DNA提取和PCR.docx
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DNA提取和PCR
DNA提取和PCR
课题1DNA的粗提取与鉴定
一、基础知识
（一）提取DNA的方法
提取生物大分子的基本思路是选用一定的
物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质
的生物大分子。
对于DNA的粗提取而言，就是要利用
DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和
化学性质方面的差异，提取
DNA，去除其他成分。
（1）DNA的溶解性：
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的
NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择
适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。
利用这一原理，可
以将DNA与蛋白质进一步的分离。
（2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：
60—80oC的高温，
蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。
大多数蛋白质不能忍受
而DNA在80℃以上才会变性。
洗涤剂能够瓦解
细胞膜，但对DNA没有影响。
（二）DNA的鉴定
在沸水裕条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定
DNA的试剂。
二、实验设计
（一）实验材料的选取
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。
如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。
例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅
拌和研磨，过滤后收集研磨液。
注意：
不能用哺乳动物的成熟红细胞提取DNA。
（三）去除滤液中的杂质
方案一利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度
去除杂质。
方案二直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解
蛋白质。
方案三将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱保温10～15min，注意严格控制温度范围。
（四）DNA的析出与鉴定
1、将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静
置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
2、取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为
2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其
中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。
然后，向两支试管中各加入
4ml的二苯
胺试剂。
混合均匀后，将试管置于
沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶
液颜色的变化，看看溶解有
DNA的溶液是否变蓝。
实例：
用鸡血细胞液粗提取
DNA并鉴定
步骤
操作
图示
1、提取鸡
将制备好的鸡血细胞液
（已在课前配好）5~10mL，注入
血细胞的
到50ml烧杯中。
向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒
细胞核物
沿一个方向快速搅拌
5min，然后，用放有纱布的漏斗将血
细胞过滤至1000mL的烧杯中，取其滤液，滤液中含有核DNA
质
和其它杂质。
2、溶解细
胞核内的
DNA
3、析出含
DNA的粘
稠物
4、滤取含
DNA的粘
稠物
将物质的量浓度为2mol／L的NaCl溶液40mL加入到
滤液中，并作玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中充分溶解，其它一些杂质析出，过滤取其滤液。
沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。
继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。
当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。
用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000mL的烧杯中。
取纱布上的黏稠物。
5、将DNA
取一个50mL烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为
2mol
的粘稠物
／L的NaCl溶液20mL。
用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至
再溶解
NaCl溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌
3min，使黏
稠物尽可能多地溶解于溶液中。
6、过滤含
取一个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上
DNA的氯
溶液。
取其滤液（DNA溶于滤液中）。
化钠溶液
7、提取含
在上述滤过的溶液中，加入
冷却的、体积分数为
95％
杂质较少
的酒精溶液50mL（加入时动作要慢），并作用玻璃棒沿一
的DNA
个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。
当玻璃棒
上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻
璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。
8、DNA的
取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为
2mol／L
鉴定
的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃
棒搅拌，使丝状物溶解。
然后，向两支试管中各加入
4mL
的二苯胺试剂。
混合均匀后，将试管置于沸水中加热
5min，
等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。
三、操作提示
1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。
加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不
能形成絮状沉淀。
3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
四、课题成果评价
1、是否提取出了DNA
观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定
出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。
2、分析DNA中的杂质
本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖、RNA等杂质。
3、不同实验方法的比较
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对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。
首先选取不同的实验材
料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的多少、颜色，
二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
五、课题延伸
本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。
实验室提取高
纯度的DNA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。
【教材答案】
（一）旁栏思考题
1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
答：
蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀
裂，加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。
2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答：
洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，
有利于DNA的溶解。
3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
答：
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导
致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？
答：
可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。
5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
答：
用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA
析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。
因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去
与DNA溶解度不同的多种杂质。
6．方案二与方案三的原理有什么不同？
答：
方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用
的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
例题1．下列关于高中生物学实验的叙述，正确的是
A．在制备果酒和果醋的实验过程中都要持续通入氧气
B．分离土壤中不同种类的微生物需采用相同的稀释度
C．将DNA粗提取后用二苯胺进行鉴定时需要进行水浴加热
D．选择过氧化氢酶作为探究温度对酶活性影响实验的理想材科
答案C
例题2、下列实验材料、用具的改变，对实验结果影响最小的是Ａ．用二苯胺试剂代替甲基绿染色观察ＤＮＡ的分布
Ｂ．大蒜根尖代替洋葱根尖观察植物细胞有丝分裂
Ｃ．0.14mol/LNaCL代替2mol/LNaCL溶解DNA
D．蒸馏水代替层析液进行叶绿体色素的分离
答案.B
DNA、RNA和蛋白质相关术语拓展
顺式作用元件（cis-actingelement）是指存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序
列。
顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因
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表达的调控。
顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。
反式作用因子是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调
控靶基因转录效率的蛋白质，有时也称转录因子。
大多数真核转录调节因子由某一基因表达
后，可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，从而激活另一基因的转录。
这种调节蛋白称为反式作用因子。
反义脱氧核苷酸就是和mRNA链互补的脱氧核苷酸链。
可以诱导mRNA的降解，导致基
因的沉默。
反义RNA是指与靶RNA（多为mRNA）具有互补序列的RNA分子，通过与靶RNA进行碱基
配对结合的方式，参与基因的表达调控。
反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。
利用反义
核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。
例题1．基因转录出的初始RNA，经不同方式的剪切可被加工成翻译不同蛋白质的mRNA。
某些剪切过程不需要蛋白质性质的酶参与。
大多数真核细胞mRNA只在个体发育的某
一阶段合成，不同的mRNA合成后以不同的速度被降解。
下列判断不正确的是
A．某些初始RNA的剪切加工可由RNA催化完成
B．一个基因可能参与控制生物体的多种性状
C．mRNA的产生与降解与个体发育阶段有关
D．初始RNA的剪切、加工在核糖体内完成
答案D
例题2．单细胞生物四膜虫转录形成的一种前体RNA，在仅含核苷酸和纯化的前体RNA的溶
液中，发生了RNA内部部分序列的有序切除。
下列相关叙述不正确的是
．．．
A．该RNA的基本单位是核糖核苷酸
B．该RNA的剪切可能是由自身催化的
C．该RNA剪切所需的酶是由自身翻译形成
D．该RNA的剪切过程会受到温度、pH的影响
答案C
例题3.（18分）RNA具有多种功能，请回答下列与RNA有关的问题：
（1）在细胞生物中，DNA是遗传物质，RNA帮助其实现功能。
其中，RNA能够帮助_________
酶合成子代DNA分子，实现DNA__________________的功能。
另外，在遗传信息表达过程中，
mRNA的功能是__________________,在翻译过程中，_________________也发挥了关键作用。
（2）RNA一般是单链分子，但也可遵循_________原则形成部分双链,再折叠产生复杂的空间结构。
同时，与DNA相比，RNA中的五碳糖是_________，其分子含有游离的羟基，这两个特点使RNA具有催化潜能。
（3）四膜虫体内存在具有剪切底物分子能力的某种
RNA分子（核
酶）。
正常情况下，核酶需要
2+
Mg的辅助，在实验条件下让核酶处
于Ca2+环境中，进行RNA分子群体的选择实验，实验结果如图21
所示。
该结果表明四膜虫产生了在
Ca2+环境中_________的核酶，其
原因是某些碱基被替换，发生了_________,通过_________适应环境
的个体逐渐增多。
答案．（18分）
（1）DNA聚合传递遗传信息（携带遗传信息）将
遗传信息从DNA传递给蛋白质tRNA和rRNA（转运RNA和核
精品文档交流
糖体RNA；tRNA；转运RNA）
（2）碱基互补配对
核糖
（3）催化活性更高（剪
切能力更强）
基因突变
选择作用（人工选择；自然选择）
例题4.（18分）凋亡抑制蛋白与肿瘤的发生、发展有关，科学家利用先天无胸腺的裸鼠，
探究凋亡抑制蛋白基因的反义脱氧核苷酸链对肠癌肿瘤的抑制作用。
请分析回答下列问题：
（1）人工合成部分序列为
5’GGCAACACCCAT3’反义脱氧核苷酸链，能够与凋亡抑
制蛋白基因的__________配对结合，使其分子构象发生改变，
不能与____________结合，抑
制翻译。
请写出凋亡抑制蛋白基因的部分序列：
____________。
另外，人工合成的序列不应
与人类其他基因的碱基序列相同，以避免该序列
________。
（2）将肠癌细胞置于含
5%__________的恒温培养箱中培养，
对培养细胞用
0.4%台盼蓝染料
染色，拒染率＞95%，说明绝大部分培养细胞为活细胞，其细胞膜具有
___________性。
将拒
染的细胞制成单细胞悬液，
每只实验裸鼠接种等量的单细胞悬液于背部皮下，
2周左右成瘤，
成瘤率为100%。
成瘤率为
100%的原因是裸鼠________________________________。
（3）将若干只生长状况相同的裸鼠等分为两组，对皮下瘤体分别注射适量含
_________________的生理盐水和等量的生理盐水，检测_______________，计算抑制率，抑
制率=（1?
治疗组瘤重量/对照组瘤重量）×100%。
若抑制率_______________，则说明反义
脱氧核苷酸链能够明显抑制裸鼠肠癌移植瘤的生长。
答案.（除注明外，每空2分，共18分）
（1）mRNA核糖体（见右图）
干扰人类其他基因的表达
（2）CO2（1分）选择透过（1分）无胸腺，失去特异性免疫，对接种的肠癌细胞
没有排斥反应
（3）反义脱氧核苷酸链瘤体重量（更加）接近100%
例题5（18分）为确定遗传信息从DNA传递给蛋白质的中间载体，科学家们做了如下研究。
（1）依据真核细胞中____________位于细胞核内，而蛋白质合成在核糖体上这一事实，科学家推测存在某种“信使”分子，能将遗传信息从细胞核携带到细胞质中。
（2）对于“信使”有两种不同假说。
假说一：
核糖体RNA可能就是信息的载体；假说
二：
另有一种RNA（称为mRNA）作为遗传信息传递的信使。
若假说一成立，则细胞内应该有许多________（填“相同”或“不同”）的核糖体。
若假说二成立，
则mRNA应该与细胞内原有的__________结合，并指导蛋白质合成。
（3）研究发现噬菌体侵染细菌后，细菌的蛋白质合成立即停止，转而合成噬菌体的蛋白
质，在此过程中，细菌细胞内合成了新的噬菌体RNA。
为确定新合成的噬菌体RNA是否为“信使”，科学家们进一步实验。
①
15
13
NH4Cl和
C-葡萄糖作为培养基中的____________和碳源来培养细菌，细菌
利用它们合成_______________等生物大分子。
经过若干代培养后，获得具有
“重”核糖体的“重”细菌
②
将这些“重”细菌转移到含
14NH4Cl和12C-葡萄糖的培养基上培养，用噬菌体
侵染这些细菌，该培养基中加入
32P标记的__________核糖核苷酸为作为原料，
以标记所有新合成的噬菌体
RNA。
③
将上述被侵染后裂解的细菌进行密度梯度离心，结果如下图所示。
由图可知，
大肠杆菌被侵染后___________（填“合成了”或“没有合成”）新的核糖体，
这一结果否定假说一。
32P标记仅出现在离心管的____________，说明
精品文档交流5
__________________与“重”核糖体相结合，为假说二提供了证据。
（4）若要证明新合成的噬菌体RNA为“信使”，还需要进行两组实验，请选择下列序号填入表格。
①新合成的噬菌体RNA与细菌DNA混合
②
将新合成的噬菌体
RNA与噬菌体DNA混合
③出现DNA-RNA杂交现象
③
出现DNA-RNA
杂交现象
④
不出现DNA-RNA
杂交现象
组别实验处理预期结果
1
2
答案.（18分）
（1）DNA（或“基因”）（1分）
（2）不同（2分）核糖体（2分）
（3）①氮源（1分）蛋白质和核酸（2分）
②尿嘧啶（2分）
③没有合成（2分）底部（1分）新合成的噬菌体RNA（2分）
（4）如右表（3分）
组别实验处理预期结果
1②③
2①④
注：
1组与2组可整组互换位置，但全部填写正确才可得分。
例题6．（18分）普通番茄细胞中含多聚半乳糖醛酸酶基因（用A表示），控制细胞产生多聚
半乳糖醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使番茄易软化，不耐储藏。
抗多聚半乳糖醛酸酶基
因可以使番茄不再产生多聚半乳糖醛酸酶，从而使番茄长时间抗软化，容易储存和运输。
下图是通过基因工程培育抗软化耐储藏番茄的过程及原理。
请分析回答下列问题：
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（1）普通番茄（AA）也可以通过__________育种的方法，最终获得基因型为aa（不能
合成多聚半乳糖醛酸酶）的抗软化、耐储存的番茄。
（2）利用基因工程将目的基因导入植物细胞，目前采用最多的方法是__________，该方
法中用到的目的基因载体是__________，目的基因需插入到该基因载体的__________
上。
（3）将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞所需要的工具酶有____________。
（4）图1中获得导入抗多聚半乳糖醛酸酶基因的番茄细胞，需要经过__________技术获
得转基因番茄，这个过程需要在条件下进行，细胞先经脱分化形成
__________，再形成丛芽和根。
（5）根据图2分析抗多聚半乳糖醛酸酶基因能使番茄抗软化的原理是两个基因分别转录
出的mRNA，从而阻断了__________过程。
答案．（除注明外，其余每空
2分）
（1）诱变
（2）农杆菌转化法
Ti
质粒
T-DNA
（3）限制酶和DNA连接酶
（4）植物组织培养（
1分）
无菌
愈伤组织（1分）
（5）结合形成双链RNA
多聚半乳糖醛酸酶基因的表达
课题2PCR扩增反应的操作
第一节PCR扩增反应的基本原理
一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成
PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组
DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情
况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓
冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成
引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq
DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成
精品文档交流7
一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：
模板
变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性
模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA
的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C
间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相
对要高些。
故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含
量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），
并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
2．模板DNA与引物的退火
将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-
引物复合物。
退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基
组成。
一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的
长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。
3．引物的延伸
DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，
按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA
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