S腺苷甲硫氨酸制备方法的研究进展可编辑.docx
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S腺苷甲硫氨酸制备方法的研究进展可编辑
S-腺苷甲硫氨酸制备方法的研究进展
亿亏与生物呈...
综逑毫论Ⅱ腺苷甲硫氨酸制备方法的研究进展
牛卫宁,左晓佳,王丽衡。
钦传光
西北工业大学生命科学院,陕西西安
摘要:
腺苷甲硫氨酸是生物体内重要的生理活性物质,参与多种生化反应,临床上被广泛用于治疗抑郁
症、神经紊乱、肝病、关节炎等。
综述了制备方法的研究进展,述及的制备方法包括化学合成法、微生物发酵
法、体外酶促合成法以及全细胞催化法。
关键词:
腺苷甲硫氨酸;微生物发酵法;体外酶促合成法;全细胞催化
中图分类号:
文献标识码:
文章编号:
?
一一腺苷甲硫氨酸,国内使用的主要是德国基诺和意大利
是广泛存在于生物体内的一种重要代谢中间体,...两个外资公司的产
品,其价格昂贵,远远不能普及使用。
我国有众多的肝
年首先由发现,相对分子质量。
是
双手性物质,具有种异构体:
一和,一炎、关节炎以及抑郁症患者,的需求量也将不断
增长,产品的市场开发前景广阔。
只有,一具有生物活性。
在生物体内,
随着需求量的日益增大,建立廉价有效的是由一甲硫氨酸?
和三磷酸腺苷生产工艺是其大规模推广应用的关键,因此有关
经合成酶的制备方法成为研究热点。
的制备始于
催化合成图。
‘世纪年代,目前主要有化学合成法、微生物发酵
法、体外酶促合成法以及全细胞催化法。
作者在此
论述了有关制备方法的研究进展和发展趋势。
\化学合成法
目前,化学合成法制备主要有条途径:
①
图的生物合成
利用一甲硫腺苷和一一氨基一一溴丁基酸化学合成.
消旋的,合成的有具有生物活性;②
由于含有一个能激活相邻碳原子的亲核攻
通过腺苷同型半胱氨酸,
击反应的高能锍原子,因而具有转甲基、转硫基、转氨和甲基供体。
或。
。
催化合成,反应
丙基等作用。
参与了体内多种生化反应,与
底物价格昂贵,而且产物中含有~没
蛋白质、核酸、神经递质、磷脂质和维生素的合成密切
有生物活性的,一异构体;③以价格低廉
相关,并连接多胺和谷胱甘肽的转化】。
在欧洲,
的腺苷为底物和亚硫酰氯?
已作为处方药广泛用于肝病、抑郁症、关节炎等进行反应制备一氯甲基腺苷盐酸盐?
疾病的治疗;在美国,已经成为一种畅销的保健;以一甲硫氨酸为
品;在我国,制备方法的研究尽管进行了底物在一~一℃的条件下生成一同型半胱氨酸
一;以一氯甲基腺苷盐酸盐和一同
年,但因技术水平较低、成本过高仍未能产业化。
目前
基金项目:
国家自然科学基金资助项目,中国博士后科学基金资助项目,西北工业大学青年科技创新基
金资助项目,西北工业大学科技创新基金资助项目
收稿日期:
一一作者简介:
牛卫宁一,男,山西运城人,博士,讲师,主要从事药物化学研究;通讯联系人:
钦传光,教授,?
:
?
..,.。
牛卫宁等:
腺苷甲硫氨酸制备方法的研究进展/年囊期
目
到一株口口忌一菌,在培养基
型半胱氨酸为底物在~℃的条件下进行缩合反
中产量为.?
.。
。
在含有%蔗糖、
应得到腺苷同型半胱氨酸、;以三甲基氧翁四
.尿素、酵母粉、.~.一甲硫氨酸的
氟硼酸盐为甲
培养基中发酵后,产量高达.。
。
基供体对进行甲基化得到终产物。
尽管
这是目前文献报道的野生菌株发酵生产的最高
该方法原料价格低廉,但是反应过程复杂、反应温度极
端、反应周期长,并且反应产物仅有~具有产量。
.重组菌发酵生产
生物活性。
由于化学法合成存在产率低、反
应条件苛刻、反应产物异构体多、分离纯化困难以及环为了解决野生菌发酵生产产量较低的问
境污染等不足,现已很少使用。
题,通过基因工程技术以及代谢调控来有效提高
的产量得到了广泛应用。
对于生产菌株的遗
微生物发酵法
传改造主要有以下种途径:
微生物发酵法是世纪年代至今工业化生产通过高效表达酿酒酵母腺苷甲硫氨酸合成酶来提高细胞内合成酶的活性,从而提高的主要途径。
一些微生物尤其是酵母属口一的菌株,在含有一甲硫氨酸的培养基中生的产量。
等将来源于酿酒酵母的合成酶基因置于醇氧化酶启动子
长时,可以在细胞内积累较高浓度的。
通过这些
微生物的大规模发酵及提取精制,可获得有生物活性的调控下,构建重组质粒并转化毕赤酵母甜口口,在摇瓶中考察了甲醇添加量
的。
对产量的影响。
结果表明,添加甲醇时,
.天然菌株发酵生产
董函竹等考察了培养基组成和培养条件对酿酒最高产量为.。
;添加.甲醇时,在
酵母一?
发酵生产的影响。
结果表明,.发酵罐中培养约后,产量达到.。
进一步考察了发酵过程中浓度对
在发酵罐中间歇培养后,一次性补加葡萄糖和.一甲硫氨酸,继续培养产量的影响,结果表明,当浓度为时,的产量达到.¨。
后产量可达.~。
李海军等考察了培养基中蔗糖、一甲硫氨酸、酵敲除胱硫醚合酶基因,阻断和
母粉以及尿素含量对酿酒酵母。
&一甲硫氨酸转化为半胱氨酸的途径,增加细胞内发酵生产的影响。
结果表明,在的积累。
等】在毕赤酵母中表达了腺苷
含有~蔗糖、.一甲硫氨酸、酵母粉、甲硫氨酸合成酶,同时敲除毕赤酵母中
.~/尿素的培养基中间歇分批补料发酵,培养分解代谢途径的基因,使重组菌产量比原后产量达到.。
始菌株提高了倍,在发酵罐中培养约后
刘沛溢等】。
。
研究了补加一甲硫氨酸对酿酒酵母产量达到.。
邓娟娟进一步对该高密度发酵生产的影响。
结果表明,采取菌种的发酵参数和补料工艺进行了系统的研究和优
流加方式补加前体一甲硫氨酸能够促进的积化,在发酵罐中平均产量达到了?
累,以的速率流加一甲硫氨酸,流加结
~,将发酵规模扩大到,产量达到了束后积累量达到.?
矗。
。
另外,刘左右,这是目前文献报道的最高产量。
沛溢等口还考察了种氨基酸对酿酒酵母?
解除对甲叉四氢叶酸还原酶
高密度发酵生产的影响。
结果表明,添加一胱的反馈抑制,提高的细胞内积累量。
酿酒酵母有个同功酶和;
氨酸、一半胱氨酸、一赖氨酸、一组氨酸和一甲硫氨酸
对的积累有利,在发酵罐中最高产量研究表明在酵母细胞中同功酶是其
为.?
。
活性的主要来源,催化,一甲叉四氢叶酸一
等口利用酿酒酵母同时生产和生成一甲基四氢叶酸?
。
。
~
谷胱甘肽,采用两阶段补料分批培养。
第一阶段实现是甲硫氨酸合成的甲基供体,而甲硫氨酸是合
酵母细胞的高密度培养;第二阶段加人一甲硫氨酸诱成的前体,同时对具有反馈抑制效应。
导的生成,最终的产量达到.一。
因此,如果能解除对的反馈抑制,酵母等从多株不同的菌株中筛选分离细胞中以及甲硫氨酸的含量将大幅提高。
基于牛卫宁等:
腺苷甲硫氨酸制备方法的研究进展/年囊期
■
此研究思路,等口构建了一个由的端
纯化困难。
因此,通过基因工程菌表达大量高活性的
催化部位以及拟南芥胁。
合成酶成为酶促合成法生产的关键。
目
的端调控部位构成的嵌合一,前,研究较多的是大肠杆菌合成酶、酿酒酵母
解除了对的抑制效应,构建的重组酵合成酶以及大鼠肝脏合成酶。
母积累的以及甲硫氨酸分别比野生酵母.大肠杆菌合成酶
提高了倍和倍。
大肠杆菌合成酶是由个相同亚基构成的构建能将分泌至培养液中的重组大肠同源四聚体,每个亚基包含个氨基酸残基,由大肠
杆菌。
大肠杆菌发酵生产与酵母菌发酵生产
杆菌基因编码。
等最先克隆了相比具有显著的优点。
首先,大肠杆菌发酵生产基因,并构建了表达合成酶活性比原始的周期短,而酵母菌发酵生产的周
菌提高倍的重组大肠杆菌/?
。
期一般超过;其次,大肠杆菌发酵生产的
韦平和等使用诱导型表达载体表达的重
可以分泌到培养基中,从而简化了纯化方法,提
组合成酶占到菌体总蛋白的.,但表达的
高了产率。
基于大肠杆菌分泌制备的优
酶多为包涵体,重组菌酶活性仅为原始菌株的倍;笔
势,德国电化学工业有限公司构建了能高效表达大鼠者也构建了高效表达合成酶的重组大肠杆菌,
肝脏合成酶的重组大肠杆菌/?
重组菌酶活性比原始菌酶活性提高了倍论文待,在含有培养基的摇瓶中发酵后
发表。
产量为。
为了解决难于从
在大肠杆菌合成酶催化底物和?
细胞内输出而导致培养液中含量较低的问题,合成的反应中,当底物浓度超过.
进一步在重组大肠杆菌中高效表达了基时会发生产物抑制现象,导致反应难以进行。
因,该基因的产物是一种转运蛋白质,可以将多种小分等研究发现,对甲基苯磺酸钠一等
一
子转运出细胞。
将构建的重组大肠杆菌/
些具有较大阴离子基团的化合物可以解除合在含有培养基的摇瓶中发酵后
成酶的产物抑制现象,在.?
存产量为,但作者并没有报道发
在的条件下,大肠杆菌合成酶可以将酵罐中产量。
一的,甲硫氨酸在内完全转化。
国内发酵生产的菌种主要为野生酿酒酵母
.酿酒酵母合成酶
以及重组毕赤酵母,但产量大多偏低,且酵母菌
酿酒酵母具有种合成酶:
合成酶
发酵生产存在生产周期长、底物转化率低、纯化和合成酶。
研究发现
工艺复杂以及能耗高等缺点,从而导致价格居
表现出较强的底物抑制现象,而则没有此现
高不下。
因此,构建能大幅提高产量的重组大
象。
因此,构建高效表达的重组菌,然后提取
肠杆菌,在较短的发酵周期内将分泌至培养基用于催化合成是制备的有效途径
中,然后提取精制是发酵法制备的有效途径。
之一。
杨静等。
在大肠杆菌中表达了,重组菌
体外酶促合成法合成酶活性比宿主菌提高了.倍;席珥在
体外酶促合成法是利用合成酶在体外催化
毕赤酵母中表达了,在发酵罐中诱导表达和一甲硫氨酸生成有生物活性的,一,后,表达量达到.。
约占菌体总
并且合成酶具有三磷酸酶活性,将反应中产生
可溶性蛋白的,破碎细胞提取粗酶液催化合成
的三磷酸分解为焦磷酸和磷酸,酶促反应如,反应基本可将约的一甲硫
下:
氨酸完全转化;等。
。
构建了分泌表达的重?
兰?
?
?
鱼堕鳖,』Ⅵ十十组毕赤酵母/?
在含有培
体外酶促合成法与化学合成法和微生物发酵法相养基的摇瓶中连续诱导~,表达量达到最
高,约为。
然后通过亲和层析将
比,具有底物转化率高、反应周期短、产物纯度高分离
固定在离子螯合柱上,固定化酶可以将.
纯化容易以及无污染等优点,成为近年来制备
的研究热点之一。
合成酶广泛存在于生物体内,甲硫氨酸转化为,经过次连续循环反应,固
但合成酶在生物体内含量少、酶活性低,且分离定化活力回收率为.,比活力约为游离酶牛卫宁等:
腺苷甲硫氨酸制备方法的研究进展/年囊期
■
性化处理的大肠杆菌游离细胞作为催化剂催化
的.,固定化酶的活性回收率以及稳定性并不
和一甲硫氨酸生成。
固定化细胞催化合成
理想。
.大鼠肝脏合成酶的技术路线如下:
构建高效表达合成首次使用从大鼠肝脏提取的合成酶的重组大肠杆菌,使用包埋剂海藻酸钙、明胶、聚乙
酶催化和一甲硫氨酸合成,但是生物体内烯醇等将游离细胞固定化。
以固定化细胞作为催合成酶含量较低,很难大量制备。
随后化剂催化和一甲硫氨酸生成。
与体外酶等。
。
构建了表达大鼠肝脏合成酶的重组促合成法相比,全细胞催化不需要酶的分离纯化,并且
大肠杆菌,重组菌的表达量比宿主菌约增加具有酶回收率高、稳定性好、重复利用率高等优点。
倍,每升培养基含量为。
等构建了表笔者构建了能高效表达大肠杆菌合成酶的
达大鼠肝脏合成酶的重组大肠杆菌.∞重组大肠杆菌,重组菌酶活性比原始菌提高了倍,一,表达的重组酶活性为.同时研究了不同的固定化介质和方法对细胞合
~,单位酶活性为.。
成酶活力的影响,结果表明使用海藻酸钙固定化
国内外通过体外酶促合成法大规模制备的的细胞连续反应批次后,固定化细胞酶活力为初始
研究相对较少,合成酶的表达量较低。
在毕赤酵最高酶活力的;固定化细胞在℃反应,底
母中表达存在发酵周期长以及纯化繁琐等问物.的转化率超过论文待
题,并且催化合成反应也存在着底物浓发表。
度低以及反应时间长等不足;重组大肠杆菌表达的大结语
鼠肝脏合成酶活性较低,不足以用于的大
规模制备;而大肠杆菌合成酶的表达量较高,酶制备方法研究的关键是降低生产的
的催化效率高,且大肠杆菌合成酶产物抑制问
成本。
化学法合成由于存在产率低、反应条件
题可以通过在反应液中添加对甲基苯磺酸钠来解决。
苛刻、反应产物异构体多、分离纯化困难以及环境污染
因此,大肠杆菌合成酶是催化合成的理想
等不足,很难进行工业化生产;酵母菌发酵生产
酶源。
另外,与游离酶催化相比,固定化酶既保持了酶
存在生产周期长、底物转化率低、纯化工艺复杂以及能
的催化特性,又克服了游离酶的不稳定性,具有可反复
耗高等不足,导致价格居高不下;体外酶促合成
或连续使用、易与反应产物分离等显著优点。
因此,提
法克服了发酵法的不足,但也存在合成酶活性
高大肠杆菌合成酶的表达量并对酶固定化条件
较低、酶分离纯化繁琐以及酶固定化后活性损失较大
进行研究,然后通过固定化酶催化合成是体外
等问题。
和以上种制备方法相比,固定化重
酶促合成法生产的有效途径。
组大肠杆菌细胞催化合成具有反应周期短、底
物转化率高、产物纯度高、产物分离纯化容易、不需要
全细胞催化法
酶的分离纯化和固定化、酶活性损失小、固定化细胞能
目前,国内外主要利用合成酶活性高的酵
反复使用等优点,是大规模、低成本、高效率生产
母菌发酵法制备,尽管在的发酵罐中
的一条新途径。
产量可以达到~,但存在着生产参考文献:
。
。
.。
周期长、底物转化率低、纯化工艺复杂以及能耗高等缺.,,:
一.
点,体外酶促合成法克服了发酵法的不足,同时生产成。
.?
一:
本较低,是较为有效的工业化生产方法。
长春奇健和?
。
.开平牵牛已具备酶法生产的能力,但是体外酶促合成,,:
.
法仍存在酶活性低、酶分离纯化繁琐以及酶固定化活汤亚杰,李艳,李冬生,等.腺苷甲硫氨酸的研究进展.生物
技术通报,【,:
?
.
性损失较大等问题。
牛卫宁,钦传光,王莉衡,等.一种利用整细胞催化合成腺苷甲硫
基于以上认识,笔者建立了全细胞游离细胞和固
氨酸的方法.【【】.,?
?
.
定化细胞催化合成的方法,并申请了专利。
,.:
游离细胞催化合成的技术路线如下:
构建高.效表达合成酶的重组大肠杆菌,使用有机溶剂,,:
?
..
或表面活性剂对重组细胞进行透性化处理。
以透
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