QPCR原理及应用Word格式.docx
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常用的荧光激发方式有两种：
卤钨灯和LED；
荧光检测元件常用两种方式：
光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。
在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。
具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。
2.Real-timeqPCR的数学原理
首先来看一个real-timeqPCR中的重要参数Ct值（Ctvalue），阈值（threshold），和基线（baseline）。
一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。
阈值一般是基线的标准偏差的10倍。
在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。
Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。
所以是一个没有单位的参数。
那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢？
我们来看PCR的扩增方程：
定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
3.2分子信标法
分子信标：
一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。
在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。
分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；
茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。
荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。
分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。
与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。
当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。
3.3SYBR@Green法
SYBR@GreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。
这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。
SYBR@GreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
在PCR反应体系中，加入过量SYBR@Green荧光染料，SYBR@Green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR@Green染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
3.4LUX@Primers法
LUX@（lightuponextention）引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。
目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。
在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。
在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。
4.Real-timeqPCR和常规PCR的区别
实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测
敏感性高
需要样品少
特异性高
精确定量
三、Real-timeqPCR实验设计
实验设计其实比实验本身更重要！
好的实验设计可以事半功倍，节省时间！
尤其做生物实验，一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路，设计好实验路线。
当然实验过程中出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识，就可以分析原因，才有可能创新。
对于一个real-timeqPCR而言，首先就是实验材料的处理和准备；
然后引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的50%；
进行实验和数据分析（这一部分单独说明）。
1.实验材料的处理和准备
以最基本的基因表达差异分析为例。
实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。
组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。
在材料收集过程中，尽量避免RNA的降解（尤其对于绝对定量的样品）。
一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。
现在新技术的发展，也有一些非液氮类的样品储存液，比如百泰克的RNAfixer。
2.引物设计
一般real-timePCR引物的设计遵循下面一些原则：
扩增产物长度在80-150bp。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
产物不能形成二级结构。
产物长度一般在15-30碱基之间。
G+C含量在40%-60%之间。
碱基要随机分布。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物5’端可以修饰。
引物3’端不可修饰。
引物3’端要避开密码子的第3位。
Taqman@探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。
遵循下面以下原则：
尽量靠在上游引物；
长度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；
5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量
四、Real-timeqPCR操作过程
1.RNA提取和反转录
在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。
由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。
在实际的操作中应遵循下面一些原则：
1.全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
2.使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。
3.在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。
而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
玻璃器皿可以在150°
C的烘箱中烘烤4小时。
塑料器皿可以在0.5MNaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
当然，这些也不是绝对的要求。
如果是操作熟练。
完全可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行RNA的提取。
2.Mix配制
一般来讲，进行real-timeqPCRMasterMix都是2×
的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。
由于real-timeqPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。
通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；
模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。
当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。
在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：
1.MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
2.更多的配制Mix进行，减少加样误差。
最好能在冰上操作。
3.每管或每孔都要换新枪头！
不要连续用同一个枪头加样！
4.所有成分加完后，离心去除气泡。
5.每个样品至少3个平行孔。
参比或者校正染料（referencedye，passivedye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！
）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。
参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。
现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。
如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常来讲，real-timeqPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。
由于其产物长度在80-150bp之间，所以只需要变性和退火就可以了。
SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。
而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。
3.仪器设置
所有仪器的操作都基本一致。
设置的时候包括反应板设置（platesetup）和程序设置（programsetup）。
我们以ABIStepOne为例，详细看一下反应设置：
A.首先是实验目的选择：
定量还是其他。
我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。
B.实验方法的选择：
我们选用的比较Ct的SYBRGreen方法，Fast程序，以cDNA为模板进行。
C.目的基因的设置：
有几个目的基因和目的基因的名称。
D.样品的设置：
包括哪个是实验组，哪个是对照组。
以及负对照的设置和生物重复的设置。
E.对照组和内参基因的设置：
这个是为后面的定量做准备
F.反应程序的设置：
PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。
比如BioTeke的95℃2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10分钟）。
循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。
溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。
或者是仪器说明书上建议的程序。
G.反应体系的设置：
A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。
需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。
有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；
也有的是单独分开。
要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。
BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none”。
设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！
五、Real-timeqPCR数据分析
1.Real-timeqPCR常见参数
基线（baseline）
通常是3-15个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
阈值（threshold）
自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置：
置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
Ct值:
与起始浓度的对数成线性关系。
分析定量时候一般取Ct:
15-35。
太大或者太小都会导致定量的不准确。
Rn（Normalizedreporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn：
△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。
2.影响Ct值的关键因素
模板浓度
模板浓度是决定Ct的最主要因素。
控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。
反应液成分的影响
任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。
PCR反应的效率
PCR反应的效率也会影响Ct值。
在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。
PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。
一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。
3.如何评估实时定量PCR反应的效果
PCR扩增效率：
为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数（5logs）连续梯度稀释模板浓度。
R2值：
另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。
如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）来准确预测X值（量）。
如果R2等于0，你就不能通过Y值来预测X值。
R2值大于0.99时，两个数值之间相关的可信度很好。
精确度:
标准偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精确度计量方法。
如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；
如果许多数据点都远离平均值，则标准偏差就大。
实际上，足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。
这经常可通过经典的中心极限理论来证明，独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。
如果PCR反应效率是100%，那么2倍稀释点之间的平均Ct间隔应该恰为1个Ct值。
要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于0.167。
标准偏差越大，分辨2倍稀释的能力就越低。
为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释，标准偏差必须小于等于0.250。
灵敏度：
无论CT绝对值是多少，任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为1的系统都达到了灵敏度的极限。
PCR效率是决定反应灵敏度的关键因素。
在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期。
相反，它会遵循泊松分布，即进行大量的平行重复，平均应该含有一个拷贝的起始模板，实际上约37%不含有拷贝，仅有约37%含有1个拷贝，约18%实际上含有两个拷贝。
因此，为了更可靠地检测低拷贝，必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性，并克服泊松分布的限制。
评价荧光PCR结果的标准
因素建议
指标
效率
5个数量级梯度稀释
Slope～-3.3
R2>
0.99
精密度
至少3个重复
标准差<
0.25（0.5或者1个Ct之内）
灵敏度
增加低浓度样本的重复数
统计分析
除了这些因素，还必须评估和验证合适的实验对照（如无模板对照，无反转录酶对照等）以及模板质量。
3.Real-timeqPCR定量方法
可以分绝对定量和相对定量。
绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。
该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。
相对定量可以分比较Ct法和其他一些相对方法。
比较Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,也称之是2-△△Ct。
3.1绝对定量
3.22-△△Ct定量
3.3其他定量方法
MarisaL.WongandJuanF.Medrano:
BioTechniquesJuly2005
六、Real-TimeqPCR常见问题分析
1.无Ct值出现
检测荧光信号的步骤有误:
一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
引物或探针降解:
可通过PAGE电泳检测其完整性。
模板量不足:
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
模板降解:
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
2.Ct值出现过晚（Ct>
38）
扩增效率低:
反应条件不够优化。
设计更好的引物或探针；
改用三步法进行反应；
适当降低退火温度；
增加镁离子浓度等。
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
PCR产物太长:
一般采用80-150bp的产物长度。
3.标准曲线线性关系不佳
加样存在误差:
使得标准品不呈梯度。
标准品出现降解:
应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
引物或探针不佳:
重新设计更好的引物和探针。
模板中存在抑制物，或模板浓度过高
4.负对照有信号
引物设计不够优化：
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳：
适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高：
适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
模板有基因组的污染：
RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
5.溶解曲线不止一个主峰
适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
6.扩增效率低
反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
反应条件不够优化：
可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
反应体系中有PCR反应抑制物：
一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？
判断标准：
扩增效率，灵敏度，特异性
如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。
8.扩增曲线的异常？
比如“S”型曲线？
参比染料设定不正确（MasterMix不加参比染料时，选NONE）
模板的浓度太高或者降解
荧光染料的降解
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