食品安全与卫生学实验设计鲜肉及生鲜牛乳质量评价之欧阳地创编Word格式.docx
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指压后凹陷立即恢复
一级鲜度
肌肉色稍暗，切面尚有光泽，新切面湿润
外表干燥或粘手
指压后凹陷恢复慢且不能立即恢复
稍有氨味或酸味
二级鲜度
脂肪呈灰色，切面深灰色、浅绿色
表面高度干燥，指压粘手
指压凹陷不恢复
肉品表面到深层都有腐败气味
腐败肉
三、鸡肉的理化检验：
制备肉浸液：
肉样表层或深层取20-30g肉，除去脂肪和筋腱，切碎。
称取10g碎肉放于250mL烧杯中，加入预煮蒸馏水（无氨蒸馏水）100mL，静置30min，每隔5min用玻璃棒搅拌一次，然后用滤纸过滤至100mL的三角瓶中备用。
1、pH计测定酸度
肉类腐败是，蛋白质分解成氨和胺等碱性物质，使肉的酸度降低，肉的pH值变化在一定程度上反映了肉的新鲜度。
1.仪器与药品：
天平，刀，250mL，烧杯，100mL三角瓶，100mL量筒，10mL烧杯，温度计，脱脂棉，酸度计，pH缓冲液。
2.方法：
用酸度计测定肉浸液的pH值。
评定标准：
鲜肉：
5.9-6.5次鲜肉：
6.6-6.7腐败肉：
6.7以上
2、球蛋白沉淀试验
肌肉中的球蛋白在水溶液中的溶解度随pH值升高而增大在肉的腐败过程中，pH值升高。
蛋白质在碱性溶液中能与重金属离子形成沉淀。
因此，可根据形成沉淀的情况判断肉的新鲜度。
（1）仪器与药品：
10%的硫酸铜溶液
肉浸液的制备：
将肉羊捣碎，混匀，称取10.0g于锥形瓶内，加入100mL蒸馏水，摇匀，浸渍30min，过滤即得到待测肉浸液。
（2）测定：
在一支5mL试管中加入2mL肉浸液，在另一支试管中加入2mL蒸馏水作为对照。
然后分别加入5滴10%硫酸铜溶液，充分振荡后观察。
（3）判断：
试管中液体呈淡蓝色，并且透明，是新鲜肉，液体轻度浑浊或少量混悬物为次鲜肉，液体浑浊并有白色沉淀为变质。
四、微生物检验：
操作步骤：
（1）.样品的准备：
1.称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min----10000r/min均质1min----2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min---2min，制成1：
10的样品溶液。
2.样品匀液的pH值应在6.5---7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。
3.用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：
10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL盐酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（吸管不要触及稀释液面），，振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：
100的样品匀液。
4.根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全程不得超过15min。
（2）初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管桂基硫酸盐蛋白胨肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL则用双料LST肉汤），36℃培养24h，管擦倒管内是否有气泡产生，24h产气者进行复发酵实验，如未产气则继续培养至48h，产气者进行复发酵试验。
未产气者为大肠菌群阴性。
（3）复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃培养48h。
观察产气情况。
产气者，计为大肠菌群阳性管。
五、环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法
1 材料与方法
1.1 试剂CPFX,纯度大于99.7%;
CPFX单克隆抗体,包被抗原（OVACPFX）;
联苯二胺（POD）,牛血清白蛋白（BSA）,;
酶标羊抗小鼠IgG;
乙腈、三乙胺;
其他试剂为国产分析纯。
1.2CPFX标准溶液配制
CPFX标准品储液:
CPFX标准品5mg,用0.03mol/LNaOH溶液溶解并稀释成1g/L的储备液,置2～8℃冰箱中保CPFX标准品工作液:
准确量取适量CPFX标准储备液,用乙腈稀释成适宜浓度的标准工作溶液。
1.3 样品前处
分别取鸡的腿部肌肉组织2g,用少量磷酸盐缓冲液（pH7.0）研磨至匀浆,每个样品均添加CPFX标准品溶液,并设定1.25×
10-3、6.25×
10-4、3.125×
10-4、1.5625×
10-4g/kg4个添加水平,另设一个空白。
用磷酸盐缓冲液振荡混合,离心,定容至25mL成为备用液[。
取备用液用正己烷脱脂作为ELISA检测的试样溶液[;
取备用液用SPE小柱萃取作为HPLC检测的试样溶液。
.1.4 ELISA方法检测样品中的CPFX
1.4.1 间接竞争ELISA方法的建立[4] 包被抗原（OVA-CPFX）用包被液（pH9.6,0.05mol/L碳酸盐缓冲液）稀释至1mg/L加入酶标板,每孔100μL,37℃反应2h;
用洗液（pH7.4,0.01mol/LPBSTween20）洗3次,每次3min。
将腹水单抗18000倍稀释与适当梯度稀释的标准CPFX溶液各50μL同时加入酶标板内,37℃反应1h;
洗板3次后,加入4000倍稀释的酶标二抗,每孔100μL,37℃反应1h;
洗板4次后,加底物溶液（OPD）每孔100μL,37℃反应15min,加终止液（2mol/LH2SO4）,每孔50μL,通过酶标仪测定D490值。
1.4.2 ELISA标准曲线的制作
准确量取适量CPFX标准品储液,分别稀释成400、200、100、50、25、12.5、6.25、0
g/L的CPFX标准溶液,按1.4.1的方法进行ELISA,以标准品浓度的常用对数为横坐标,以抑制率（A标/A0）%为纵坐标绘制标准曲线。
做标准曲线的同时,在一块包被好的酶标板,随机选择10个孔做零标准品间接竞争ELISA检测。
求所得10个D值的标准差（s）,在标准曲线上对应
（A0-2s）的标准品浓度即为此方法的最低检测限（注:
A0为零标准品（不添加标准品）孔D值,A标为各浓度标准品孔D值）。
1.4.3样品中CPFX的检测及CPFX回收率测定
用ELISA试样溶液进行间接竞争ELISA检测,每个水平重复测定5次,根据间接竞争ELISA标准曲线的回归方程计算CPFX的测量值,用测量值（扣除空白）与实际值相除,即为样品的回收率。
实验二“生鲜牛乳质量评价”综合实验
以市售生鲜乳样品为目标，参考课件、食品专业实验指导教材、乳品检验相关教材、相关食品检测国家标，主要针对取样方法、感官检验、理化分析（相对密度、酒精实验法测酸度）、微生物检验（菌落总数、大肠菌群国标法2/平板法、美蓝还原试验）、抗生素检测（嗜热链球菌抑制法/TTC法，乳酸链球菌由实验室提供）、掺假乳实验（掺淀粉、豆浆、碱、盐、甲醛等，可做验证实验）等内容，从实验准备、试剂配制、到完成实验的全过程设计一个详尽合理的实验流程，具体顺序不做要求，但应具体、有可操作性，并在规定的时间内完成上述全部内容，给出实验结果和综合判定。
一、实验目的
了解生鲜乳养的采集和保存方法，掌握乳新鲜度、密度、酸度微生物含量、抗生素含量、掺假的检验方法。
二、乳样的采集和保存
新鲜牛乳是指从正常饲养的、无传染疾病和乳房炎的健康母牛乳房内挤出的正常乳。
采样前必须充分搅拌使混合均匀。
采用直径10mm镀镍金属管或玻璃管采样，从不同深度采样。
采样量若只测脂肪和酸度时50mL即可，若做全面分析取200~300mL，样品应做两个平行。
快速冷却保存：
0~5℃,1~2天；
不做细菌学检验时可加防腐剂保存：
每100mL乳加福尔马林1~2滴可保存10~15天；
每100mL乳加H2O22~3滴，密闭，可保存6~10天。
三、感官检验
（一）检验方法
1.色泽:
白瓷皿中,检查是否带红色、绿色或明显的黄色；
2.气味:
加热后嗅其气味，不能有苦、咸、涩的滋味和饲料、青贮、霉等其他异常气味；
3.滋味：
品尝；
4.组织状态：
烧杯中静止一小时，小心倒入另一烧杯，看前一杯底是否有沉淀和絮状物，再取一滴于大拇指上，检查是否粘滑；
5．杂质：
是否有豆渣、牛粪、昆虫等杂质。
（二）判定标准
正常牛乳应为乳白色或微带黄色,具有特殊的乳香味，稍有甜味，组织状态均匀，无杂质，无凝块，无沉淀，不粘滑。
四、理化分析
1、相对密度
（一）原理
乳的密度是指在20℃时，一定体积的质量与4℃同体积水的质量之比。
同温度下，乳的密度可用乳稠计测定，乳稠计有20℃/4℃（密度计）
（二）材料
乳稠计20℃/4℃，50℃的温度计，
量筒:
250ml、直径大小应使在沉入乳稠计时，乳稠计的周边和量筒内壁间的距离不小于0.5cm。
（三）操作步骤
1.将牛乳样品升温至40℃,上下颠倒摇荡,混合均匀后,降温至20℃（10～25℃）左右,小心地注入高度大于密度计长度,容积约250ml的玻璃量筒中,加到量筒容积的3/4时为止。
注入牛乳时应防止牛乳生成泡沫，如有泡沫，用滤纸条吸去。
2.放入乳稠计时，应三指捏住乳稠计上部，小心地沉入乳汁中至乳稠计示度约30刻度处，让它自由浮动，要使它不与量筒壁接触。
并沿筒壁插入50℃的温度计一支。
3.等乳稠计静止2～3min后,双眼对准筒内乳液表面的高度。
由于牛乳表面与乳稠计接触处形成新月形，此新月形表面的顶点处乳稠计标尺的高度，即密度的数值。
4..所用的乳稠计要以20℃时的数值表示。
因此，如果乳样具有另一温度，则须对温度的差异加以校正。
温度以20℃每高出1℃时,要在得出的乳稠计度数上加0.2°
或在密度数值上加上0.0002;
而温度比20℃每低1℃时,要从得出的乳稠计度数上减0.2°
或在密度数值上减去0.0002。
5.判定标准
生鲜乳特级≥1.030；
一级≥1.029；
二级1.028；
消毒乳1.028~1.032
2、酒精实验法测酸度
（一）材料
1试剂0.5％酚酞乙醇溶液，0.1mol/LNaOH溶液，68％或70％、72％中性酒精等
2器材碱式滴定管，水浴锅，250mL锥形瓶，试管，烧杯
（二）操作步骤
（1）吸取10ml牛乳，移入250mL锥形瓶中，加入20mL蒸馏水，滴入0.5％酚酞乙醇溶液0.5mL，摇匀，用0.1mol/LNaOH溶液滴定，至出现浅红色并在1min内不消失为终点。
（2）将滴定时所消耗的0.1mol/LNaOH溶液的毫升数乘以10，即为牛乳的酸度（0T），也称杰尔捏尔度。
（3）判断标准
生鲜乳特级≤180T；
一级≤190T；
二级≤200T；
消毒乳≤180T
五、微生物检验
1、菌落总数测定
菌落总数：
食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。
（二）设备和材料恒温培养箱：
36℃±
1℃，30℃±
1℃；
冰箱：
2℃～5℃；
恒温水浴箱：
46℃±
天平：
感量为0.1g；
均质器；
振荡器；
无菌吸管：
1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）；
无菌锥形瓶：
容量250mL、500mL；
无菌培养皿：
直径90mm；
pH计或pH比色管或精密pH试纸；
放大镜或/和菌落计数器。
培养基及试剂平板计数琼脂培养基；
磷酸盐缓冲液；
无菌生理盐水。
（1）样品的稀释
1.1以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:
10的样品匀液。
1.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:
100的样品匀液。
1.3按上述2操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
1.4根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
1.5及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±
1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
2.培养
2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±
1℃培养48h±
2h。
水产品30℃±
1℃培养72h±
3h。
2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。
3.菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。
3.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；
若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
4.菌落总数的计算方法
4.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。
4.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式
（1）计算：
N=∑C/（n1+n2）d…………………………………
（1）
式中：
N——样品中菌落数；
ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
4.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
4.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
2、大肠菌群计数
（一）设备与材料同菌落种数测定
培养基及试剂煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤；
结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）；
无菌生理盐水；
无菌1mol/LNaOH；
无菌1mol/LHCl。
（1）样品的稀释
1.1以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:
1.2样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。
1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:
1.4根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
（2）平板计数
2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。
同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
2.2及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板，置于36℃±
1℃培养18h～24h。
（3）平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
（4）证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±
1℃培养24h～48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
3、美蓝还原实验
本方法中所指牛乳卫生质量包括细菌的浓度和代谢强度以及体细胞代谢消耗一定量的所需要的时间。
利用微生物及体细胞浓度愈大,代谢愈旺盛,单位时间内消耗氧愈多,美蓝还原褪色时间相应变短;
反之,美蓝褪色时间则相应变长。
在一定容量的牛乳内加入定量的美蓝,上覆少量消毒的液体石蜡以隔绝外界氧,在38℃水浴中静置观察美蓝褪色时间的长短。
（二）试剂和材料
美兰溶液的配制:
称取分析纯美蓝4.9ml,在100ml定容瓶内加部分蒸馏水使之全部溶解后定容至100ml,塞上瓶盖,于冰箱中贮存备用,使用期限为14日。
液体石蜡（分析纯），使用前须蒸煮30min消毒。
分析天平:
感量0.1mg;
定温浴槽（内高不低于21cm）;
试管:
18×
1.8cm;
金属试管架;
吸管:
1和20ml。
玻璃器皿使用前均须进行灭菌，吸管上端须放有脱脂棉以防操作时唾液进入样品。
（三）操作方法
用消毒吸管吸取每个待测乳样20ml,分别放入顺序排列在试管架上、编有代号的试管中，再在每个试管内加入１ｍｌ美蓝标准溶液，然后用一小张干净硫酸纸盖住管口，再用拇指压紧，分别颠倒摇荡混匀后，顺序放在试管架上。
在每个试管上部加入少许消毒液体石蜡封闭，然后将试管连同管架放入38℃恒温浴槽中,应使槽中水面不低于试管内乳样高度。
记录开始时间,经常注意观察每支试管的颜色变化。
当某一试管的颜色由蓝变白（底部或表层余有少许蓝色者也应算其褪色完毕）即算褪色完毕,记录其褪色时间。
（四）结果
用小时和分钟作为时间单位,表示每个样品的美蓝还原褪色时间。
六、抗生素检测
1活化菌种
取一接种环嗜热链球菌菌种，接种9mL灭菌脱脂乳中，置36士1℃恒温培养箱中培养12h-15h后，置2-5℃冰箱保存备用，每15h转种一次。
2测试菌液
将经过活化的嗜热链球菌菌种接种灭菌脱脂乳，36士1℃恒温培养箱中培养15h士1h，加入相同体积的灭菌脱脂乳混匀稀释成测试菌液。
3培养
取检样9mL,置18mm×
180mm试管内，每份样品另外做一份平行样。
同时再做阴性和阳性对照各一份，阳性对照管用9mL。
青霉素G参照溶液，阴性对照管用9mL，灭菌脱脂乳。
所有试剂置80℃士2℃水浴加热5min，冷却37℃以下，加测试菌液1mL,轻轻旋转试管混匀。
36士1℃水浴培养2h，加4%TTC水溶液0.3mL,在旋转混匀器上混合15s或振动试管混匀。
36士1℃水浴培养30min，观察颜色变化。
如果颜色有变化，于水浴中继续避光培养30min作最终观察。
观察时要迅速，避免光照过久出现干扰。
4判断方法:
在白色背景前观察，试管中样品呈乳的原色时，指示乳中有抗生素存在，为阳性结果。
试管中样品呈红色为阴性结果，如最终观察对象仍为可疑，建议重新检测。
七、参假乳实验
1、掺淀粉或米汁
为了提高牛乳的稠度和非脂固体的含量，往往在牛乳中加入淀粉或糊精，也有的直接加入米汁，对这类掺假可用碘—淀粉反应检出。
反应方程式:
nI2+6n（C6H10O5）→2n（C18H30O15I）
当碘液与淀粉接触时，碘分子能进入淀粉分子的螺旋内部，平均每六个葡萄糖单位（每圈螺旋）可以束缚一个碘分子，整个直链淀粉分子可以束缚大量的碘分子，这就形成了淀粉-碘的复合物显蓝色。
对于支链淀粉（如糊精）则呈红紫色。
2、掺豆浆
在牛乳中掺入豆浆，也是一种较为普遍的掺假行为。
根据豆浆中含有皂角素，可在碱性中呈黄色反应而判别。
（呈现微黄色可认为掺入了10%以上的豆浆）
3、掺食盐
牛乳中掺入食盐可以增加相对密度,提高非脂类固体的含量和重量。
可以采用硝酸银进行鉴别,呈现沉淀则说明说明掺入了食盐。
Cl－可与Ag＋反应生成难溶性沉淀。
方程式：
Ag＋+Cl－=AgCl
如果出现沉淀则可认为掺入了食盐，且Cl＋的浓度大于0.14%，正常乳中Cl＋的浓度在0.09%～0.12%。
4、掺碱液
为掩盖牛乳的酸败现象，降低牛乳的酸度，防止牛乳因酸败而发生凝结，可能向已酸败的牛乳中加入碳酸钠（苏打）或碳酸氢钠（小苏打）。
加碱后的牛乳不仅滋味不佳，而且细菌易于生长繁殖，对人体健康有害。
因此，检验牛乳中掺碱是很重要的。
CO32－、HCO3－均可与H＋反应，可以采用HCl进行鉴定，而甲基橙的变色范围为3.1～4.4，因此如果掺了碱液，会由橙黄色转化为红色
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