应用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物.docx

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应用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物

应用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物

148

中国人兽共患病

ChineseJournalofZoonoses

文章编号:

1002—2694（2O11）11—0148—04

应用I:

1蹄疫病毒非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物

张润祥,高明春,王君伟

中图分类号:

S855.3文献标识码:

B

口蹄疫（FootandMouthDisease,FMD）是由

口蹄疫病毒引起的以感染牛,猪,羊等偶蹄动物为主

的急性,热性,高度传染性疫病.世界动物卫生组织

（OIE）将其列为必须通报的多种动物共患传染病之

一

.发达国家往往通过捕杀感染动物和接触易感动

物,限制动物及其产品移动来控制和消灭本病,但

2001年英国暴发口蹄疫后,欧盟允许在暴发口蹄疫

时进行紧急疫苗接种,即实行"免疫存活"政策口].

大多数发展中国家主要采取疫苗免疫的综合防控策

略来控制该病.在采取捕杀政策的国家,如何检测

隐性感染动物,在疫苗免疫国家如何区分自然感染

和免疫动物一直是控制和消灭FMD的重要问题.

因而,建立准确,实用,快速的鉴别自然感染和疫苗

免疫动物的方法必然成为防控FMD的关键技术.

现对FMDV非结构蛋白（NSP）在鉴别诊断领域的

应用及进展作一简要介绍.

1口蹄疫病毒NSP用于鉴别诊断的理论依据

目前使用的FMD疫苗主要为灭活疫苗,去除

了除3D外的绝大部分NSP.疫苗免疫动物后,机

体不产生针对NSP的抗体;动物感染FMDV后,在

病毒到达的嗜性组织中均有病毒增殖,刺激机体产

生的抗体既有针对结构蛋白（SP）的,也有针对NSP

的;而病毒携带者,即FMD持续性感染动物也会产

生抗NSP抗体.因此通过检测NSP抗体可以从免

疫动物中区分出自然感染动物或持续性感染动物.

2口蹄疫病毒NSP免疫特性和抗体消长

FMDV的NSP有I,2A,2B,2C,3A,3B,3C和

3D及它们的前体,清楚了解各NSP在感染动物体

内的免疫原性和抗体消长,为选择合适的NSP建立

高敏感性和特异性的诊断方法提供理论基础.

FMDV的I蛋白免疫原性很弱,感染动物即使

产生抗体,持续时间也比较短,所以检测L蛋白抗

体不能确定动物感染与否].2A只有16-20个氨

基酸,至今未在其上发现抗原表位.2B含有B细胞

*现代农业产业技术体系建设专项资金（No.nycytx一0303）;国家科

技支撑计划（No.2006BAD06A17-08）联合资助

通讯作者:

王君伟;Email:

jwwang@

作者单位:

东北农业大学动物医学学院,哈尔滨150030

表位,但抗2B抗体在ElISA反应中重复性不好,不

宜作为检测抗体].动物感染FMDV300d后仍能

检测出2C抗体],但免疫动物体内短暂含有2C抗

体|5].Mezencio等检测了不同来源感染动物和免

疫动物血清的2C抗体,发现猪,牛血清中的2C抗

体消退得比3ABC快,且免疫动物中存在1～2

的阳性畜_6.

多项研究表明检测3ABC抗体是最可靠的衡量

感染与免疫动物的指标"].Bergmann_】和So—

rensen..分别用原核表达系统和真核表达系统表

达了各NSP蛋白,证明3ABC及其裂解组分是最合

适的鉴别诊断抗原,其中3A免疫原性最强,3C免

疫原性较弱,感染奶牛血清7～10d即可检测到

3ABC,3A和3B的抗体,21d左右达到高峰,随后逐

渐下降,395d时抗体仍为阳性.随后Bergmann用

NSP—ELISA检测感染FMDV的畜群,在900d内,

群体中同时存在着阳性和阴性畜,揭示3ABC抗体

在持续性感染牛体内可能超过3年.Malirat证实

3ABC抗体在人工感染动物持续742d¨6.对3B抗

体的研究表明,牛和猪在364d和301d检测仍为

阳性.

3D是NSP中抗原性最强的蛋白之一,没有型

特异性,用3D免疫扩散试验检测感染牛,4～7d可

检出抗体,持续时间长达3～5个月或更长时间.检

测其抗体是评价动物是否接触过口蹄疫的重要指

标,过去一度是国际贸易必检项目.目前认为仅测

定3D抗体不能区分感染动物与免疫动物,因为在

免疫动物体内也能检测到3D抗体.

3口蹄疫病毒NSP用于鉴别诊断的研究现状

1970年McVicar等首次报道了以3D为抗原的

琼脂扩散（AG1D）试验,可用于鉴别诊断免疫和感

染动物,但在应用过程中发现免疫动物体内存在3D

抗体.因此自上世纪9O年代起,许多实验室开始用

其它NSP取代3D.1990年Berger等用放射免疫

沉淀试验发现免疫动物血清中除有3D抗体外,偶

有短暂的2C抗体,他建议使用2B,3AB1和3C为

检测抗原区分疫苗免疫和自然感染动物.1993

年,Bergmann等用建立的免疫印迹试验分析大肠

2期张润祥等:

应用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别自然感染和疫苗免疫动物149

杆菌表达的NSP抗原性,发现标准疫苗免疫的牛血

清不与任何非结构蛋白反应.Rodriguez等用重组

非结构蛋白3ABC为抗原,用免疫印迹法和ELISA

区分灭活苗免疫猪和自然感染猪,结果发现3ABC

能够鉴别康复猪和免疫猪,但2C和3D抗原则无此

功效.Bergmann和Rodriguez的结果不一致,

Iubroth分析可能是由天然抗原和生物工程抗原构

型差异导致检测结果的偏差.且发现2C抗体在动

物体内持续时间比3ABC短;给动物注射3次疫苗,

均检测不到2C,3ABC的抗体,但在第1次注射疫

苗后的第19d就检测到3D抗体,因此2C和3D不

是鉴别诊断的适合抗原L4J.

迄今为止,国内外发展了多种基于3ABC及其

裂解组分的检测方法l_2"¨.其中原核表达

蛋白是最常用的检测抗原.1997年Diego以大肠

杆菌表达的FMDV3ABC和抗3A单抗,建立了单

抗捕获ELISA,成为意大利的内部（in—house）质控

方法[1.1998年泛美口蹄疫中心（PAHO/wHO）

的Malirat等详细比较了3ABC—I—EIIsA和酶联免

疫电转印技术（EITB）鉴别感染动物的效果,认为前

者是大规模动物检疫,区分疫苗免疫和自然感染动

物的最有效方法l_6].2000年Bergmann进一步发展

了这2种技术,在大规模流行病学监测时用3ABc—

I—ELISA初筛,EITB确诊,配合使用最大限度地保

证检测准确性].随后用此ELISA检测不同地区

的100000份牛血清,为NSP血清流行病学调查做

了深入研究,证明了3ABC方法的实用性ll..发

展成为OIE指定的参考方法（NcPanaftosa—screen—

ingtest）.国内朱彩珠用大肠杆菌表达的3ABC建

立了一种可区分自然感染与疫苗免疫牛的间接

EIISAE].随后曹轶梅,卢曾军等]以原核表达

的3ABC为检测抗原建立了鉴别诊断牛,猪,羊的间

接ELISA试剂盒,临床大规模应用表明具有较好的

敏感性和特异性,与Ceditest~试剂盒的符合率为

98.05（302/308）,与UBI试剂盒的符合率为

93.2（287/308）,成为国内防控口蹄疫进行NSP

血清监测的参考方法.

真核表达系统与原核表达系统相比有许多优

点,例如表达蛋白的糖基化,表达产物中无引起非特

异性反应的细菌蛋白污染等.Sorensen用杆状病

毒表达系统高效表达了3D,3AB和3ABC,并使用3

种抗原分别建立竞争EIISA.3种方法在人工感染

的牛和羊8d到10d后均可检测到特异性抗体,其中

牛的抗体可持续395d以上,进一步证明了3AB和

3ABC—ELISA作为鉴别诊断方法的可靠性_1.

Chung等用此3AB—EIISA用于台湾猪FMD的清

除计划,结果发现育肥猪和母猪感染后抗体阳性期

持续16星期到3.5年,猪10次免疫后仍未检测到

抗体口.2005年Sorensen对前期建立的竞争

EIISA做了改进,用抗3B单抗L74D5,代替豚鼠抗

血清作为包被抗原捕获3ABC,同时用辣根过氧化

物酶标记此单抗作为竞争抗体,进一步提高了检测

特异性.发展成为国际知名的Ceditest~FM—

DV—NS检测试剂盒,具有广泛的应用.

然而一些在牛体上的实验也显示,少数免疫动

物体内存在3A抗体,这有可能是疫苗中微量

的3A蛋白残留,也有可能是一些交叉抗原的抗体

所致.总之,这会影响基于3ABC或3AB检测方法

的特异性.近年在FMDV鉴别诊断抗原的研究中

越来越倾向于使用3ABC中更小的抗原性短肽或抗

原表位.抗原表位多集中于3B上,71个氨基酸含

有至少7个不同的抗原表位,且这些表位与相应抗

体的结合力极高口],因此应用这些表位进行鉴别诊

断有很高的特异性.Shen等于1999年合成涵盖了

2C和3ABC的氨基酸序列的重叠多肽片段,鉴定出

FMDVA12株上的数个B细胞抗原表位,随后合成

了3B上57个氨基酸短肽,并在检测多种动物血清

中证明了合成肽ELISA用于鉴别诊断的有效

性_】.基于此,美国联合生物制药公司（UBI）在

2000年推出合成肽EIISA试剂盒,已在多个国家

和地区使用.SunTao等人采用基因分段表达法,

筛选到（）/HKN/14/82株FMDV3ABC上高结合

力,保守的2个感染相关线性表位,用表达的串联了

6段表位的多肽建立了间接ELISA用于猪的鉴别

诊断.韩国学者在2007年建立的表位阻断

EIISA（epitope—blockingELISA）,敏感性和特异性

分别是98和100,所用单抗针对的表位与

H01ich等所鉴定出的3B核心重复基序QKPIK

相.

4口蹄疫病毒NSP用于鉴别诊断面临的问题和解

决方案

4.1灭活疫苗中含有痕量NSP蛋白即便现代疫

苗生产的工艺已经很高,但FMD疫苗仍含有痕迹

量的NSP,完全去除NSP所投入的成本对某些发

展中国家是难以承担的.免疫特别是多次重复免疫

之后,痕量的NSP蛋白可能刺激机体产生抗体,但

除3D外,其他NSP抗体水平很低.Lee等用2种

商品化试剂盒检测台湾人工重复免疫牛和田间免疫

牛时,发现多次免疫牛特别是大于2岁的牛能检测

出NSP抗体.Bergmann在EITB中,偶尔也发

150中国人兽共患病

现重复免疫的老龄牛血清可与5个非结构蛋白

（2C,3A,3B,3ABC和3D）中的一个或多个发生反

应.他建议为了避免假阳性,应采2岁以下牛的血

清检测.也可用NSP短肽或表位ELISA增加检测

的特异性.所以在进行血清学调查时,应充分考虑

动物年龄,免疫史,健康状况和所用疫苗的纯度等.

4.2重组抗原与被检动物自身的无关抗体存在交

叉反应目前用于鉴别诊断的抗原大多是重组表达

蛋白.所面临的问题一是难以排除表达系统蛋白的

干扰,二是重组抗原含多个表位可能和其他小核糖

核酸病毒形成交叉反应.Shen等人在既没感染

也未免疫的动物血清中发现大肠杆菌抗体,同样对

昆虫蛋白抗原观察的结果表明它们能导致非特异性

反应.Shen等用化学合成肽ELISA部分解决了这

一

问题口.也可在血清稀释液中加入大肠杆菌裂

解液等阻断试剂来提高检测方法的特异性l_7'9,11].

4.3单一NSP方法对持续性感染动物检出能力不

足多项研究表明单一的NSP—EIISA很难区分携

带者（carriers）和仅仅是接触过口蹄疫病毒但感染

后又快速完全清除病毒的康复动物,特别是检测持

续性感染的动物,NSP方法的敏感性较低.

Bergmann用OIE参考方法3ABC—I—ElISA检测临

床持续性感染牛和亚临床感染牛的敏感性低于

97,他分析这种现象与奶牛处于高免疫抗体水平

的压力,暴露于病毒的时间太短等因素有关l_】.因

此单一的NSP—EIISA在免疫牛群中检测不到NSP

抗体,并不能完全代表此牛群无携带者2.针对这

种情况,各国学者提出了如下解决办法:

1）配合使用

3ABC—ElISA和EITB,前者用于筛查,后者用于确

诊.2）采用2种或2种以上ELISA方法以获

得临床检测上的高度敏感性和特异性[2.3）采取

咽/食道分泌物（（）/P液）进行病毒分离和PCR检

测及检测唾液IgA抗体综合确诊持续性感染动

物.4）采用新型诊断技术如液相微阵列技术检

测多种NSP抗体.

44NSP诊断方法的标准化

各种NSP诊断方法都是在不同国家和地区单

独建立起来的,需要评价其在不同地区检测不同状

态（天然,免疫,未免疫感染,免疫感染,持续性感染

等）动物的特异性和敏感性.2004年起,英,意,荷

等多国科学家对来源于多个国家的牛,羊,猪等

3551份血清进行了比较检测,评估6种ELISA方

法的实效性l2.然后通过贝叶斯分析,ROC曲线

和极大似然值法比较分析各ELISA的检测能

力.英国Pirbright实验室和泛美VI蹄疫中心分

别制作了牛血清盘,作为参考或质控血清评估各种

NSP方法_l2.NSP方法的规范化和标准化,利于

全球协作防控FMD.

5口蹄疫病毒NSP用于鉴别诊断的新思路

为适应快速,准确鉴别FMD感染动物和免疫

动物的需求,NSP诊断技术向着简便,实用,高特异

性和敏感性方向发展.目前有如下探索:

1）提高基

于重组蛋白和单抗的NSP抗体检测方法的特异性

和敏感性,如发展针对3ABC及其表位的竞争和阻

断EIISAllJ.2）建立一步法ElISA.Foord等用

噬菌体展示肽库技术,获得鸡重组抗口蹄疫病毒抗

体（CRAb—FM）,将针对3B的单链抗体和碱性磷酸

酶重组表达后和被检血清共同孵育,加底物显色,发

展了一步法竞争ELISAEso].体现了试剂的均一性

和短时间内制备出大量试剂的优越性.3）发展多重

抗原检测技术（MultiplexedNSPassay）.应用

NSP和表位肽建立的多重EIISA可以提高鉴别诊

断方法的特异性和敏感性llJ.2007年,Perkins

等运用Iuminex液相芯片技术对感染和免疫动

物的FMDVNSP3ABC,3A,3B和3D进行检测研

究.他们将合成和重组表达的NSP共价结合在带

一

定比例红橙荧光染料微球的羧基端,再用Iumi—

nex系统检测.1h内完成试验,初步估算每个样品

耗费0.5美元,适合于大规模血清学监测.4）适用

于现场应用的免疫胶体金层析试纸在多个国家的实

验室正在研制中.

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