Agilent 1200 LC现场培训教材.docx

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Agilent1200LC现场培训教材

Agilent1200LC（中文B02.01C）现场培训教材安捷伦科技有限公司生命科学与化学分析仪器部

一、培训目的：

●基本了解1200LC硬件操作。

●掌握化学工作站的开机，关机，参数设定,学会数据采集,数据分析的基本操作。

二、培训准备：

1、仪器设备：

Agilent1200LC●G1310A:

（单元泵）；G1312A，G1312BXL（二元泵）；G1311A（四元泵）。

●G1329A（标准型自动进样器）。

●G1316A,G1316BXL（柱温箱）。

●G1314B,G1314CXL（VWD检测器）。

●G1362A（示差检测器）。

●G1315B,G1315CXL（DAD检测器）。

●G1365B,G1365CXL（MWD检测器）。

●G1321A（FLD检测器）。

●色谱柱:

ZorbaxEclipseXDB-C18150x4.6mm,5umcolumnP/N993967-902/5063-66002、溶剂准备：

●色谱级纯或优级纯乙腈或甲醇。

●二次蒸馏水

基本操作步骤:

（一）、开机：

1、打开计算机,进入WindowsXP画面。

（IP地址由BootpService程序写入）2、打开1200LC各模块电源。

3、待各模块自检完成后，双击“仪器1联机”图标，或（点击屏幕左下角的“开始”，选择“程序”，选择“AgilentChemstation”,选择“仪器1联机”）化学工作站自动与1200LC通讯，进入的工作站画面如下所示。

4、从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面,点击“系统视图”,“样品视图”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。

5、把流动相放入溶剂瓶中。

6、手动旋开冲洗阀。

7、点击“泵”图标，点击“设置泵„”选项，进入泵编辑画面。

8、设流速：

3-5ml/min，点击“确定”。

9、点击“泵”图标，点击“控制„”选项，选中“启动”，点击“确定”，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，

直到所有要用通道无气泡为止。

10、点击“泵”图标，点击“控制„”选项，选中“关闭”，点击“确定”关泵，手动旋紧冲洗阀。

11、点击“泵”图标，点击“设置泵„选项”，设流速：

1.0ml/min。

12、点击泵下面的瓶图标，选择“溶剂瓶添充量”如下图所示（以四元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。

也可输入停泵的体积，点击“确定”。

（二）数据采集方法编辑：

1、开始编辑完整方法：

●从“方法”菜单中选择“编辑完整方法„”项，如下图所示选中除“数据分析”外的三项，点击“确定”，进入下一画面。

2、方法信息：

●在“方法注释”中加入方法的信息（如：

Thisisfortest!

）。

●点击“确定”，进入下一画面。

3、泵参数设定：

（以四元泵为例）●在“流速”处输入流量,如1.5ml/min，停止时间：

10min。

在“溶剂B”处输入70.0,（A=100-B-C-D）,也可“插入”一行“时间表”,编辑梯度。

在“压力限”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。

●点击“确定”，进入下一画面。

4、自动进样器参数设定:

（以标准型G1329A为例）●选择合适的进样方式,如图所示，进样体积1.0ul,洗瓶位置为6号。

“标准进样”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。

“洗针进样”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。

“使用进样器程序”---可以点击“编辑”按钮进行进样程序编辑。

●点击进“确定”，进入下一画面。

5、柱温箱参数设定:

G1316A:

在“温度”下面的空白方框内输入所需温度,如：

40度。

并选中它,点击“更多信息>>”键,如图所示,选中“与左侧相同”，使柱温箱的温度左右一致。

●点击“确定”，进入下一画面。

G1316B:

在”温度”下面的空白方框内输入所需温度或与检测池一致,并选中它,点击“更多信息>>”键,如图所示,选中“与左侧相同”，使柱温箱的温度左右一致。

或与检测池一致。

●点击“确定”，进入下一画面。

6、VWD检测器参数设定:

G1314B:

在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在“峰宽（响应时间）”下方点击下拉式箭头,选择合适的响应时间,如>0.1min（2s）。

G1314B:

最快采样速率13.74HZ。

●在“时间表”中可以“插入”一行，输入随时间切换的波长，如1min，波长=300nm。

点击“确定”，进入下一画面。

G1314C:

在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在“峰宽（响应时间）”下方点击下拉式箭头,选择合适的响应时间,如>0.1min（2s）。

G1314C:

最快采样速率55HZ。

●在“时间表”中可以“插入”一行，输入随时间切换的波长，如1min，波长=300nm。

点击“确定”，进入下一画面7、DAD检测器参数设定:

G1315B:

检测波长:

254nm,带宽=4nm,参比波长=360nm,带宽=100nm;●检测波长：

一般选择最大吸收处的波长。

样品带宽：

一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。

参比波长：

一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。

参比带宽：

至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。

峰宽（响应时间）：

其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。

狭缝-狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。

同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。

选中所用的灯。

G1315CXL:

可以开启光学单元温度控制;可以设定8通道信号等。

●点击“确定”进入下一画面。

8、RID检测器参数设定:

●色谱条件:

进样体积:

20ul;流速：

1.5ml/min;光学部件温度:

35℃;柱箱温度：

25℃;极性:

正;峰宽（响应时间）:

4s。

●如图所示:

“光学部件温度”---若环境温度控制在±2℃,设定为Off,若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。

“峰宽（响应时间）”---大多数分析设为4S，只有在高速分析下设为更短。

“分析后自动循环”---在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。

●*****点击RID图标，选择“RID控制“：

加热器设为“打开”，若要循环流动相，必须将“再循环阀”设为“打开”。

手动清洗参比池，将其设为“打开”，并输入清洗时间。

●点击“确定”进入下一画面。

9、FLD检测器参数设定:

色谱条件：

●样品：

P/N01018-68704用甲醇稀释为1:

10。

●ODSHypersialcolumn125mmx4.0mmIDX5u.●流动相：

A:

Water35%B:

乙睛65%●进样体积：

5ul;柱温箱:

30℃;激发波长=246nm,发射波长=317nm;PMT=10。

●响应时间=4s.停止时间：

4min。

●激发波长:

200-700nm,步长为1nm,或零级。

●发射波长:

280-900nm,步长为1nm,或零级。

●PMT:

多数应用适当的设定值为10,若高浓度样品峰被切平头,则减少PMT值。

●“峰宽”：

大多数应用设为4s，只有快速分析采用小的设定值。

●多波长及光谱（激发）。

多波长及光谱（发射）。

●同时可以输入范围、步长、采集光谱。

●点击“确定”进入下一画面。

10、在“运行时选项表”中，选中“数据采集”，点击“确定”。

11、从“方法”菜单，选中“方法另存为„”，输入一方法名，如“测试”，点击“确定。

12、从菜单“视图”中，选中“在线信号”,选中“信号窗口1”,然后点击“改变„”钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击“确定”。

（如同时检测二个信号,则重复10,选中“信号窗口2”。

）

13、从“运行控制”菜单中，选择“样品信息”选项，如下图所示，输入操作者名称，如“安装工程师”；在“数据文件”中选择“手动”或“前缀/计数器”。

区别:

手动--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖掉。

前缀/计数器----“前缀”框中输入前缀，在“计数器”框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd数据0001，vwd数据0002„„。

14、点击“确定”,从“仪器”菜单选择“启动系统”。

15、等仪器准备好，基线平稳，从“运行控制”菜单中选择“运行方法”，进样。

（若无自动进样器，则基线平稳后，进样并搬动手动进样阀，启动运行。

）（DAD,VWD色谱图如下所示）

（三）、数据分析方法编辑:

1、从“视图”菜单中，点击“数据分析”进入数据分析画面。

2、从“文件”菜单选择“调用信号”，选中您的数据文件名，如下图所示。

点击“确定”，则数据被调出。

3、做谱图优化：

从“图形”菜单中选择“信号选项”，如下图所示。

从“范围”中选择“满量程”或“自动量程”及合适的时间范围或选择“自定义量程”调整。

反复进行，直到图的比例合适为止。

点击“确定”。

4、积分:

●从“积分”菜单中选择“积分事件”选项，如下图所示。

选择合适的“斜率灵敏度”，“峰宽”，“最小峰面积”，“最小峰高”。

●从“积分”菜单中选择“积分”选项，则数据被积分。

●如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。

●点击左边“√”图标，将积分参数存入方法。

5、打印报告:

●从“报告”菜单中选择“设定报告”选项，进入如下图所示画面。

●点击“定量结果”框中“计算”右侧的黑三角，选中“面积百分比”，其它选项不变。

●点击“确定”。

●从“报告”菜单中选择“打印报告”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则点击“报告”底部的“打印”钮。

（四）RRLC注意事项请使用亚二微米颗粒（1.8m）的色谱柱（RRHT色谱柱）。

注意，如果使用5.0m或3.5m的色谱柱，RRLC仅相当于HPLC！

使用RRHT色谱柱时，如果流速较大且压力较高，关闭泵以前需将流速逐渐降低以避免压力波动过大，保护色谱柱！

请使用0.2m孔隙的滤膜过滤流动相及样品！

请正确安装接头以保证良好的峰形。

如果流速低于0.5ml/min时，尤其是当您使用2.1x50mmRRHT色谱柱时，请确保：

在自动进样器之后使用0.12mm内径的红色管线；同时检测器必须使用半微量池（5ul）或微量池（2ul）以确保良好的峰形；如需控温，则需使用低扩散预热器。

（需订低扩散工具包）

当柱温很高时，可以使用柱后冷却器对流动相降温以保持和检测器温度一致以获得稳定的基线。

（需订低扩散工具包）在低流速下如果要快速变化系统的溶剂梯度，可以旁路阻尼器和混合器，以便将系统的延迟体积从600-800µL减小至120µL。

在低流速下如果要快速变化系统的溶剂梯度，可以使用自动进样器的自动降低延迟体积功能。

您可以利用在线的方法转换工具进行方法转换，网址如下：

prodcol=Y（五）、关机:

●关机前，先关灯，用相应的溶剂充分冲洗系统。

●退出化学工作站，依提示关泵，及其它窗口，关闭计算机（用shutdown关）。

●关闭Agilent1200各模块电源开关。

（六）、Agilent1200LC维护保养：

●色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（乙睛/甲醇适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）。

●手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口。

●流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。

●带seal-wash的1200，要配制90%水+10%异丙醇，开启seal-wash清洗泵，溶剂不能干涸。

。

●注意事项及本手册未包括的仪器见说明书，或由现场工程师介绍****注意：

本教材仅适用于现场工程师培训讲解参考之用，内容为工作站现场培训的一般要求，请根据用户的仪器配置及现场用户的需求进行相应的培训内容增删。

安捷伦公司对本教材可能存在的错误及其后果不承担任何法律责任，我们适时推出新版本的培训教材，恕不另行通知。

维护知识问答为什么溶剂和样品要过滤?

1溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。

色谱柱：

由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。

仪器：

溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。

2为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？

HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。

在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。

缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.清洗液配制:

90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力，不能干涸。

3为什么Agilent1200LC的流动相管路非常细?

在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。

因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。

为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，Agilent1200LC使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。

毛细管线分类：

0.17mm内径------绿色;0.12mm内径-------红色。

PEEK管线：

内径-----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。

毛细管线优点:

柔韧性好.***Agilent公司同时备有1/16in的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户,优点是刚性好,但柔韧性差一些。

4流动相使用前为什么要脱气？

流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。

气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。

溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。

若用FLD，可能会造成荧光猝灭。

常用的脱气方法比较：

氦气脱气法：

利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。

加热回流法：

效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。

抽真空脱气法：

易抽走有机相。

超声脱气法：

流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。

在线真空脱气法：

Agilent1200LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，

无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。

如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？

5、溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4-7）。

以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。

A：

请严格执行溶剂过滤。

B：

请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液C：

如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.D:

在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。

E：

避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。

6Agilent1200LC泵如何维护？

Agilent1200LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相，及时合理的维护非常重要。

A：

流动相使用前请必须脱气、过滤。

B：

使用缓冲盐时，要加在线Seal-wash选项。

C：

关机前，用相应的溶剂充分冲洗系统。

D：

及时更换PurgeValve内的过滤芯。

（当打开PurgeValve时，压力高于10bar，表明过滤芯已堵）。

E：

使用合适的密封圈。

7如何选择合适的泵头活塞密封圈？

泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同的密封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。

（p/n0905-14202/pk）***注意：

聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：

0-200bar；建议在泵的压力限制中，将最大压力设为200bar。

8使用梯度比例阀时要注意那些事项？

当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。

但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常，阀A接水相/盐溶液，D接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。

若颠倒

过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。

强烈建议：

当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通道接在A通道上，有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上；定期用水冲洗所有的通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。

9更换色谱柱时要注意什么事项?

在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。

因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。

为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，仪器的流动相管路连接非常重要,一般Agilent1200LC在第一次安装时,均有受过专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。

客户只需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了，一般柱子入口接头为不锈钢卡套接头，柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧街头，当完成第一次安张后，不锈钢卡套已固定死，当接不同的柱子时，要注意柱子接头处的形状和长度，否则会产生一个非常大的死体积。

下面是不同厂家柱子接头的形状和长度，请参考：