极濒危树种的遗传拯救Word文档格式.docx
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理解遗传变异丧失的进程有助于制定种群和物种的管理策略。
森林中的树种也表现出对森林片断化的较大反应（Krameretal.2008;
Bacles&
Jump2011），表现在物种繁育系统和统计学特征上的脆弱（Ghazoul2005）。
例如，当种群处于片断化生境时，基因流受限的树种可能更易受到近交的影响（Jones&
Comita2008;
Kettleetal.2011）。
遗传拯救是一种对遗传上存在问题的种群通过利用移入新个体（或基因型）而减缓遗传变异丧失进而提高种群适应能力的辅助措施（Thralletal.1998）。
对一年生和短命的多年生植物的研究已经证实，对于以花粉为媒介的种群间基因流，引入一个新的个体到一个种群中可以增加适应性组分和种群的遗传变异，这对于小种群更为有效（Richards2000;
Newman&
Tallmon2001;
Tufto2001;
Bossuyt2007;
Willietal.2007）。
尽管长寿命树种受威胁的数量在不断增加，然而对于其潜在的遗传拯救的研究却很少，这可能是由于许多树种都普遍具有较高的基因流的原因（Petit&
Hampe2006）。
我们通过对一种极濒危（IUCN2010）特有种水母树的研究对这些问题进行探索，水母树在塞舌尔群岛上仅有90个成年个体分布在4个隔离的地方。
仅有一个最大的种群尚处于可更新状态，其余的种群仅由极少数个体组成。
这种在分类学上地位特殊的物种（Fayetal.1997）是许多塞舌尔岛特有的濒临灭绝的物种之一，但被认为是最需要优先保护的物种。
尽管在自然状态下处于片断化分布，水母树种群由于受到人为活动（火与入侵物种）的影响正处于进一步减小趋势。
此外，水母树被认为是许多濒临灭绝植物的典型，也是全世界8753种濒临灭绝的物种之一（Oldfieldetal.1998）。
许多热带种群都存在较高程度的生境分化，这也或多或少存在于片断化分布的由少数个体组成的亚种群中（Ghazoul&
Shiel2010）。
这些小种群尤其容易受到生境退化的影响，而这些种群的进一步隔离会由于数量较少而受到负面遗传效应的影响（Loweetal.2005）。
本研究的目的在于确定水母树由于小种群和隔离而受到遗传效应损害的程度。
此外，我们研究了通过潜在的遗传拯救来提高繁殖输出从而在这些小种群中实现成功更新。
我们希望对于受到人类活动的影响，种群间的基因流能够减缓由于小种群造成的影响，然而，当前的基因流由于种群衰退已不足以维持现存种群间的连通。
在这种情况下，我们提出了以下几个问题：
（1）水母树是否在遗传学上已受到损害？
（2）剩余种群的遗传结构如何？
（3）在什么情况下当前的基因流能够连通当前的种群？
为了回答上述问题，我们采集了现存的4个种群中的所有成年个体以及在最大种群中的大约25%的幼树，由此确定基因流中的种子流和花粉流，同时估算历史的基因扩散。
最后，我们回答了遗传拯救是否能够在小的隔离种群中增加适合度。
我们通过受控的花粉实验来确认，与种群内杂交相比，将大种群的花粉授于小种群是否能够增加诸如坐果率、结实率、萌发率以及幼苗存活率等繁育系统适合度。
材料与方法
研究的物种和种群
水母柱树（金莲木科）是一种小型的但寿命较长的树种，是塞舌尔群岛中马埃岛的特有种，以前曾为水母柱科中仅有的一种，现在被划入金莲木科（Fayetal.1997;
Bremeretal.2009）。
由于其果实形态与水母较象，所以大家普遍称之为水母树。
水母柱树通常生长在花岗岩基质的特殊生境中，在其生长的周边地区至今没有其发现的记录。
水母柱树天然的片断化分布反映了岛屿植物分布的特点。
自从18世纪早期人类开始在塞舌尔群岛上定居以来，许多特有的物种其种群大小不断下降。
在马埃岛上许多特有物种至今保存相对完整，这可能是由于这些珍稀的特有种能够忍受干旱严酷的环境，从而使得许多特有的物种能够在这个避难所中生存下来。
然而，岛屿上的一些种群由于入侵物种和火灾的影响已经基本上消失了。
现在，仅有90个水母柱树成年个体存在：
78个在Bernica，7个在Sebert山，3个在Copolia，2个在Jasmin山，这些生境大约有1公倾大小（Fig.1）。
虽然这些小种群中的水母柱树也会结果，但均没有发现幼苗，而不能更新的原因至今尚不清楚。
现在仅有一个地方的水母柱树能够成功更新，那就是Bernica，在那里幼苗可以在岩石表面生长。
先前的研究表明，在马埃岛的另外一处地方有水母柱树存在，但是本研究的野外调查并没有发现其它的种群存在。
水母柱树的雄花和两性花在同一花序中共存，而且开花是同步的。
花粉由本地的和外来的蜜蜂（主要为东非蜜蜂）、黄蜂以及苍蝇传播。
在此项研究之前，对这一物种繁育系统的研究至今未见报道。
每一个果实中有大约40颗小有翼的种子（2mm长，1mm厚），易于进行风力传播。
仅Bernica的种群能够更新可2006年采集到156棵籽苗和幼苗得到证实。
采样和遗传分析
在2009年，我们从所有已知的4个种群中90个水母柱树个体中采集叶片用于DNA的提取，另外还采集了Bernica的39个幼苗。
采集的叶片马上置于硅胶中进行保存。
DNA采用QIAGENDNeasy96PlantKit进行提取，方法依照产品说明书。
所有的样品用10个核微卫星位点（B107,C107,D12,D118,D6,B112,A9,B8a,A4,A7）进行分析，详细信息见Finger（2009）。
采用ABI3730测序仪进行片段分析，Genemapper3.5软件进行基因型分析。
两两位点间没有检测到显著的连锁不平衡。
因此，利用全部的10个微卫星位点作进一步的多位点分析。
遗传多样性和近交的估算
采用MICRO-CHECKER（VanOosterhoutetal.2004）程度检测存在的无效等位基因（Selkoe&
Toonen2006）。
等位基因数（NA），有效等位基因数（NE），等位基因频率以及特有等位基因数（PA）采用GenAlEx6（Peakall&
Smouse2006）进行计算。
利用FSTAT2.9.3.2（Goudet1995）计算等位基因丰富度（RS）。
连锁不平衡、观测杂合度和期望杂合度（HO,HE）以及近交系数（FIS）采用Arlequin3.5（Excoffieretal.2005）进行计算。
由于本研究是对全部的个体进行采样，所以不存在种群间比较时的采样误差（Leberg2002）。
对NE,HO,HE,RS的方差分析应用R语言2.10.1版本（RDevelopmentCoreTeam2010）进行。
物种遗传结构的估算
总的FST值利用Arlequin3.5进行计算。
采用FSTAT计算种群间遗传分化的两两之间的FST值。
为了检测所有现存地理种群间的关系，我们对所有个体采用STRUCTURE（Pritchardetal.2000）软件进行Bayesian聚类分析。
计算共运行100次，10个聚类每个进行10次（K1toK10）。
对于每一次运行，burn-in和simulationlength分别为150000和500000。
由于K值在其它研究中有所不同，所以本研究计算ΔK值（Evannoetal.2005）。
计算公式为：
ΔK=（[mL（K+1））2mL（K）+mL（K）1）]）/SDL（K），L（K）为对数值，K为矫正的聚类数，m为平均值，SD为标准差。
估算种群内的空间遗传结构和个体间的关联度
在最大种群（Bernica）中，利用Mantel检验和SPAGEDI1.3（Hardy&
Vekemans2002）计算空间遗传结构，检验空间距离和多位点同源关系（F）无相关性的零假设。
为了形象的表示FSGS（小尺度空间遗传结构）的结果，F值共设计了15个距离等级。
距离等级的范围为：
从0–10m到200–280m，10-m间隔于0–100m,20-m间隔于100–140m,30-m间隔于140–200，180-m间隔于200–280。
同时也计算所有种群中所有成年个体中位点间的关联系数F（Loiselleetal.1995）以及估算每一个种群的平均关联系数值。
利用亲本分析估算基因流
通过对39个幼苗的多位点（10loci）基因型分析，利用CERVUS3.0对全部的90个成年植株进行最大似然法排除分析，由此确定两个最可能的亲本（Marshalletal.1998;
Kalinowskietal.2007）。
采用所有成年植株的等位基因频率进行父本分析，相关的设置如下：
10000次循环；
最小位点数设为5，双亲未知；
所有的成年个体都设为幼苗的候选双亲；
1%的可能位点错配率，以及87%的位点基因型比例。
候选双亲的比例设为99%，这是在我们认为所有已知个体的基因型都知道的前提下。
LOD分值标准设定为95%和80%。
花粉的扩散距离的推测根据每一棵幼苗最大可能双亲之间的距离。
种子扩散距离的计算为幼苗到它们关系最近亲本的距离（Dow&
Ashley1998;
Baclesetal.2006;
Nakanishietal.2009），这是基于种子扩散距离要小于花粉扩散距离的假设。
为了比较，我们也计算了种子扩散距离中到最远母树的距离。
通过花粉实验的遗传拯救证据
为了检测种群间花粉扩散对适合度的影响，我们应当对所有现存种群间进行间实验。
然而，种群开花是不同步的，同时选址和树的位置受到限制，我们的实验只能选择一个较为容易的种群。
在2009年，在Sebert山的种群中的3个个体中，我们选择了5–10个花序，每个花序中有10–30朵花用于花粉实验。
在两棵树上（1-005and1-007），每棵树用了10个花粉袋，在第三棵树上（1-006）用4个花粉袋。
在每一个袋中进行4种处理：
（1）自交，所用的花粉来自于同一棵树的花中；
（2）种群内的杂交，所用的花粉来自于Sebert山的另外一棵植株；
（3）种群间杂交，采用来自于Bernica的4到5棵树上的混合花粉；
（4）未经人工处理（没有授粉）。
作为控制，我们决定将未经人工处理的花置于花粉袋之外，因此可接受传粉者的授粉。
花粉的转移刷取雌雄同体植株中雄花的花柱。
不同处理的花进行单独标记。
总计有466朵花用于种群间、种群内以及自交处理的授粉，795朵没有授粉，从2棵树上采集了23个果实用于受控实验。
花粉袋一直保留至果实成熟采集。
将成熟的种子分为可育的（成型并饱满）或者是不可育的（成型但是空的）。
为了确定每一个授粉处理的适合度值，我们记录了坐果率（受处理的花发育成果实的比例）、可育种子数（可育的种子占所有成型种子的比例）以及产种率（可育的种子占胚珠数量的比例）。
可发育种子最后播种在马埃岛的生物多样性培育中心，记录萌发数。
总计播种5218颗种子：
18颗来自于自交处理，1780颗来自于种群内杂交，2296颗来自于种群间杂交，391颗来自于未授粉处理，733颗来自于对照。
种子的萌发在未经施肥的土壤中进行。
我们采用托盘进行种子的萌发实验，当幼苗高度至少达2cm时再重新进行移栽。
记录萌发日期和死亡日期用于计算种子存活率。
确认花粉处理与亲本分析
在野外的花粉实验中，非计划中的花粉转移可能会导致一定程度的污染。
为了定量污染的程度，确定我们的处理对遗传拯救的作用，我们对所有经授粉处理后萌发的幼苗进行基因型分析和父系比对。
我们利用CERVUS3.0进行最大似然法分析，将所有成年个体作为候选者并给出确定的母本，从而确定最有可能的父本。
我们通过父本分析的遗传矫正处理作为分析遗传拯救的基础。
数据分析
花粉实验的数据分析在R,version2.10.1（RDevelopmentCoreTeam2010）中进行。
我们采用一般的线性混合效应模型（GLMM）中的二项式误差分布来分析坐果率和结实率。
GLMM可用于巢式实验设计，其中包括了我们在树上授粉包在内的随机效应（Bolkeretal.2009）。
我们采用来自于lme4包的lmer功能（Bates2005）。
由于每一棵树上花和果实的数量不同，结实率的数据也是不平衡的。
我们采用cbind功能对不平衡的数据进行稳健的分析（Bolkeretal.2009），由此根据采样大小来计算坐果率和结实率。
我们采用两种模型：
处理上具有固定影响的主效应模型确定自交的水平，完整模型的处理（仅种群内和种群间杂交）以及TreeID作为固定效应来看待遗传拯救的问题。
模型的选择是基于AkaikeInformationCriterion（AIC），同时最小的AIC值决定最小的可适用模型。
经过分析，我们决定种子从自交和无花粉处理中的移除，以此增加我们模型的可信度，同时我们主要的兴趣在于种群内和种群间杂交的比较。
由于只有从2棵树上采下来的23个果实可用于控制实验组，我们对23个果实的结实率进行了随机取样，不将其放回，同时根据辅助程序重复取样10000次（Efron&
Tibshirani1998）。
受控果实的结实率与辅助程序的平均值和由此估算的两个处理的置信区间进行比较。
苗圃中种子萌发的存活率和幼苗的基因型的计算采用R进行（RDevelopmentCoreTeam2010）。
我们采用核查后的数据，1代表幼苗在萌发过程中死亡，0代表在整个实验过程一直存活。
采用Weibull存活回归参数（表示随着年龄降低的死亡风险）。
结果
遗传多样性与近交
在物种水平，10个位点共得到2到15个等位基因，共得到86个等位基因。
所有位点和种群的遗传多样性比较见表1。
总体来说没有检测到显著的近交（FIS）（0.014,P=0.316）。
HE值的范围从Jasmin山种群的0.26（±
0.09SE）到Bernica种群的0.63（±
0.05SE）。
基于两个二倍体的个体，等位基因丰富度的范围从Jasmin山种群的1.70（±
0.26SE）到Copolia的2.73（±
0.13SE）。
Bernica具有最大的等位基因多样性和最高的特有等位基因数（20）。
遗传分化
总体的FST值为0.15（P<
0001），表明15%总的分子变异存在于种群间，85%存在于种群内。
绝大多数种群两两之间的遗传距离（Nei1978）值差异极显著（表2），地理距离最远的Sebert和Jasmin种群间遗传距离较大（0.36,P=0.058;
13.5km），而地理距离较近的Bernica和Copolia遗传距离较小（0.10,P=0.008;
2.5km）。
STRUCTURE分析显示有4或5个独立的遗传聚类，其中K4和K5为Bernica中的亚结构。
这一分析也区别出其它的3个种群，这与当前的地理结构是相一致的。
种群内的小尺度空间遗传结构和同源关系
Bernica的成年植株中检测到显著的小尺度空间遗传结构（FSGS）（Fig.2），表明空间距离与同源关系具有显著的关系。
在50m的等级范围内，同源系数（F）与0差异显著（P<
0.001）。
Bernica中所有个体的个体间同源系数的平均值与0差异不显著（F=0.004±
0.002SE）。
在Copolia，个体间同源系数较高（F=0.17±
0.047SE），但更高的值出现在Sebert（F=0.41±
0.029SE;
21pairs）和Jasmin（F=0.57;
1pair）种群中（Fig.2）。
当前的花粉和种子扩散
利用亲子关系鉴定，我们可以在95%的置信区间上区分出所采集的39个幼苗。
现实的花粉扩散距离介于2.9m到207m，其中将近一半的幼苗低于25m（Fig.3a）。
假定最近的亲本总是母树的话，Bernica中81.6%的幼苗出现在母树周围的50m内，总体扩散距离为36.5m。
甚至假定最远的亲本为母树的话，所有幼苗中的76%出现在100m范围内（Fig.3b）。
利用花粉实验的遗传拯救
结果率和结种率
种群间杂交的结果率（0.86±
0.06SE）要显著高于种群内的杂交（0.72±
0.09SE;
z=-1.93,P=0.05）。
自交和未经花粉处理的结果率较低（分别为0.16±
0.07SEand0.10±
0.03SE）。
结种率包括种群间杂交（0.37±
0.02SE）和种群内杂交（0.32±
0.02SE），虽然种群内杂交中有1棵树的结种率较低，容易在比较中产生混淆，但两者差异不显著（z=-1.61,P=0.10）。
种群间杂交和种群内杂交的平均结种率与接受花粉的受控组差异不显著（受控组:
0.46;
种群间杂交:
0.44,bootstrapped95%CI0.35–0.52;
种群内杂交:
0.48;
bootstrapped95%CI0.40–0.55）。
自交和未经花粉处理的结种率较低（分别为0.003±
0.001SEand0.01±
0.01SE）。
在所有植株中，种群间杂交中可发育的种子所占比例（为成熟种子中的一部分）较高（0.77±
0.03SE），其显著高于种群内杂交（0.52±
0.03SE）（z=-10.7,P<
0.0001;
TableS1）。
与结种率不同，不同处理的相互间作用效果差异不显著。
受控组的平均可发育的种子也比种群间杂交的低（受控组:
0.79;
0.92,bootstrapped95%CI0.86–0.96），与种群内杂交接近（受控组:
种群内杂交:
0.77;
bootstrapped95%CI0.72–0.83）。
自交的和无花粉处理的可发育的种子率较低（分别为0.03±
0.01SE和0.07±
发芽和存活率
在Sebert采集的全部种子发芽率较低。
种群间杂交的种子（49棵幼苗,2%发芽率）和种群内杂交（32棵幼苗,2%发芽率）具有较低的发芽率，其概率低于自交处理的种子（4棵幼苗,22%;
P<
0.001），虽然自交所得到的种子数较少。
种子萌发后的平均存活时间分别为：
种群间杂交190±
18.5SE，种群内杂交155±
14.8SE，自交处理101±
60.1SE，只有种群间杂交和种群内杂交间的差异显著（种群间杂交和种群内杂交:
z=-1.95,P=0.05;
种群间杂交和自交:
z=-1.71,P=0.09,种群内杂交和自交z=-0.82,P=0.41）。
无花粉处理的果实和受控组的种子均没有萌发。
讨论
本研究为遗传侵蚀和近交导致处于种群隔离和基因流受限的珍稀树种增加了灭绝的风险提供了证据，尽管其在自然状态下处于片断分布。
我们的结果表明，遗传拯救可以缓和这些影响，使得基因流受限的受威胁树种后代的生存能力增加。
水母柱树是否存在遗传衰退
水母柱树3个小种群具有较高水平的遗传多样性，表明尽管这些种群规模较小且处于隔离状态，但这些种群对于保护物种的遗传多样性非常重要（也可见Schneller&
Holderegger1996）。
这可能是类似隔离和濒危物种的一般特征，如同水母柱树成年种群间的遗传多样性格局，处于自然隔离、稀少、热带、特有的岛屿树种（Dutechetal.2004;
Uenoetal.2005;
Kettleetal.2007;
Bornetal.2008;
Sebbennetal.2011）。
相似的结果在温带植物中也可见到。
例如，地中海Minorcan栓皮栎仅存67个个体，但其遗传多样性较高（Lorenzoetal.2009）。
较高的遗传多样性也可保留在曾经广泛分布但在近期种群快速减少和片断化的物种中（Yaoetal.2007）。
类似的，如来自于非洲Madagascar的稀少的棕榈树（如Beccariophoenixmadagascariensis），尽管由于人类活动导致其种群减少和片断化，但其仍保留着较高的遗传多样性（Shapcottetal.2007）。
与此相反，也门山谷中处于自然片断化但快速减少的棕榈树却观测到较低水平的遗传多样性（Shapcottetal.2009）。
水母柱树3个种群具有较高的遗传多样性表明，这些种群没有经历持续的遗传瓶颈和随机遗传漂变。
然而，Bernica种群中幼苗和成体间的遗传多样性比较表明，成体中的稀有的等位基因在幼苗中是不存在的（TableS2）。
连同在最小种群（Mt.Jasmin）中具有较低的遗传多样性表明，种群有正在经历早期的遗传侵蚀征兆。
Copolia和Sebert的成年种群必需具有和当前Bernica成年种群相近的规模才能够维持观测到的等位基因丰富度。
这表明，种群规模的减少已在最后一代的成年个体中出现。
虽然本文所用的核微卫星位点不能评估整体的适应能力或者局部的适应能力，我们的结果为这一进程（遗传漂变和近交）提供了早期的警告，这可能导致适应能力的降低进而影响物种长期的生存能力（Reed&
Frankham2003）。
利用中性的遗传标记评估遗传多样性和基因流连同花粉实验能够使我们将后代的生存能力与种群间的基因流联系在一起。
近年来保护基因组学的进展可以让我们更具体的检测诸如水母柱树那样受威胁树种的适应特性（Ekblom&
Galindo2010;
Ouborgetal.2010;
Tautzetal.2010）。
结合常规的栽培实验和后代特性，这些信息可以帮助这些寿命较长的植物与遗传拯救和子
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