植物体细胞胚胎发生.docx

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植物体细胞胚胎发生

植物体细胞胚胎发生

正常情况下，植物胚胎发生是指受精后的一系列连续过程，即从合子（受精卵）到成熟胚的发生、发育的有规律变化，这种情况下形成的胚成为合子胚。

在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似胚胎的发生和发育过程，这种类似胚的结构称为胚状体。

成熟的胚状体可以像合子胚一样长出根、芽，萌发再生植株。

植物离体培养细胞产生胚状体的过程称为体细胞胚胎发生，植物体细胞胚胎发生具有普遍性，已从200多种植物上观察到胚状体的发生，包括被子植物几乎所有重要的科和一些裸子植物。

在被子植物上，不仅能够从根、茎、叶、花、果实等器官的组织培养物中诱导产生二倍性胚状体，还能从花粉、助细胞和反足细胞中诱导产生单倍性胚状体，从胚乳细胞中诱导产生三倍性胚状体。

一、植物体细胞胚胎发生过程

（一）体细胞胚胎发生过程

虽然不同种类的植物体细胞胚胎发生的主要发育阶段的分划是不一致的，但一般可分为胚性愈伤组织诱导、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎早期分化发育、体细胞胚胎成熟、体细胞胚胎萌发和成苗五个阶段。

在双子叶植物上，体细胞胚胎发生经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚和成熟胚阶段；在乔本科植物的成熟体细胞胚上，可以清楚的看到胚特有的结构，即盾片、胚芽鞘和胚根等。

体细胞胚与愈伤组织的维管系统没有连接，最后会从培养物的表面脱落下来。

（二）胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态的差异

胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态有明显差异。

胚性细胞是一类独特的细胞，它与分生组织类似，通常较小，近圆形，具有较大的核和核仁并能高度染色，胞质浓厚。

多数典型的胚性愈伤组织的外表呈松脆颗粒状。

胚性与非胚性细胞或愈伤组织相比，DNA、RNA以及蛋白质的合成更为活跃，表现为含量和种类的增加、淀粉和可溶性糖含量增加、内源多胺含量升高、活性氧水平提高、同工酶谱和内源激素合成有明显变化等。

如胡萝卜胚性愈伤组织的淀粉含量高出非胚性愈伤组织的15～40倍，挪威云杉非胚性愈伤组织的乙烯生成速率比胚性愈伤组织高19～117倍，龙眼胚性愈伤组织的内源多胺和激素水平都高于非胚性愈伤组织。

（三）体细胞胚胎发生的基因表达机理

离体胚胎发生的基因表达机理目前了解得还不多，主要是从胡萝卜、拟南芥、挪威云杉、苜蓿、火炬松等体胚发生模式植物中得到一些信息。

在植物体胚发生过程中，会出现与基因表达有关的一些列生物大分子的有规律变化。

基因表达的产物以一种活跃的形式表现出来，即在胚性细胞分化与发育过程中有蛋白质含量的变化和特异蛋白质的出现与消失。

胚性蛋白质既可作为调控因子，又可作为结构蛋白、贮藏蛋白和酶蛋白而起作用。

植物体胚发生的过程非常复杂，牵涉到4000多个相关基因，在体胚发育后期，表达的基因可达到10000多个。

体胚发生研究的第一个关键环节是植物细胞胚性的获得。

目前已找到不少有关胚性与非胚性细胞之间基因表达的差异，如发现cdc2（celldivisioncycle2）基因等细胞周期调节基因与胚性的获得有一定的关系。

在胡萝卜、拟南芥、枸杞、龙眼、荔枝等植物体胚发生中都能发现，在胚性愈伤组织中有特异蛋白表达或消失；在梨的早期体胚发生培养物中检测到特异阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabogalactanprotein，AGPS）的表达，AGPS是一种细胞表面的黏蛋白，与植物细胞的生长、发育密切相关，可能作为基因调控蛋白在体胚发生中起作用；在火炬松早期体胚中还检测到脂肪酸脱饱和酶（lipotropicdesaturase，Lpdes）和水孔蛋白的特异表达。

最近，从拟南芥克隆到的LEC1（leafycotyledon1）、LEC2（leafycotyledon2）和BBM（babyboom）基因，能启动植物细胞从营养生长向胚性生长转换，激发体胚发生所必需基因的表达，可以使转基因植株产生体细胞胚胎或类似胚胎的结构。

PKL（pickle）基因调节LEC1的表达，在正常情况下，植物组织的LEC1被PKL所关闭，进行正常的生长发育。

如果PKL基因失去作用，则LEC1会使植物组织出现胚性发育，无法正常成长。

有证据表明，早期胚胎发育状况对后续的胚胎发育有很大影响，即后期胚胎的发育在很大程度上胚胎发育早期就已决定。

在体胚发育后期，有大量晚期胚胎发生丰富（late-embryogenesisabundant，LEA）蛋白表达。

最近，美国学者采用cDNA芯片（cDANarrays）技术对火炬松体胚发生过程的基因表达研究表明，在胚胎发生早期，体胚与合子胚的基因表达模式基本相同，而在后期两者有一定差异。

此外，植物体胚发生还与DNA甲基化密切相关。

非胚性细胞的DNA甲基化程度最好，胚性相关基因的表达受到抑制。

随着DNA甲基化程度降低，胚性相关基因表达，胚性细胞形成。

随着体胚形成与体胚的进一步发育，DNA甲基化程度逐渐升高，抑制胚性相关基因的表达，使体胚发育、成熟。

二、植物体细胞胚胎发生途径

（一）体细胞胚胎发生的方式

由外植体诱导体细胞胚胎发生的途径有两种，即直接途径和间接途径。

直接途径是指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，这种“胚性细胞”是在胚胎发生之前就已“决定”了的，如柑橘的珠心组织、茶树和龙眼的子叶、香雪兰花序等外植体，可以直接诱导出体细胞胚胎。

间接途径是指外植体先脱分化形成愈伤组织，再从愈伤组织的某些细胞，即重新“决定”为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎，多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生的。

这种方式的胚状体形成通常分为两个阶段完成：

①胚胎发生丛（embryogenicclump，EG）的形成。

愈伤组织中常含有两种类型的细胞，一种具大液泡的细胞，通常失去胚胎发生潜能，在培养基中易散开；另一种液泡小、细胞质浓的小细胞，这种小细胞聚集为丛状，被称为EC。

EC表面是高度分化组织化的细胞团，一个EC表面可产生大量的胚状体。

如在胡萝卜属、毛莨属和橘柑属中已证明，每个胚状体来自EC表面的单个细胞。

②胚状体的发育。

EC通常在原培养基上不能使其表面的胚状体发育，但EC可以增殖、崩溃而不衰。

EC崩溃是由于EC中心的细胞增加，并膨胀使EC崩溃，崩溃后分生性的表面细胞结合成群，又形成新的EC。

EC在转入降低或去除生长素、降低还原氮的培养基后，才能完成胚状体发育。

（二）体细胞胚胎的起源

体细胞胚胎究竟起源于单细胞还是多细胞，目前仍然有争论。

但研究结果发现，绝大多数体细胞胚起源于单细胞。

从多种植物的愈伤组织中都可以观察到多个单个胚性细胞及不同发育时期的体细胞胚，多不均等分裂的二细胞原胚和均等分裂的二细胞原胚、多细胞原胚、球形胚和成熟胚等。

脱分化状态的愈伤组织，由于细胞中DNA的合成，为其细胞分裂和分化奠定了物质基础，从而促使某些愈伤组织转变为胚性细胞。

所以无论是直接方式或是间接方式形成的体细胞胚，只有那些已启动脱分化并进行DNA合成的细胞才是胚性细胞分化和体细胞胚形成的细胞学基础。

可见，体细胞胚发生的实质是细胞分化，肌细胞在离体培养条件下，诱导部分基因活化，实现遗传信息的表达。

三、植物体细胞胚胎发生的极性和生理隔离

体细胞胚胎具有两个明显特点：

一是双极限；二是与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，处于较为孤立的状态，即存在生理隔离。

（一）体细胞胚胎发生的极性

单个胚性细胞与合子胚一样，具有明显的极性，第一次分裂多为不均等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基细胞进行少数几次分裂形成胚柄。

体细胞胚发生中极性获得的诱导因子是植物激素和外界刺激。

如白车轴草未成熟合子胚培养在附加6-BA的培养基上，可从下胚轴表皮直接产生体细胞胚，细胞从有规律的垂周分裂变为无规律的平周分裂和斜向分裂。

在没有6-BA时，垂周分裂还持续一段时间。

所以6-BA不一定是进入有丝分裂的关键因子，但它可以改变细胞极性和分裂平面。

在体细胞胚胎发生中沿着胚体的纵轴有一个稳定的电流，它可能与决定状态和极性的保持有关。

极性建立在对细胞分化和体细胞胚发生具有重要的作用。

如小麦胚性细胞的超微结构观察表明，不仅细胞核和质向一端偏移，而且细胞器、核糖体和质体等都有区域性集中分布现象，并和细胞核偏移的方向一致；红豆草体细胞胚形成中DNA合成量也呈极性化集中区域；胡萝卜体细胞胚发生中，DNA和RNA的合成同样具有极性化集中区域，从单细胞第二次分裂后，poly（A）+RNA的合成就有区域性，即使胚胎继续发育受阻，早期的极性化也仍然存在。

（二）体细胞胚胎发生的生理隔离

被子植物的胚囊减数分裂后，形成的大孢子与周围细胞处于分开的状态。

在小孢子发生时，小孢子母细胞在减数分裂前期也与绒毡层的细胞间没有联系。

Steward从胡萝卜体细胞胚中同样观察到与周围细胞缺少联系，而处于孤立状态。

在多种植物中都观察到，早期的胚性细胞与周围细胞还存在胞间连丝，但随着胚性细胞的发育，细胞壁加厚，胞间连丝消失或被堵塞。

胚性细胞开始分裂，从二细胞原胚到多细胞原胚始终被厚壁所包围，与周围细胞形成明显的界限。

从大量的体胚发生观察结果看，生理隔离是普遍存在的，有利于胚胎发生潜力的表达。

由此认为生理隔离是体细胞胚发生的先决条件。

但生理隔离是相对的，并不意味着与周围组织完全隔离开来。

对于从外植体间接诱导的体胚发生，在胚性细胞出现过程中，即重新“决定”为胚性细胞的过程中，从周围那些细胞获取一定的物质、能量和信息可能是必需的。

因此，在这种情况下的体胚发生，产生一定的生理隔离以及与周围细胞保持一定的联系都是必需的。

四、植物体细胞胚胎发生的生理学和生物化学

（一）蛋白质和核酸

1.蛋白质

体细胞胚与合子胚不仅在形态特征上、而且在生化水平上都有相似性，特别是基因表达产物——蛋白质组分上的相似性。

体细胞胚发生过程不仅有蛋白质含量的变化，而且有特异的胚性蛋白质的形成或消失。

在可溶性蛋白质含量上，各类材料中胚性愈伤组织的蛋白质含量和合成速率远高于非胚性愈伤组织。

如石刁柏的体胚发生过程中，球形胚蛋白质含量最高，成熟胚最低。

说明在胚胎发生早期已开始了与胚胎发生有关的代谢程序，而到球形胚期，可溶性蛋白质积累较多，为胚胎的进一步发育提供了物质基础。

2.核酸

胚性细胞不仅核大，核质比高，核仁明显，且具多核仁，并有核仁液泡，变化十分活跃。

根据核仁结构与功能推测，胚性细胞中必然有大量核糖体RNA的合成，并进一步形成核糖体，所以胚性愈伤组织的RNA合成速率明显高于非胚性愈伤组织。

RNA的合成不仅是胚性细胞发生的分子基础，也是体细胞胚正常发育的重要条件。

在体细胞胚发生中，随着体细胞胚的发育，DNA合成量也明显增加。

如小麦体胚发生中，第8d多细胞原胚期DNA合成量已为起始的2倍；第12～24d到达球形胚时，DNA合成量达到峰值。

对胡萝卜体细胞胚发生早期DNA活跃合成细胞（activelyDNAsynthesizingcell，ADSC）与DNA不活跃合成细胞（nonactivelyDNAsynthesizingcellNDSC）之间的分子差异比较后发现，在ADSC中有三种是NDSC内所没有的蛋白质，并认为这些蛋白质可作为DNA合成极化的分子标记物。

胚性细胞DNA复制不仅为细胞增殖奠定了物质基础，也为细胞分化提供了条件。

（二）多胺代谢

多胺（polyamines，PAs）具有多聚阳离子的性质，与核酸相互作用，参与DNA、RNA和蛋白质合成的调节，在转录和翻译水平上对基因进行调控。

多胺与细胞的分裂有关，细胞分裂最旺盛的地方，多胺的生物合成也最活跃。

多胺可能是类似于“cAMP”那样的第二信使，作为植物激素的媒介而起作用。

多胺对植物生长与分化起着重要的作用，参与体细胞胚胎的发生，愈伤组织形成，不定根、不定芽及花芽分化等植物离体培养的形态建成过程。

有关胡萝卜的多胺生物合成变化与体胚发生关系的研究较深入。

多胺合成涉及鸟氨酸脱羧酶（ornithinedecarboxylase，ODC）、精氨酸脱羧酶（argininedecarboxylase，ADC）和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（S-adenosylmethioninedecarboxylase，SAMDC），细胞中多胺水平的增加通常与这三个酶性活性增加相关。

较高含量的多胺及多胺合成酶活性与胡萝卜体细胞胚胎发生密切相关，胚性愈伤组织中腐胺（putrescine，Put）、精胺（spermineSpm）含量比非胚性的高。

ODC、ADC和SAMDC三种酶的抑制剂能使胡萝卜细胞中的多胺水平下降，同时使其体胚发生能力降低，并已证明三种多胺中亚精胺与体细胞胚发生的关系最为重要。

在胡萝卜体胚发生系统中还发现，多胺促进体胚发生是由于抑制了乙烯合成，乙烯和多胺的生物合成都以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）为共同的前体，SAM在1-氨基环烷-1-羧酸（1-aminocydopropane-1-carboxylicacid，ACC）合成酶作用下形成ACC，参与乙烯生物合成。

SAM在SAMDC的作用下脱羧，SAM进入多胺合成途径，作为氨基丙基的供体与Put一起在亚精胺（spermidine，Spd）或Spm合成酶作用下分别形成Spd和Spm。

乙烯抑制胡萝卜体胚发生为多胺处理所颉颃。

（三）糖类、金属离子和微量元素

糖类是诱导植物体细胞胚胎发生不可缺少的重要部分。

在植物体胚发生过程中，糖类不仅提供碳源、维持渗透压，而且可能还起信号分子的作用。

如龙眼体胚成熟培养中，高浓度蔗糖对体胚的正常成熟是必需的；胡萝卜体胚培养中，高浓度蔗糖可以使体胚进入“静止”状态，并且不能为其他糖类所替代；枸杞体细胞胚发生中，蔗糖的浓度在3％～6％的条件下，体细胞胚的诱导频率可维持在一个较高的水平，但蔗糖浓度达到9％时，由于影响到细胞生长的渗透势，抑制了体细胞胚的发生与发育。

淀粉的积累与胚性细胞分化能力和体细胞胚发育时期的转折密切相关。

如小麦的愈伤组织一旦分化为胚性细胞后，就有淀粉粒的积累。

在胚性细胞分化与发育的整个过程中，淀粉的合成出现两次高峰，均在体胚发育的重要转折期。

说明淀粉的合成为体细胞胚的进一步发育和分化提供了必要的物质和能量基础。

金属离子可促进植物组织培养中形态发生，如Ag+、Co2+和Ni2+等金属离子是乙烯合成的抑制剂，它们通过控制乙烯的合成从而提高体细胞胚发生的频率。

某些稀土元素也能提高体细胞胚的发生频率，而且对体细胞胚的正常分化和发育有明显的促进作用。

如在体细胞胚发生过程中，钙、铁、镁等元素的含量发生规律性变化。

（四）内源激素

植物激素的诱导与调节作用在植物体细胞胚胎的发生与发育中起着重要作用。

内源激素代谢和动态平衡在细胞分化中也起着关键作用，内源激素对基因活动起着调控作用，从而影响一系列代谢过程，最终影响植物细胞胚性潜力的诱导、维持和表达。

1.生长素

生长素用于启动细胞分裂和胚性潜力的诱导，促进体胚的早期发育。

多数植物细胞在离体培养条件下诱导胚性细胞发生必须在含2，4-D的条件下进行，其机理可能是2，4-D通过改变细胞内源IAA代谢而起作用。

在植物体胚发生过程中，早期体胚的生长素含量较高，发育后期含量下降。

如龙眼体胚发生过程中，内源生长素含量的变化趋势呈“M”状。

另外，胚性愈伤组织的内源IAA含量明显高于非胚性愈伤组织，在球形胚时期形成一个高峰，以后呈明显下降趋势，尤其是到成熟子叶形胚则大幅度下降。

2.细胞分裂素

高水平的细胞分裂素可能对细胞的分裂和生长是很重要的，但它并不直接参与胚的发生过程。

如龙眼体胚发育过程中，ZT的变化趋势大体上同IAA，但在胚胎发育后期却与IAA不同，呈上升趋势。

细胞分裂素对某些物种的胚状体起着相当重要的作用。

但在另一些物种上，则需要生长素与细胞分裂素适当配合，才能有效诱导胚状体发生。

细胞分裂素对体胚发生的作用机理还不清楚。

3.赤霉素

内源赤霉素对体胚发生的研究不多。

在龙眼体胚发生的过程中，内源赤霉素水平呈下降趋势，并且非胚性愈伤组织中的内源赤霉素水平比胚性愈伤组织高；向培养基中加入GA3合成抑制剂，在一定程度上提高了柑橘体胚形成的百分数；但在柚的体胚发生中，赤霉素却对胚胎发生有促进作用。

胚性细胞和非胚性细胞中内源赤霉素的含量和种类有很大差异。

胚性细胞中含低水平的GA1、单GA4/7的含量较高，非胚性细胞相反。

胡萝卜胚状体的形成受内源GA1的抑制，但对GA4/7的敏感性较小。

4.脱落酸

ABA在种子生长、萌发力控制、种子成熟和休眠等方面起着重要的作用。

近年来研究发现，内源ABA在调节植物体细胞胚胎发育方面也扮演着重要的角色，即内源ABA与胚性能力的启动或表达有关，可抑制体胚早期萌发和畸形胚的发生，防止裂生多胚的产生。

另外，ABA对某些植物体胚发生的特异基因表达起调控作用，可激活相关基因的表达，大量合成储藏蛋白、晚期胚胎丰富蛋白和少量胚胎发生特异性蛋白。

在离体胚培养时，内源ABA作为提前萌发的抑制剂和蛋白质合成的调节剂随着胚的发育阶段而改变。

（五）活性氧

活性氧在生理代谢过程中起重要的调控作用。

研究发现氧化胁迫与细胞分化有关，因此，体细胞胚发生过程必然有氧化胁迫的影响，有其活性代谢的规律。

如枸杞体细胞胚发生过程中，超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidasa，POD）活性有明显变化。

将继代的愈伤组织转入分化培养基后，随着胚性细胞的形成，SOD活性逐渐升高，胚性细胞形成原胚时，SOD活性达到最高峰，说明SOD活性升高对胚性细胞的分化以及早期胚胎发育有促进作用。

在继代愈伤组织中，POD和CAT的活性相对很高，但随着胚性细胞的形成，POD和CAT的活性迅速降低，而SOD活性却逐渐升高。

可见，胚性细胞形成时的愈伤组织的H2O2含量明显高于非胚性愈伤组织，因此，H2O2对胚性细胞的形成及体细胞胚早期发育具有诱导和促进作用。