QPCR原理及应用.docx

QPCR原理及应用.docx

《QPCR原理及应用.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《QPCR原理及应用.docx（17页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

QPCR原理及应用

QPCR原理及应用

由于Real-timeqPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。

越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也根本上被real-timeqPCR所代替。

由于real-timeaPCR输出的数据不同于常规的PCR电泳检测，很多没有做过real-timeqPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。

本文就从real-timeqPCR的开展史说起，包括real-timeqPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-timeqPCR，彻底的从菜鸟到高手！

一、Real-timeqPCR开展史

Real-timeqPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进展实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

由于常规的PCR的缺点，real-timeqPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点开展非常迅速。

现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比方基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。

在Real-timeqPCR技术的开展过程中，定量PCR仪的开展起了至关重要的作用。

1995年，美国PE公司〔已经并入Invitrogen公司〕成功研制了Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进展数据分析。

从而荧光定量PCR获得广泛应用。

现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISMStepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycleriQ5、MyiQ、MJResearchChromo4TMOpticon系列；StratageneMxTM系列；RocheLightCycler系列；EppendorfMasercycler；CorbettRotor-GeneTM；CepheidSmartCycler和BIOER的LineGene系列。

随国内生命科学的快速开展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。

与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-timePCR仪器生产比方XX天隆科技公司的TL系列仪器。

二、Real-timeqPCR概述

1.Real-timeqPCR原理

实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进展实时检测。

一般来讲，定量PCR仪包括：

实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。

其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致一样，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。

独特是这个微量荧光检测系统。

有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。

常用的荧光激发方式有两种：

卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：

光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。

在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。

具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。

2.Real-timeqPCR的数学原理

首先来看一个real-timeqPCR中的重要参数Ct值〔Ctvalue〕，阈值〔threshold〕，和基线〔baseline〕。

一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。

阈值一般是基线的标准偏差的10倍。

在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。

Ct值就是荧光值到达阈值时候的PCR循环次数。

所以是一个没有单位的参数。

那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢？

我们来看PCR的扩增方程：

从线性方程上看，斜率〔slope〕为-1/lg（1+E），所以E=10-1/slope-1。

如果从标准曲线上得到斜率〔-3.3〕，就可以算出扩增效率〔0.99〕。

一般来讲PCR扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。

效率低于100%，是由于PCR反响中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。

3.Real-timeqPCR的种类

根据real-timeqPCR的化学发光原理可以分为2大类：

一类为探针类，包括TaqMan探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类，其中包括如SYBRGreenI或者特殊设计的引物（如LUXPrimers）通过荧光染料来指示产物的增加。

3.1Taqman探针法

Taqman探针是最早用于定量的方法。

就在PCR扩增时参加一对引物的同时参加一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：

5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是FRET反响；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团别离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进展基因定量分析，又可分析基因突变〔SNP〕，有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

3.2分子信标法

分子信标：

一种在靶DNA不存在时形成茎环构造的双标记寡核苷酸探针。

在此发夹构造中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。

分子信标的茎环构造中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的构造。

荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂那么连接于另一端。

分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环构造，模板存在时那么与模板配对。

与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。

当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。

3.3SYBRGreen法

SYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。

这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。

SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

在PCR反响体系中，参加过量SYBRGreen荧光染料，SYBRGreen荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBRGreen染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

3.4LUXPrimers法

LUX（lightuponextention）引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。

目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。

在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹构造，使荧光淬灭。

在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹构造翻开，产生特异的荧光信号。

4.Real-timeqPCR和常规PCR的区别实时检测〔在对数扩增时期〕而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高准确定量三、Real-timeqPCR实验设计

实验设计其实比实验本身更重要！

好的实验设计可以事半功倍，节省时间！

尤其做生物实验，一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路，设计好实验路线。

当然实验过程中出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识，就可以分析原因，才有可能创新。

对于一个real-timeqPCR而言，首先就是实验材料的处理和准备；然后引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的50%；进展实验和数据分析〔这一局部单独说明〕。

1.实验材料的处理和准备

以最根本的基因表达差异分析为例。

实验材料分为对照组〔CON〕和处理组〔TRT〕。

组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。

在材料收集过程中，尽量防止RNA的降解〔尤其对于绝对定量的样品〕。

一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。

现在新技术的开展，也有一些非液氮类的样品储存液，比方百泰克的RNAfixer。

2.引物设计

一般real-timePCR引物的设计遵循下面一些原那么：

扩增产物长度在80-150bp。

引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

产物不能形成二级构造。

产物长度一般在15-30碱基之间。

G+C含量在40%-60%之间。

碱基要随机分布。

引物自身不能有连续4个碱基的互补。

引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物5’端可以修饰。

引物3’端不可修饰。

引物3’端要避开密码子的第3位。

Taqman探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。

遵循下面以下原那么：

尽量靠在上游引物；长度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量四、Real-timeqPCR操作过程1.RNA提取和反转录在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。

由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。

在实际的操作中应遵循下面一些原那么：

1.全程佩戴一次性手套。

皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。

培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。

2.使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，防止使用公共仪器所导致的RNA酶穿插污染。

例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品〔如自动吸管〕可能富含RNA酶。

3.在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。

而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。

玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。

塑料器皿可以在0.5MNaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

当然，这些也不是绝对的要求。

如果是操作熟练。

完全可以用初次XX的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进展RNA的提取。

2.Mix配制一般来讲，进展real-timeqPCRMasterMix都是2×的浓缩液，只需要参加模板和引物就可以。

由于real-timeqPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进展统计分析。

通常来讲，反响体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进展调整。

当然这些都是经历值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进展优化，到达一个最正确反响体系。

在反响体系配置过程中，有下面几点需要注意：

1.MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。

2.更多的配制Mix进展，减少加样误差。

最好能在冰上操作。

3.每管或每孔都要换新枪头！

不要连续用同一个枪头加样！

4.所有成分加完后，离心去除气泡。

5.每个样品至少3个平行孔。

参比或者校正染料〔referencedye，passivedye〕常用的是ROXTM〔现在已经是ABI的注册商标了！

〕或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。

参比染料的作用是标准化荧光定量反响中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。

如果反响曲线良好或已经优化好反响体系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常来讲，real-timeqPCR的反响程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。

由于其产物长度在80-150bp之间，所以只需要变性和退火就可以了。

SYBRGreen等染料法，最好在PCR扩增程序完毕后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。

而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进展溶解时候，进展荧光信号的收集。

3.仪器设置所有仪器的操作都根本一致。

设置的时候包括反响板设置〔platesetup〕和程序设置〔programsetup〕。

我们以ABIStepOne为例，详细看一下反响设置：

A.首先是实验目的选择：

定量还是其他。

我们命名为“BioTeke〞，进展“定量〞实验。

B.实验方法的选择：

我们选用的比拟Ct的SYBRGreen方法，Fast程序，以cDNA为模板进展。

C.目的基因的设置：

有几个目的基因和目的基因的名称。

D.样品的设置：

包括哪个是实验组，哪个是对照组。

以及负对照的设置和生物重复的设置。

E.对照组和内参基因的设置：

这个是为后面的定量做准备F.反响程序的设置：

PCR反响程序的设置要根据不同公司的MasterMix。

比方BioTeke的95℃2分钟就可以激活DNA聚合酶〔ABI的需要10分钟〕。

循环反响是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。

溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。

或者是仪器说明书上建议的程序。

G.反响体系的设置：

A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反响程序或者立刻进展反响。

需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。

有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。

要根据不同公司的MasterMix进展这一个步骤的选择。

BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none〞。

设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！

五、Real-timeqPCR数据分析1.Real-timeqPCR常见参数基线〔baseline〕通常是3-15个循环的荧光信号同一次反响中针对不同的基因需单独设置基线阈值〔threshold〕自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：

置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。

同一次反响中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。

Ct值:

与起始浓度的对数成线性关系。

分析定量时候一般取Ct:

15-35。

太大或者太小都会导致定量的不准确。

Rn〔Normalizedreporter〕是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。

△Rn：

△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果〔△Rn=Rn-基线〕。

2.影响Ct值的关键因素模板浓度模板浓度是决定Ct的最主要因素。

控制在一个适宜X围内，使Ct在15-35之间。

反响液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比方溶液的pH值和盐浓度。

PCR反响的效率PCR反响的效率也会影响Ct值。

在PCR扩增效率低的条件下进展连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。

PCR效率取决于实验、反响混合液性能和样品质量。

一般说来，反响效率在90-110%之间都是可以承受的。

3.如何评估实时定量PCR反响的效果PCR扩增效率：

为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数（5logs）连续梯度稀释模板浓度。

R2值：

另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。

如果R2等于1，那么你可以用Y值〔Ct〕来准确预测X值〔量〕。

如果R2等于0，你就不能通过Y值来预测X值。

R2值大于0.99时，两个数值之间相关的可信度很好。

准确度:

标准偏差〔standarddeviation，偏差的平方根〕是最常用的准确度计量方法。

如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；如果许多数据点都远离平均值，那么标准偏差就大。

实际上，足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。

这经常可通过经典的中心极限理论来证明，独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。

如果PCR反响效率是100%，那么2倍稀释点之间的平均Ct间隔应该恰为1个Ct值。

要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于0.167。

标准偏差越大，分辨2倍稀释的能力就越低。

为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释，标准偏差必须小于等于0.250。

灵敏度：

无论CT绝对值是多少，任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为1的系统都到达了灵敏度的极限。

PCR效率是决定反响灵敏度的关键因素。

在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期。

相反，它会遵循泊松分布，即进展大量的平行重复，平均应该含有一个拷贝的起始模板，实际上约37%不含有拷贝，仅有约37%含有1个拷贝，约18%实际上含有两个拷贝。

因此，为了更可靠地检测低拷贝，必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性，并克制泊松分布的限制。

评价荧光PCR结果的标准

 因素建议 指标

 效率 5个数量级梯度稀释 Slope～-3.3 R2>0.99

 精细度 至少3个重复 标准差<0.25〔0.5或者1个Ct之内〕

 灵敏度 增加低浓度样本的重复数 统计分析

       除了这些因素，还必须评估和验证适宜的实验对照〔如无模板对照，无反转录酶对照等〕以及模板质量。

3.Real-timeqPCR定量方法可以分绝对定量和相对定量。

绝对定量是用一系列浓度的标准品制作标准曲线，在一样的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进展比拟，从而得到目的基因的量。

该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。

相对定量可以分比拟Ct法和其他一些相对方法。

比拟Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,也称之是2-△△Ct。

3.1绝对定量

3.22-△△Ct定量

3.3其他定量方法

MarisaL.WongandJuanF.Medrano:

BioTechniquesJuly2005

六、Real-TimeqPCR常见问题分析

1.无Ct值出现

检测荧光信号的步骤有误:

一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法那么一般在退火完毕时或延伸完毕采集信号。

引物或探针降解:

可通过PAGE电泳检测其完整性。

模板量缺乏:

对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

模板降解:

防止样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

2.Ct值出现过晚〔Ct>38〕

扩增效率低:

反响条件不够优化。

设计更好的引物或探针；改用三步法进展反响；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

PCR各种反响成分的降解或加样量的缺乏。

PCR产物太长:

一般采用80-150bp的产物长度。

3.标准曲线线性关系不佳

加样存在误差:

使得标准品不呈梯度。

标准品出现降解:

应防止标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

引物或探针不佳:

重新设计更好的引物和探针。

模板中存在抑制物，或模板浓度过高

4.负对照有信号

引物设计不够优化：

应防止引物二聚体和发夹构造的出现。

引物浓度不佳：

适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

镁离子浓度过高：

适当降低镁离子浓度，或选择更适宜的mix试剂盒。

模板有基因组的污染：

RNA提取过程中防止基因组DNA的引入，或通过引物设计防止非特异扩增。

5.溶解曲线不止一个主峰

引物设计不够优化：

应防止引物二聚体和发夹构造的出现。

引物浓度不佳：

适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

镁离子浓度过高：

适当降低镁离子浓度，或选择更适宜的mix试剂盒。

模板有基因组的污染：

RNA提取过程中防止基因组DNA的引入，或通过引物设计防止非特异扩增。

6.扩增效率低

反响试剂中局部成分特别是荧光染料降解。

反响条件不够优化：

可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

反响体系中有PCR反响抑制物：

一般是参加模板时所引入，应先把模板适度稀释，再参加反响体系中，减少抑制物的影响。

7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？

判断标准：

扩增效率，灵敏度，特异性如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。

8.扩增曲线的异常？

比方“S〞型曲线？

参比染料设定不正确（MasterMix不加参比染料时，选NONE）

模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解