细胞生物实验报告.docx
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细胞生物实验报告
细胞生物实验报告
细胞生物学
实
验
论
文
年级：
2012级师范2班
姓名：
***
学号：
***************
指导老师：
***
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析
（西南大学生命科学学院重庆400715）
摘要：
细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术，掌握细胞培养技术有利于我们掌握一种非常重要的实验技术方法。
本次实验通过用人体外周血淋巴细胞为材料，进行PHA处理然后再37℃下培养72小时，并在离培养终止3~4小时添加秋水仙素处理，然后经过低渗离心固定的反复操作，将细胞收集以及处理成合适的装片，然后通过冰片滴片的方式，再由Gemesa染液染色，再镜检，找到含46条染色体合适的细胞，再用显微拍照技术拍照，得到的图片经过简单处理，剪切，并测量数据，最后得到核型分析图谱。
关键词：
细胞培养；PHA；人体外周血淋巴细胞；染色体装片制备;核型分析
综述：
细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术，也是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验,它为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。
细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
近年来发展起来的核移植、细胞杂交、DNA介导的基因转移以及一些物理图谱的建立，也都需要与细胞培养紧密结合【1—2】。
人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram）是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotypeanalysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1材料：
人的静脉外周血（男女各2ml，在校医院添加肝素钠抽取血样）
1.1.2实验工具：
恒温培养箱
（1）、电冰箱
（1）、高压灭菌锅
（1）、离心机
（1）、普通光学显微镜（7）、显微摄影的照相机
（1）、培养瓶（4）、离心管（4）、移液枪
（2）、胶头（4）、滴管（4）、烧杯（4）、试管架、插管（5）、试剂瓶（4）,载玻片（10）。
1.1.3试剂：
肝素、完全RPMI—1640培养粉、秋水仙素、0.075mol/lKCl、植物血球凝集素（PHA）、青霉素、链霉素、小牛血清、秋水仙素、无水酒精、冰醋酸、Giemsa粉末、甘油、甲醇、1/15mol/L的PH为6.8的磷酸缓冲液。
1.2方法
1.2.1人体外周血淋巴细胞的培养
①接种和培养：
在无菌工作台上，打开培养瓶的瓶塞，加入3ml培养基，然后再加入母液为5mg/mLPHA男1女1各加45ul使其终浓度为75ug/ml，男2女2各加50ul使其终末浓度处于83ug/ml,再向每瓶加入0.3mL血液，轻轻摇匀，置37℃培养箱中培养72h。
②培养细胞的秋水仙碱处理：
培养终止前3h~4h将新鲜配制的50μg／mL秋水仙素工作液注入培养瓶中，每瓶40ul使其终浓度为0.6ug/ml，轻轻摇匀，放回培养箱中，继续培养至72h。
1.2.2制片及染色体标本制备
①低渗及离心：
小心从培养箱取出培养瓶，用吸管将培养后的血细胞混匀，并移至离心管内，以1000r／min离心10min，吸弃上清液，加入8mL37℃预热的0.075mmol／L氯化钾低渗液，用吸管上下吹打约10次，使细胞悬浮于低渗液中，置37℃水浴箱中，温育20min，，使低渗充分。
②固定：
低渗终止后，加入新鲜配制的卡诺固定液（甲醇：
冰醋酸＝3:
1）1mL，预固定2min，打匀，放入离心机内，以1000r／min离心8分钟min，倒掉上清液，继续加入固定液5mL，用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打混合细胞悬液。
室温下静置20min，以1000r／min离心8min，倒掉上清液。
③重复固定：
再加入固定液５mL，用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打成混合细胞悬液，室温下静置20min，以1000r／min离心8min，倒掉上清液。
④制片：
向离心管中加入固定液0.5mL，用吸管轻轻吹打成混合细胞悬液。
滴片时，先用吸管吸取少量细胞悬液以1.8m高的距离滴至事先冰冻的洁净载玻片上，每片2~3滴，随即对准玻片吹一口气，以协助细胞的分散，然后在乙醇灯火焰上方过火5秒，最后在烘箱中烘干。
⑤染色：
将晾干的玻片标本用Giemsa染液染色20min（用1份Giemsa原液加9份pH6.8的磷酸缓冲液），自来水缓缓冲洗玻片，并烘干，镜检。
⑥结果观察：
取制备好的健康人体染色体标本，先用低倍镜观察，选择染色体分散良好、无重叠的分裂中期细胞，转换油镜下仔细观察分析。
1.2.3染色体组型分析
①找好的染色体：
在显微镜下找出染色体分散良好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄并确定数目：
２n＝４６
②拍照分剪：
将显微拍摄放大的照片上的一个细胞的全部染色体分别一条一条剪下。
③测量与计算:
①将照片上的染色体进行编号,用直尺测量每一染色体的长度,此长度为其绝对长度。
②计算每一染色体的相对长度,即每条染色体的长度除以全部染色体的总长度。
③测量染色体短臂和长臂的长度,并求出其臂比,即长臂长/短臂长。
④将测量的数据记入表相应栏内
④配对:
根据染色体的相对长度、臂比、次缢痕的有无和位置、形状大小,随体有无,着丝点位置,将其相同表型的染色体从照片上剪下来,将其同源染色体配成对。
⑤排列：
染色体的排列通常是从大到小,按长度顺序编号,等长的染色体,把短臂长的放在前面,具有特殊标记的如具随体的染色体,一般排在最后,性染色体要单独列出。
⑥分类:
以臂比数值确定着丝点位置,据此可将染色体分成五种类型,即
正中部着丝点染色体（M）臂比（长/短）1.0。
中部着丝点染色体（m）臂比（长/短）1.0-1.7
近中着丝点染色体s（m）臂比（长/短）1.7-3.0
近端着丝点染色体（st）臂长（长/短）3.0-7.0
端部着丝点染色体（t）臂比（长/短）7.0以上
将所得的各项数据填入下列表中
组号
染色体号
相对长度
形态大小
长臂
短臂
臂比
类型
⑦粘贴拍照：
将配对排列好的染色体组型,贴在白卡片纸上,进行拍照,制成染色体组型图。
注：
对于任何一个染色体的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：
相对长度=单条染色体的长度/（单倍体常染色体+X或Y染色体）的总长度×100%
臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）
着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）
人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
其中22对是男女共有的染色体，一对为男女所不同的性染色体，男XY，女XX。
人类染色体组型
群组号
染色体号
形态大小
着丝粒位置
随体
次缢痕
鉴别程度
A
1~3
最大
m
无
常见1号
可鉴定
B
4~5
次大
sm
无
不易
C
6~12+X
中等
sm
无
常见9号
难鉴定
D
13~15
中等
st
有
偶见13号
难鉴定
E
16~18
较小
16m,17m,和18m
无
常见16号
可鉴定
F
19~20
小
m
无
不易
G
21~22+Y
最小
st
有，Y无
难鉴定
2.结果分析
用第二组的女生图片做的核型分析
我们组在油镜下用相机拍的男生图片和用它做的核型分析
女生染色体核型分析数据
群组号
染色体号
相对长度
形态大小
臂指数
着丝粒指数
着丝粒位置
A
1
7.84%
最大
1.12
47.10%
M
A
2
6.65%
最大
0.88
42.20%
M
A
3
5.60%
最大
1.24
44.70%
M
B
4
5.90%
次大
2.33
30.00%
Sm
B
5
4.55%
次大
1.58
38.70%
M
C
6
5.60%
中等
1.24
44.70%
M
C
7
4.70%
中等
1.48
40.60%
M
C
8
4.85%
中等
2.3
30.30%
Sm
C
9
4.25%
中等
1.9
34.50%
Sm
C
10
4.10%
中等
1.16
46.40%
M
C
11
4.40%
中等
1.5
40.00%
M
C
12
3.80%
中等
1.92
34.10%
Sm
C
X
5.60%
中等
1.57
38.90%
M
D
13
4.40%
中等
1.5
40.20%
M
D
14
3.60%
中等
2.5
29.10%
Sm
D
15
3.40%
中等
7.5
12.80%
St
E
16
3.70%
中等
t
E
17
3.05%
中等
1.35
42.70%
M
E
18
3.25%
中等
1.45
40.80%
M
F
19
2.90%
小
1.5
40.00%
M
F
20
2.65%
小
t
G
21
2.40%
最小
1.33
43.70%
M
G
22
2.10%
最小
t
男生染色体核型分析数据
群组号
染色体号
相对长度
形态大小
臂指数
着丝粒指数
着丝粒位置
A
1
4.20%
最大
1.27
0.442
M
A
2
3.80%
最大
1.29
0.436
M
A
3
3.00%
最大
1.14
0.167
M
B
4
3.30%
次大
1.42
0.412
M
B
5
3.30%
次大
2.4
0.294
Sm
C
6
2.40%
中等
2
0.033
Sm
C
7
2.40%
中等
1.4
0.417
M
C
X
2.10%
中等
1.12
0.455
M
C
8
2.10%
中等
1.75
0.364
Sm
C
9
2.40%
中等
2
0.333
Sm
C
10
2.40%
中等
2
0.333
Sm
C
11
2.10%
中等
2.67
0.273
Sm
C
12
2.40%
中等
1.4
0.417
M
导致细胞培养失败的原因很多，但在培养条件相对恒定的环境中主要因素是抗生素类药物的干扰其可能对淋巴细胞的转化产生抑制作用。
培养中出现凝血和溶血与培养液的PH值PHA和血中的肝素等的抗凝剂有关，凝血和溶血对细胞培养有一定影响但也有培养成功的所以不要放弃培养。
抗凝血剂的选择也很重要，应选能被直接用于人体静脉注射的最好，比如肝素或者肝素钠，而EDTA为金属离子螯合剂对淋巴细胞有一定毒性对温度对细胞培养也是很重要的。
秋水仙素是纺锤体的抑制剂，如果秋水仙素的使用浓度过高或使用时间过长，虽然得到的细胞分裂相很多但是染色体过于的浓缩，若溶度过低或者处理时间过少则分裂相少。
离心时收集细胞般离心速度是1000r／min低渗后细胞膨胀若离心速度过大会提前破裂，染色体丢失严重影响细胞计数和染色体核型分析【4】。
用于显微分离的染色体标本制备方法与常规制片基本相同,只是固定液中酸的比率要适当降低,以减少酸对DNA的破坏,宋文芹在制片中用70%酒精取代了传统的固定液。
为使细胞质背景清楚,崔丽华等采用去壁低渗法,提高了染色体分离的效率。
但无论用什么方法,都要使染色体尽量散开,易于识别目标染色体【6】。
核型是根据细胞分裂中期浓缩的染色体形态结构建立的,核型模式图通常是将显微拍摄的染色体照片剪贴、整理、绘制而成。
不同的物种具有不同的核型,因此核型是区别物种的基本遗传学依据,也对分子生物学的研究具有指导意义。
对于核型分析现在并不停留在染色体形态分析时期，随着科学技术的发展出现了显带技术。
显带技术主要包括荧光显带技术和Gimesa显带技术。
1968年T.Q.Casperson发明了Q-带技术。
1971年，Arrighi发明了Gimesa显带技术。
在对染色体测量和分析上也有一些新技术出现，如有的学者开始使用Photoshop等软件对染色体图片进行处理，利用计算机的软件大大减少了工作难度，并且提高了精确率。
近年来，人类染色体的荧光显带技术获得了飞速发展，ThomaRied等发明了一种光谱成像技术，称为FISH技术【3】。
我认为进行本次实验最重要的是学习细胞培养过程中使用的药品和各个步骤中涉及的原理以及相关操作。
本次自主实验能够让我们很好的把已经学到的一些理论知识和实际相结合起来，结合自己查阅资料能够使我们在一定程度上利用已有知识分析和解决实验中遇到的一些问题。
不过因为平时所养成的一些不好习惯使我们这次实验进行的不是特别顺利，但我们还是懂得了任何一项研究都是需要花大量功夫的。
而理论科学大都又是随着科学技术发展而发展的，所以我们也非常有必要掌握好相关技术操作，比如简单的油镜使用和实验中要用到的相机拍照等。
【参考文献】
【1】翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学（第三版）【M】.北京：
高等教育出版社，2007:
70-72
【2】甘露，张志辉，吕美娜，王琳.细胞培养技术【J】.中国组织工程研究与临床康复，2008,12（29）：
5739-5742
【3】孔庆友，孙媛，王茜，张开立.人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备实验的改进【N】.大连医科大学学报，2001,23（3）
【4】张丽伟，苏雅拉图，王玉荣，邵小影.人体外周血淋巴细胞染色体的制片体会【N】.内蒙古民族大学学报（自然科学版），2005,20（4）：
447-448
【5】赵小平，陈绍坤，黄燕，税青林.外周血淋巴细胞培养及染色体制备过程中的问题分析【J】.现象预防医学，2009,36（11）:
2108-2112
【6】闫素丽、安玉麟、孙瑞芬、李素萍.染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展[J].生物技术通报2008,4:
70----75
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