油菜、花生、棉籽等6h，蓖麻、红麻、大麻等7h、黍8h、水稻12h、玉米20h将充分吸胀的种子（100粒2次重复），沿胚中线纵切（如禾谷类）或剥去种皮（如双子叶种子），以备染色用。

（2）靛蓝染色：

将处理好的种子置于培养皿或小烧杯内，加入靛蓝溶液淹没种子，纵切种子，用0.1％溶液，剥去种皮种子用0.2％溶液。

染色时间禾谷类为15min，油菜、芝麻、红麻和大麻等30min，大豆、亚麻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等60min豌豆180min

  （3）观察鉴定：

取出染色后的种子，用清水冲洗后立即进行观察鉴定。

凡种胚不染色或染成浅蓝色的、胚根尖端或少部分子叶染色的，为有生活力种子；凡种胚全部染成蓝色的，或胚根、胚轴、胚芽、子叶等大部分染成蓝色的，为无生活力种子。

2.红墨水染色法

   其测定原理、种子预处理方法以及染色时间等与靛蓝染色法基本相同，只是所染成的颜色不同，死胚染成红色，活种子胚不染色。

测定时用刚开瓶的红墨水，加水稀释后使用，红墨水与水的比例：

小麦、玉米、大豆和棉花等为1：

60，大麦以1：

120为宜。

到达规定染色时间后取出种子，用清水冲洗并立即观察鉴定。

（二）其他方法

四唑测定法

（一）四唑测定法概述

   1．发展简史

   四唑测定法于1942年由德国H.Lakon教授发明，二战期间传入美国。

ISTA于1950年成立四唑测定技术委员会，1953年首次将四唑测定列入国际种子检验规程。

1974年，ISTA四唑测定技术委员会主席美国，为发展和推进四唑测定技术的标准化，主持编写《四唑测定手册》，其后经过多次ISTA会议讨论修改，于I984年正式公布发行。

该手册汇集了世界上最先进实用的种子四唑测定技术，以及650多个属和种的农作物、蔬菜、林木、牧草、药材和花卉种子的具体测定技术，堪称最具权威性的四唑测定参考。

种子生活力四唑测定技术经过不断研究和完善，目前已在全世界广泛应用。

   2．特点

   四唑测定具有原理可靠、简便快速、结果准确、不受休眠限制以及成本低廉等特点。

该法比按细胞膜选择透比不同的染色方法更为可靠，所击仪器设备和物品较少，程序比较简单，一般24h之内即能获得测定结果，不论是休眠种子还是非休眠种子均适用。

因此，该法是世界公认的最有效的种子生活力测定方法。

   3．适用范围

   根据国际种子检验规程规定，四唑测定适用于下列范围：

（1）测定休眠种子、收获后需马上播种的种子以及发芽缓慢的种子的发芽潜力。

（2）测定发芽试验末期末发芽种子的生活力，特别是怀疑有休眠时。

   （3） 测定种子收获或加工过程中的种子损伤（如热伤、机械损伤、化学伤害等）原因。

  （4）解决发芽试验中遇到的问题，查明不正常幼苗产生的原因和杀菌剂、种子包衣等处理的伤害。

   （5）查明种子贮藏期间劣变衰老程度，按染色图形分级，评定种子活力水平。

   （6）调种时时间紧迫，快速测定种子生活力。

（二）四唑测定法的原理

   有生活力的种子活细胞在呼吸过程中都会发生氧化还原反应。

四唑溶液作为一种无色的指示剂，被种子活组织吸收后，参与活细胞的还原反应，从脱氢酶接受氢离子，在活细胞里产生红色、稳定、不扩散、不溶于水的三苯基甲替。

化学反应式如下：

   依据四唑染成的颜色和部位，即可区分种子红色的有生活力部分和无色的死亡部分。

一般来说，单子叶植物种子的胚和糊粉层、双子叶植物种子的胚和部分双子叶植物的胚乳、裸子植物种子的胚和配子体等属于活组织，含有脱氢酶，四唑渗入后能染成红色，而种皮和禾谷类胚乳等为死组织，不能染色。

除完全染色的有生活力种子和完全不染色的无生活力种子外，还可能出现一些部分染色的种子。

判断种子有无生活力，主要看胚和（或）胚乳（或配子体）不染色坏死组织的部位及面积大小，而不一定在于颜色的深浅，颜色的差异主要是将健全的、衰弱的和死亡的组织区别出来，根据上述原理．鉴定种子胚的死亡部分，还可以查明种子死亡的原因。

   四唑染色是一酶促反应．因此反应不仅受酶活性的影响，还受底物浓度、反应温度、pH等因素的影响。

该酶促反应的适宜pH为6.1～7，高于者低于此pH反应不能正常进行，也就无法测定种子活力的高低。

因此．对于游离酸含量高的四唑试剂应当用缓冲液配制。

反应速率随温度的不同而变化．温度每升高10℃反应速率提高1倍，譬如20℃'时需要反应时间4h，30℃则需要2h，但反应最高温度不能超过45℃，染色时底物的浓度要一致，一般染色部位切开的种子，测定时四唑溶液的质量浓度为0.1％～0.2％，染色部位完整的种子，质量浓度为1%～2%。

种子预措时．采用的方法应根据种子的化学组成和种子结构确定。

     （三）四唑测定法应用的化学试剂

     1四唑

    四盐类有多种，最常用的是2,3,5一氯化（或溴化）三苯基四氮唑，英文名为2,3,5-triphenyl tetralium  chloride（orbromide）TTC（TTB）或TZ.分子式为C19H15N4Cl，相对分子量334.8亦称红四唑，为白色或淡黄色粉剂，溶点243℃，当达到约245℃就会分解，易溶于水，有微毒，试剂在光下会被还原成粉红色，因此需用棕色瓶盛装，且瓶外要裹一层黑纸。

同样．配好的四唑溶液也应装入棕色瓶里，存放在暗处，种子染色也需在暗处和弱光处进行。

   1996版《国际种子检验规程》规定，正常使用四唑溶液质量浓度为1．0％，但有些情况下，可使用较低或较高的浓度。

GB/T3543.7一1995规定，四唑染色通常使用质量浓度为0.1％～1.0%的四唑溶液，一般来说，切开胚的种子可用0．1～0．5％的四唑溶液；整个胚、整粒种子或斜切、横切或穿刺的种子需用1．0的四唑溶液。

  四唑溶液的pH要求在6.5～7.5范围之内，若溶液的pH不在此范围时，建议采用磷酸缓冲液来配制。

其配制方法为称取1g四唑粉剂溶解于100ml磷酸缓冲液中，即配成1.0%（或0.1%）的四唑溶液。

当用酸度计测定时，若四唑溶液的pH达不到要求，则可用NaOH

或NaHCO3稀溶液加以调节。

配好的四唑溶液应保存在棕色瓶中，一般有效期为几个月，如

存放在冰箱，则有效期更长。

已用过的四唑溶液不能再用。

   2．磷酸缓冲液

   为保证配制的四唑溶液pH在6.5～7.5范围内，通常采用磷酸缓冲液来溶解粉剂。

磷酸缓冲液的配制方法有两种，

（1）ISTA规程法：

先准备两种溶液。

   溶液I——在1000ml蒸馏水中溶解9.078gKH2PO4。

   溶液——在1000ml蒸馏水中溶解9.472gNa2HPO4或11.876gNa2HPO4·2H2O

   然后取溶液I2份和溶液II3份混合即成。

（2）AOSA规程法：

在1000ml蒸馏水中溶解5.45gNaH2PO4和3.79gNa2HPO4。

   3．乳酸苯酚透明液

   用于染色后的小粒豆类和牧草种子，使种皮、稃壳或胚乳变得透明，以便清楚地观察鉴定。

其配法为：

20ml乳酸+20ml苯酚+40ml甘油＋20ml蒸馏水。

   4．过氧化氢溶液

   用于某些牧草种子（如黑麦草、早熟禾、羊茅和鸭茅等）的预湿浸种，以加快吸胀和酶的活化。

 一般应用0.3%H2O溶液。

   5．杀菌剂和抗生素

   用微量的杀真菌剂和（或）抗生素加入四溶液或染色样品中，以延缓衰弱种子的劣变进程。

可应用0.5%青毒素等抗生素

6.胶液硬化剂

   有些种子浸种后，种皮表面出现胶黏物质而变得非常光滑．难以进行样品准备，可用

AIK（SO4）212H2O,K2SO4,A12（SO4）3等硬化剂处理。

如将种子浸在1％～2%AIK（SO4）2·12H2O溶液中5min,可有效地减少胶黏物质。

     （四）四唑测定法的程序

     参照1996版《国际种子检验规程》的规定．介绍四测定法的程序：

     1.试验样品

     从净度分析后并经充分混合的净种子中，随机数取100粒种子，4次重复。

如果是测定发芽试验末期休眠种子的生活力，则单用发芽试验末期所发现的休眠种子。

     2.染色前的种子准备

（1）种子的预湿：

预湿是四唑测定的必要步骤。

因为吸胀种子一般比干种子不易破碎并且比较容易切开或刺穿。

此外，预湿使活组织酶系统活化，可提高染色的均匀度、深度、鉴定的可靠性和正确性。

有些种子在预湿前还要进行预措处理，以利吸胀，如水稻种子需脱去秤壳，豆科硬实种子需刺破种皮等，但须注意，预措不能损伤种子内部胚的主要构造。

如果利用较高或较低温度进行预湿，则相应调整预湿时间，并将所采用的时间和温度填报在种子检验证书上。

预湿方法有以下两种：

   ①缓慢预湿：

按发芽试验所用的方法，将种子放在纸上或纸间吸湿。

该法适用于那些直接浸在水中容易破裂和损伤的种子，以及已经劣变的种子或过分干燥的种子。

有些种子，缓慢预湿达不到充分吸胀，有必要进一步在水中浸一段时间。

   ②水浸预湿：

将种子完全浸在水中，让其达到充分吸胀。

如果浸渍时间超过24h，则应换水。

部分植物种子在20℃下的预湿方式和最少预湿时间见表5一I，表5一2。

（2）染色前的种子处理：

许多植物的种类（表5一l，表5一2）在染色前需将其胚的主要构造和活的营养组织暴露出来，以利于四唑溶液渗透·便于正确鉴定。

可采用下列处理技术刺穿、切开种子或剥去种皮。

其刺、切方法见图5一1。

处理后的种子应保持湿润．直到每个重复都完成为止。

   ①刺穿：

对经过预湿的种子或硬实种子，可利用解剖针或解剖刀，刺穿种子的非主要部位。

   ②纵切：

所有禾谷类和禾本科牧草种子，像羊茅属大小种子或较大的种子，通过胚中轴的中部纵向切开，约达胚乳长度的3/4；无胚乳而具有直立胚的双子叶植物种子，通过子叶略离中轴的一半纵切．而不伤及胚中轴部分；胚被活的组织包围着的种子，可沿着胚的旁边进行纵切。

③横切：

用解剖刀、刀片、弯曲剪子或其他适当的方法，沿种子非主要组织横向切断。

禾本科牧草种子：

紧靠胚的上部横切，并将有胚的一端浸入四唑溶液。

   具有直立胚和无胚乳的双子叶植物种子：

从子叶末端部分横向切除1/3或2/5。

针叶树类种子：

横向切去两端一小部分，以保证能打开胚腔，但不能伤及胚太重。

④横剖：

横剖可替代横切，是切开但不切断的一种处理方法。

适用于小粒禾本科牧草种子（如剪股颖属、梯牧草属和早熟禾属）。

   ⑤胚分离：

胚分离可用于大麦、黑麦和小麦。

用解剖针在盾片的上部稍偏中心处刺穿胚乳，然后略略扭动，使胚乳纵裂．挑出带有盾片的胚，随即移入四唑溶液。

   ⑥剥去种皮：

当切开方法不适合时，必须剥去全部种皮以及其他被覆组织。

具有坚硬被覆物的种子，如坚果和核果等，可将种子或预湿后的种子劈开或敲裂．但要注意避免胚部受伤。

坚韧的种皮可在预湿后，用解剖刀或解剖针小心地将其撕开剥掉。

   3．四唑染色

   通过染色反应，能将胚和活的营养组织里的健壮、衰弱和死亡部分的差异正确地显现出来，以便进行鉴别．判断种子的生活力和活力。

   将准备好的规定数量种子放入适当大小的培养皿或烧杯中，特别细小的种子可用滤纸包起来放入容器里，然后加入适宜浓度的四唑溶液，以淹没种子为度，移置一定温度的恒温箱内进行染色反应。

恒温箱内要求黑暗或弱光，因为光线可使四唑盐类还原。

   染色时间因种子种类、样品准备方法、本身生活力的强弱、四唑溶液浓度、pH和温度等因素的不同而有差异。

其中温度的影响最大，在20～45℃范围内．温度每增加5℃，其染色时间可减少l/2。

部分植物种子在30℃下的染色时间见表5一1，表5-2。

种子染色结束后，倾去溶液，用清水漂洗准备鉴定。

规定的最适宜染色时间不是绝对的．可能随着种子条件而发生变化。

从已积累的经验来看．也可能在染色的较早或较晚阶段进行鉴定为宜。

   如果到达规定时间种子染色仍不够完全，可适当延长染色时间．以便判断染色不够充分是由四唑溶液渗入缓慢引起的，还是由种子本身的缺陷所致。

但要注意，染色温度过高或染色时间过长，也会引起种子组织的劣变，这样可能掩盖由地遭受冻害、热伤和本身衰弱而呈现不同颜色或异常的情况。

   有些植物种子要求在四唑溶液中加入微量的杀菌剂或抗生素（如0.01%环115防护剂或抗生素），以避免在染色过程产生带有黑色沉淀物的多泡沫溶液。

   4．鉴定前处理

   为确保鉴定结果的正确性，应将已染色的种子样品进行适当的处理，使胚的主要构造和活的营养组织更加明显地暴露出来，以便观察鉴定。

目前国际上采用的方法有：

（1）直接观察：

适用于染色前已进行了样品准备的整个胚、摘出的胚中轴、纵切或横切的胚等样品。

（2）轻压出胚：

适用于样品准备时仅切去种子的一部分，胚的大部分仍留在营养组织内的样品。

在鉴定前用解剖针在种子上轻压，使胚向切口滑出。

   （3）扯开营养组织：

适用于样品准备时仅撕去种皮或仅切去部分营养组织的样品。

须扯去遮盖住胚的营养组织或去掉切口表面的营养组织，使胚的主要构造完全暴露出来。

   （4）切去一层营养组织：

适用于样品准备时仅切去或切开种子上半粒或基部的种子样品。

须在适当的位置切去一层适宜厚度的营养组织，以便观察胚和活营养组织染色情况。

  （5）下胚中轴纵切：

适用于样品末经准备的种子，如有些豆类种子。

（6）沿种子中线纵切：

适用于样品准备时，仅除去种子外面构造或仅切去基部的种子，如五加科等种子。

（7）剥去半透明的种皮或种子组织：

适用于样品末加准备或仅切去基部的种子。

如大豆、豌豆等种子。

   （8）切去切面碎片或掰开子叶：

适用于切得不好或有些双子叶豆科种子。

   （9）剥去种皮和残余营养组织：

适用于样品准备时仅切去种子一部分的样品，如红花种子。

  （l0）乳酸苯酚透明液的应用：

在四唑染色达到适宜时间后，小粒种子用载玻片挡住培养皿的一边．留一条狭缝，沥出四唑溶液．注意不能溜出种子。

对于更细小的种子（如小糠草）等，则可借助管口比种子小的吸管吸去四唑溶液。

然后用厚型吸水纸片吸干残余的溶液．并把种子集中在培养皿的凹陷处，再加入2～4滴乳酸苯酚透明液．适当摇晃，使其与种子良好接触．马上移入38℃恒温箱保持30～60min，经清水漂洗或直接观察。

   5．观察鉴定

   四唑测定样品经染色和处理后，进行正确的观察鉴定是非常重要的。

测定结果的可靠性取决于检验人员对染色组织和部位的正确识别、工作经验和判断能力等综合运用能力。

观察鉴定的主要目的是区别有生活力和无生活力种子。

     一般鉴定原则是，凡是胚的主要构造及有关活营养组织染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的，为有生活力种子。

凡是胚的主要构造局部不染色或染成异常的颜色，并且活的营养组织不染色部分超过允许范围，以及组织软化的，为不正常种子。

凡是完全不染色或染成无光泽的淡红色或灰白色．且组织已软腐或异常、虫蛀、损伤、腐烂的为死种子。

不正常种子和死种子均作为无生活力种子．此外，胚或其他主要构造明显发育不正常的种子，不论染色或不染色，均应作为无生活力的种子．仔细的鉴定工作还可以鉴别出不同类型的有生活力或无生活力的种子。

部分植物种子的鉴定标准详见表5一1．5一2。

图5-和图5-3分别是小麦和大豆种子四唑染色鉴定标准的实例。

鉴定时，可借助于放大器具进行观察。

大、中粒种子可直接用肉眼或5～7倍放大镜进行观察鉴定，小粒种子最好利用10～100倍体视显微镜进行仔细观察鉴定。

鉴定时注意判断种子预措时胚部切偏和切面粗糙对观测结果的影响。

   6、结果计算及处理

     在测定一个样品时，应统计各个重复中有生活力的种子数，并计算其平均值。

重复间最大容许差距不得超过表5一3的规定，平均百分率修约至最近似的整数。

测定结果按规定格式填报。

对豆科的一些种须增填测定中发现的硬实百分率，硬实百分率应包括在所填报的有生活力的百分率中。

                   表5一3生活力测定重复间的最大容许差距

   若是测定发芽试验末期未发芽种子生活力，结果应填报在发芽试验结果报告的相应栏中。

   不同标准中四唑测定的一些差别

  GB/T3543.7—1995农作物种子检验规程对主要农作物及蔬菜种子生活力的四唑染色技术作了详细规定，其中对试验样品数量的规定是至少测定200粒种子，即可以用200粒、300粒、400粒。

这与ISTA规程规定用100粒4次重复和《四唑测定手册》认为可以用200粒，均有所不同。

（GB/T3543．7—1995规定四唑测定时．种子预湿温度为30℃或20～30℃．四唑溶液质量浓度在0.1%～1.0%．染色温度为35℃。

而ISTA规程中．预湿温度为20℃．四唑溶液质量浓度大多数种子采用1．0％，少数为0．5％，染色温度为30℃。

GB/T2930.5—2001牧草种子检验规程，对牧草种子、草坪草种子和饲料作物种子生活力的四唑测定方法作了详细介绍，其测定程序基本与国际规程相同，但所列牧草种子的种类比国际规程更为全面。

离体胚测定法

（一）概述

自1904年Hänning.E成功地培养了胡萝卜和辣根菜的离体胚以来，离体胚组织培养已有百年的历史。

该技术在植物育种中主要用于解决远缘杂种败育、种子休眠期过长以及快速繁殖等问题、Tukey1944年研究桃种子发现，未通过后熟种子和已通过后熟种子的胚在离体培养下生长速率一致，因此，认为胚胎培养法可用于快速测定这类种子的生活力。

目前，离体胚培养法已被广泛应用于木本植物种子的生活力测定。

离体胚测定的目的是，快速测定某些发芽缓慢或休眠期较长的植物种的种子生活力。

适用范围

     1996版《国际种子检验规程》规定，离体胚测定只适用于下列已规定具体方法的植物种：

（1）槭属（Acerspp.）[复叶槭（A．negundo）和鸡爪槭（A.palmatum）除外」。

（2）卫矛属（Euonymusspp.）。

 （3）梣属（Fraxinusspp）。

  （4）苹果属（mulusspp.）和梨属（Pyrusspp.）。

  （5）加州山松（Pinusmonticola）、扫帚松（P.Peuce）和北美乔松（P.strobus）。

  （6）瑞士石松（P.cemtbra）,大果松（I'.coulteri）,巴尔干松（P.heldreichii）,黑材松（P.jefreyi）、红松（P.koraiensis）和日本五针松（P．parviflora）。

 （7）李属（Prunus、spp）．欧洲甜樱桃（P.avium）、比西氏樱桃（P.bessey）、黄果酸樱桃（P.

 maheleb）、稠李（P.padus）、柳栋野黑樱（P.serotina）、美国稠李（P.virginiana）、杏（P.armeniaca）和桃（P．persica）等。

 （8）花揪属（Sorbusspp.）。

  （9）椴属（Tilia spp．）。

  对于原先已发过芽的种子和发过芽又失水干燥的种子，不适合采用此法。

 2．原理

   将离体胚在规定的条件下培养5～14d。

有生活力的胚仍然保持坚硬新鲜的状态，或者吸水膨胀、子叶展开转绿．或者胚根和侧根伸长、长出上胚轴和第1叶：

而无生活力的胚，则呈现腐烂的症状。

（二）离体胚测定法

XX文库-让每个人平等地提升自我   1．试验样品

   常用400粒种子。

由于在胚分离过程中可能有损伤的种胚．所以至少应从经净度分析后的净种子中随机取425～450粒种子。

根据胚的大小和放置容器的容量设定重复次数（如4×100或×50）

2．浸种前处理

   某些需要机械划破或化学腐蚀种皮的植物种子。

必须在浸种前进行适当处理。

一些果实外部的坚硬果皮也需去除。

   3、清水浸种

   按种子吸水速率不同，将种子放在自来水中浸泡24～96h。

水温保持在25℃以下，每天换水2次．以延缓真菌或细菌的生长以及种子渗出物的积累。

   4．胚的分离

   用解剖刀或刀片从吸胀种子中分离出胚，操作过程中应保持湿润。

为使胚处于无菌状态，可用70%乙醇擦净器具和台面。

分离时受损伤的种胚应去掉，并用试验样品中的多余种子替代。

属于下列类型之一的种子．在计算生活力百分率时，应计入总数中：

（1）空瘪果实或无胚种子。

（2）胚部遭虫害或在加工过程中受到严重损伤的果实或种子。

   （3）胚已严重变色、腐烂或死亡的果实或种子。

    （4）胚中子叶严重畸形的果实或种子。

5、置床培养

   将胚放在培养皿或发芽盒中的湿润滤纸或发芽纸上，置于20～25℃恒温下，每天至少光照8h，培养至14d。

每天应拣出腐烂的胚或明显带有真菌菌丝体的胚。

     如被霉菌严重感染，则须重新试验，并在胚分离前，先将果实或种子用5％次氯酸钠溶液浸15min，然后用水充分洗涤。

     6.观察鉴定

     经培养24h后，根据局部组织变色，将因分离受到机械损伤的胚与无生活力的胚区别开来。

若胚因分离造成损伤而难以鉴定时，则须进一步练习分离技术后，重新进行试验。

（1）下列类型的胚列为有生活力的：

①保持坚硬