精品禽用中药抗病毒冲剂的研制与应用.docx
《精品禽用中药抗病毒冲剂的研制与应用.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《精品禽用中药抗病毒冲剂的研制与应用.docx（23页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
精品禽用中药抗病毒冲剂的研制与应用
【关键字】精品
《禽用中药抗病毒冲剂的研制与应用》
技术总结报告
我国养禽业虽已走向集约化生产之路，但由于种种原因家禽发病率仍居高不下，特别是鸡的新城疫、法氏囊传染、传染性支气管炎等病毒性疾病给养禽业造成很大的经济损失。
市场上虽有多种治疗病毒性疾病的药物，但由于质量和使用不当，导致大量和反复用药，造成禽产品药物残留超标，从而对人类身体健康和环境造成许多不利影响。
为解决这一难题，我们在祖国传统中兽医理论指导下，结合现代医学的研究方法，经过对组抗病毒制剂组方、剂型与剂量、生产工艺等的严格筛选，研制出“禽喘康颗粒冲剂”。
采用鸡胚病毒抑制试验，研究并取得了“禽喘康颗粒冲剂”杀灭病毒的时间和浓度；经过临床试验及田间推广试验研究了“禽喘康颗粒冲剂”对人工感染和自然发病的病毒性与细菌性疾病的防治效果；经过毒性试验研究了对家禽的毒副做作用；同时还进行了“禽喘康颗粒冲剂”的稳定性试验并起草了质量标准，取得了满意的效果。
一、“禽喘康颗粒冲剂”最佳组方和剂型、剂量筛选的研究
1、最佳组方的筛选试验：
依据传统中兽医的理、法、方、药与现代中药的研究成果，结合家禽病毒性传染病的临床症状，参考众多资料，选定金银花、连翘、大青叶、板蓝根、浙贝、杏仁、黄芩、大黄、薄荷、芦根、牛旁子、桔梗、荆芥、豆豉、竹叶、甘草等10余种具有清热解毒、止咳化痰、平喘的中药材作为处方选用药。
由单味、复味、多味中药各组成3个组方，共9各组方，通过人工混合感染传染性支气管炎和鸡副嗜血杆菌的疗效对比试验，分两步进行最佳组方的筛选试验。
第一步从9个组方中筛选出3个组方，第二步再从第一步筛选出的3个组方中筛选出1个最佳组方，作为“禽喘康颗粒冲剂”的定型方：
金银花30g大青叶30g杏仁20g板蓝根30g桔梗30g浙贝20g黄芩20g连翘30g甘草10g（见表1、表2）。
表1：
组方初步筛选结果
组别
1组
2组
3组
4组
5组
6组
7组
8组
9组
空白组
试验数（只）
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
发病数（只）
16
15
16
14
15
17
16
15
17
16
发病率（%）
53.3
50.0
53.3
46.7
50.0
56.7
53.3
50.0
56.7
53.3
死亡数（只）
10
9
10
8
8
8
6
6
5
13
死亡率（%）
33.3
30.0
33.3
26.7
26.7
26.7
20
20
16.7
43.3
存活数（只）
20
21
20
22
22
22
24
24
25
17
存活率（%）
66.7
70.0
66.7
73.7
73.7
73.7
80.0
80.0
83.3
56.7
显效时间（天）
7
7
7
6
5
5
4
4
3
14
症状消失时间（天）
12
13
14
10
11
10
7
7
7
21
表2、不同方剂的疗效对比
组别
7组
8组
9组
空白组
试验数（只）
30
30
30
30
发病数（只）
13
14
13
14
发病率（%）
43．3
46．7
43．3
46．7
存活数（只）
24
25
27
18
死亡数（只）
6
5
3
12
死亡率（%）
20.0
16．7
10．0
40．0
存活率（%）
80.0
83.3
90.0
60.0
显效时间（天）
5
3
3
10
症状消失时间（天）
7
6
5
20
2、最佳剂型的筛选
由于剂型严重影响药物的疗效，我们将组方制成散剂、汤剂、冲剂三种剂型，通过鸡人工感染传染性支气管炎的疗效对比试验对剂型进行筛选。
试验结果表明，汤剂与冲剂的治疗速度疗效显著优于散剂组，汤剂与冲剂差异不明显，但颗粒冲剂具有使用、运输、储存方便等优点，最后定型为颗粒冲剂。
详见下表。
组别
散剂组
汤剂组
颗粒剂组
空白对照组
试验数（只）
30
30
30
30
发病数（只）
13
14
13
14
发病率（%）
43．3
46．7
43．3
46．7
存活数（只）
25
28
28
18
死亡数（只）
5
3
3
12
死亡率（%）
16．7
10．0
10．0
40．0
存活率（%）
83.3
93.3
93.3
60.0
显效时间（天）
5
3
3
症状消失时间（天）
10
6
6
20
3、剂量筛选试验
通过对鸡人工混合感染鸡副嗜血杆菌和传染性支气管炎病毒的疗效观察，筛选出该制剂的最佳剂量为治疗量为0.5%预防量减半，连续使用5~7天为一疗程。
表、制剂治疗IBV和鸡副嗜血杆菌混合感染临床试验结果
组别
试验数（只）
发病数（只）
康复数（只）
死亡数（只）
治愈率（%）
发病率（%）
死亡率（%）
1
30
2
30
13
11
2
84.6
43.3
6.7
3
30
12
10
2
80.0
40.0
6.7
4
30
14
8
6
57.1
46.7
20.0
5
30
13
9
4
69.2
43.3
13.3
6
30
0
0
0
7
30
20
12
8
66.7
26.7
二、禽喘康颗粒冲剂鸡胚内病毒抑制试验
我们采用鸡胚法，经过预试验、作用时间梯度与作用浓度梯度试验，研究了禽喘康颗粒冲剂在鸡胚上对NDV（Lasota）、IBV（M41）的抑制或杀灭效果与体外作用时间、药物浓度的关系；抑制或杀灭病毒的最大浓度与最短作用时间。
试验结果表明：
“禽喘康颗粒冲剂”直接与相应病毒作用10min对含100EID50的NDV的保护率为100%，对NDV具有较强的杀灭作用，金刚烷胺无保护；对M41（1:
10）的保护率为87.5%，对M41（1:
100）的NDV的保护率为100%；而西药病毒灵对M41（1:
10、1:
100）无保护。
若将原液稀释100倍NDV（Lasota）仍然有杀灭作用。
同时表明“禽喘康颗粒冲剂”对NDV的抑制作用优于西药病毒灵和金刚烷胺。
表1NDV作用时间梯度试验
组别
血凝价
NDV病毒对照
10
11
11
11
11
11
10
10
10
11
11
NDV病毒+药物+终止液（10min）
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
NDV病毒+药物+终止液（20min）
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
NDV病毒+药物+终止液（30min）
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
NDV病毒+药物+终止液（40min）
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
NDV病毒+药物+终止液（50min）
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
NDV病毒+药物+终止液（60min）
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
表2NDV作用浓度梯度试验之一固定药物稀释病毒
组别
血凝价
10-1＋中药
9
10
10
10
8
10
10
10
10
10-2＋中药
9
9
8
10
9
9
7
8
10-3＋中药
0
9
9
0
0
9
7
0
0
10-4＋中药
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10-5＋中药
0
0
0
0
0
0
0
0
10-6＋中药
0
0
0
0
0
0
0
0
0
病毒对照（10-6）
9
9
10
9
9
8
10
9
10
9
中药对照
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10-3＋病毒灵
9
9
7
9
10-4＋病毒灵
9
9
9
10
表3NDV作用浓度梯度试验之二固定病毒稀释药物
组别
血凝价
原液＋病毒
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10-1＋病毒
7
5
6
6
8
8
7
8
7
8
10-2＋病毒
6
7
9
7
7
8
8
5
10-3＋病毒
7
7
8
8
8
8
7
8
8
10-4＋病毒
9
8
5
8
9
9
7
9
10-5＋病毒
7
5
9
9
9
8
10
10
9
10-6＋病毒
10
9
9
10
9
9
10
10
10
硫代硫酸钠
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
表4IBV作用时间梯度试验（枚、h、%）
项目
组别
孵化时间
接种胚数
侏儒胚数
蜷缩
胚数
肾脏尿酸盐
沉积胚数
正常
胚数
感染率
保护率
M41病毒+药物
+终止液（10min）
168
11
1
10
10
0
100
0
M41病毒+药物
+终止液（20min）
168
11
2
9
18.18
81.82
M41病毒+药物
+终止液（30min）
168
11
3
8
27.27
72.73
M41病毒+药物
+终止液（40min）
168
11
2
9
18.18
81.82
M41病毒+药物
+终止液（50min）
168
11
2
9
18.18
81.82
M41病毒+药物
+终止液（60min）
168
11
2
9
18.18
81.82
M41病毒+终止液
168
11
2
9
18.18
81.82
药物对照
168
11
11
0
100
盐水对照
168
11
11
0
100
空白对照
168
1
10
0
100
备注：
药物1禽喘康颗粒冲剂，药物2病毒灵
表5IBV作用浓度梯度试验（枚、h、%）
项目
名称
孵化时间
接种胚数
侏儒胚数
蜷缩胚数
肾脏尿酸盐沉积胚数
正常胚数
感染率
保护率
M41
168
10
2
0
8
0
100%
0
M41+药物1+终止液
168
8
1
0
3
4
50%
50%
M41（1：
10）+药物1+终止液
168
8
1
0
0
7
12.5%
87.5%
M41（1：
100）+药物1+终止液
168
8
0
0
0
8
0
100%
M41（1：
10）+药物2+终止液
168
10
0
2
8
0
100
0
M41（1：
100）+药物2+终止液
168
10
1
1
8
0
100
0
药物1对照
168
8
0
0
0
8
0
100%
药物2对照
168
8
0
0
0
8
0
100%
盐水对照
168
6
0
0
0
6
0
100%
空白对照
168
6
0
0
0
6
0
100%
备注：
药物1禽喘康颗粒冲剂，药物2病毒灵
三、禽喘康颗粒冲剂生产工艺的研究
1、配方：
金银花连翘大青叶板蓝根桔梗浙贝杏仁黄芩甘草。
2、工艺流程：
原料药筛选配料称量有效成分分类提取粗品合并清膏（1.38）精确配制化验制粒过筛干燥检验分装。
四、“禽喘康颗粒冲剂”的急性毒性试验
一般认为中药经过特殊的加工、炮制与制剂加工等环节，可减轻、降低或消除其毒害作用，但研究证明加工后的中药制剂仍具有一定的毒副作用，只是相对化学类药物而言毒副作用较低而已。
为科学评价“禽喘康颗粒冲剂”治疗家禽疾病时的毒副作用，我们用昆明鼠对其进行了急性毒性试验。
经最大耐受量试验，给小鼠的灌胃禽喘康颗粒冲剂总剂量达到85ml/kg，相当于成年鸡日用量的400倍，仍未见死亡和明显的中毒症状。
证明该药基本无毒副作用。
五、临床疗效试验
家禽疾病，特别是由新成疫、传染性支气管炎病毒等引起的的呼吸道病，是近年来给养禽业造成严重损失的病害之一。
“禽喘康颗粒冲剂”是本课题组研制的纯中药制剂，该药的主要成分为大青叶、板蓝根、黄芩、桔梗等，用于治疗家禽呼吸道疾病。
我们对该药进行了非免疫鸡人工感染鸡新城疫病毒（F48E8株）、混合感染鸡副嗜血杆菌（N株）和传染性支气管炎病毒（M41株）的临床效果观察、对感染法氏囊病毒（D78）雏鸡的免疫器官病理学的影响试验及免疫调节作用试验。
1、“禽喘康颗粒冲剂”对鸡人工感染新城疫病毒疗效果的试验
1.1发病及防治效果1、2组较3、4、5、6组推迟48h出现症状，防治率分别为90.0%和93.7%，3、4组治愈率分别为80.0%和75.0%。
5组治愈率为73.3%。
均显著高于对照组（p<0.01）。
见表1
表１：
“禽喘康颗粒冲剂”对鸡人工感染ND防治效果
组别
出现症状时间（h）
发病率（%）
病情
出现死亡时间（d）
死亡数
（只）
死亡率
（%）
防治率
（%）
0.5%预防组
（1）
72
100
较轻
4
3
10.0
90.0
0.7%预防组
（2）
72
100
轻微
4
2
6.7
93.7
0.75%治疗组（3）
24
100
较轻
3
5
16.7
83.7
1.0%治疗组（4）
24
100
较轻
3
6
20.0
80.0
LaSota紧接组（5）
24
100
较重
3
8
26.7
73.3
空白对照组（6）
24
100
严重
3
30
10.0
0
2.2治愈情况用药组和紧急接种组与对照组比较，能迅速减轻临床症状而治愈病鸡，治愈率和有效率显著高于对照组（p<0.01），用药5天内各组的病鸡的痊愈、显效、死亡、无效情况见表2。
2.3剖检特征攻毒后连续观察7天后全部扑杀，1、2、3、4、5组剖检看来腺胃乳头、肌胃角质层下、盲肠扁桃体、泄殖腔等症状都较轻或轻微症状，对照组症状很明显，见表3。
2.3治疗组用药量虽大，但保护率不如预防组，这主要是受试鸡在出现症状后，随饮水量的减少或废绝，摄取的药量也随之减少甚至终止有关，同时也正说明该药确实具有杀灭NDV的作用。
本次试验与前期的抗NDV鸡胚人工攻毒试验的结果表现一致，进一步证实了该药对NDV具有很强的抑杀作用。
表２：
“禽喘康颗粒冲剂”对鸡人工感染ND防治效果
组别
有效数（只）
治愈数（只）
无效数（只）﹡
治愈率（％）
有效率（％）
死亡率（％）
１
27
27
3
90.0
90.0
10.0
２
28
28
2
93.7
93.7
6.7
３
25
20
10
80.0
83.7
16.7
４
24
18
12
75.0
80.0
20.0
５
22
15
15
68.2
73.3
26.7
６
0
0
30
0
0
100
﹡包括死亡数
表３：
典型病变等级界定值
组别
１
２
３
４
５
６
病情
轻
轻微
较轻
较轻
较重
严重
打分指标
2.8±0.12
2.5±0.15
4.5±0.20
4.3±0.18
6.1±0.31
7.0±0
2、鸡人工混合感染鸡副嗜血杆菌和传染性支气管炎病毒的疗效观察
2.1禽喘康预防组的保护率为93.3%，极显著高于感染不治疗组（46.4%），说明该药对传染性支气管炎有较好的预防效果。
适于治疗由IBV和鸡副嗜血杆菌引起的慢性呼吸道病。
2.2禽喘康治疗组的治愈率分别为84.6%、83.3%、78.6%，比鸡清瘟散组高15.4、14.1、9.4个百分点，均具显著差异。
2.3攻毒60小时后，攻毒对照组开始发病，表现为张口呼吸，并伴有罗音和打喷嚏流眼泪等症状，96小时出现死亡。
剖检病死鸡只，看来病鸡颜面肿胀，鼻腔有粘液性分泌物，眼结膜发炎水肿；气管有粘液性渗出物，气囊浑浊。
各用药组于用药48小时后症状开始缓解，6天后症状基本消失。
试验用药组发病率明显低于攻毒对照组（P<0.01）。
临床治疗试验结果
组别
试验数（只）
发病数（只）
死亡数（只）
治愈率（保护率）（%）
致死率（%）
0.5%预防组
（1）
30
2
1
93.3
50
0.7%预防组
（2）
30
13
2
84.6
16.4
0.75%治疗组（3）
30
12
2
83.3
16.7
1.0%治疗组（4）
30
14
3
78.6
42.9
LaSota紧接种组（5）
30
13
4
69.2
30.8
空白对照组（6）
30
28
13
46.4
7
30
-
-
3、中草药“禽喘康颗粒冲剂”防治鸡肾型传染性支气管炎的探讨
采用中草药“禽喘康颗粒冲剂”对鸡传染性支气管炎进行试验，结果表明：
中药预防（I、II）组的发病率分别比攻毒对照组低46.14%和50.06%；中药预防组和攻毒对照组差异极显著（P<0.01）；中药治疗（I、II）组的死亡率比攻毒对照组低82.66%和86.96%，且差异极显著（P<0.01）；治愈率均达80%以上。
（详见表1、表2）
表1：
不同攻毒剂量致鸡IB发病及死亡情况
攻毒剂量 发病数（只）死亡数（只）发病率（%）死亡率（%）
0.1ml/只组 2 1 40 20
0.2ml/只组 4 3 80 60
0.3ml/只组 5 4 100 80
0.4ml/只组 5 4 100 80
表2：
“禽喘康颗粒冲剂”对IB的防治试验
组 别
发病（死亡）/鸡数（只）
发病率
（%）
死亡率
（%）
有效率（%）
治愈率（%）
保护率（%）
预防Ⅰ
14（3）/30
46.7
10
90
86.3
90
预防Ⅱ
13
（2）/30
43.3
6.7
93.3
89.7
94
治疗Ⅰ
20（4）/30
66.7
13.3
86.7
81.3
78.7
治疗Ⅱ
18（3）/30
60
10
90.
84.7
84.3
攻毒对照组
26（23）/30
86.7
76.7
空白对照组
0
0
0
4、禽喘康冲剂免疫增强功效的研究
为进一步验证其免疫增强功效，我们选用30日龄非免疫公鸡用左旋咪唑做对照，鸡新城疫低毒力活疫苗（Lasota株）2羽份免疫前，0.5%饮水3天，于免疫0、7、14、21d翅静脉无菌采血,分离血清,低温冰箱保存,测定鸡新城疫抗体和免疫球蛋白（IgG）。
21d时静脉采血涂片，酯酶染色法测定T细胞总数，同时捕杀后采用器官重量法进行免疫器官（法氏囊、胸腺和脾脏）指数的测定，试验数据采用SPSS软件进行统计分析。
4.1鸡新城疫抗体效价测定：
试验组、药物对照组新城疫抗体效价于空白对照组差异不显著，说明禽喘康冲剂对肌体的体液免疫的影响不大，这与早期杀灭病毒，减少抗原刺激有关。
见表1
表1禽喘康冲剂对的影响
组别
试验数
效价（Log2）/d
0
7
14
21
28
试验组
10
0
4.4±0.48
7.88±0.91
6.5±0.8
6.13±0.69
药物对照组
10
0
4.5±0.73
7.33±1.0
7.21±0.91
5.83±0.83
空白对照组
10
0
5.0±0.28
8.5±0.83
7.7±1.1
6.75±0.38
4.2淋巴细胞转化试验：
试验组与左旋米唑组均能显著提高淋巴细胞转化率，增强细胞免疫功能，提高抗病能力。
见表2
表2禽喘康冲剂对鸡T细胞总数的影响（OD570nm的光吸值）
组别
重复1
重复2
重复3
重复4
X±sd
试验组
0.114
0.137
0.133
0.120
0.126±0.01
药物对照组
0.134
0.149
0.149
0.136
0.142±0.01
空白对照组
0.033
0.034
0.036
0.035
0.0345±0.001
4.3免疫器官指数的测定
4.3.1试验组法氏囊指数低于空白对照组，而脾脏指数与胸腺指数均高于空白对照组，者与上述结论是一致的。
既具有较强的细胞免疫增强功能，对NDV病毒具有较强的杀灭作用，故体液免疫器官法氏囊指数低于空白对照组，体液免疫增强作用不明显。
，者可能与临床用两有关，有待进一步研究。
表3禽喘康冲剂对鸡免疫器官指数的影响
组别
法氏囊指数
脾脏指数
胸腺指数
试验组
2.83±0.80
2.63±0.49
3.35±0.78
药物对照组
2.36±0.78
1.24±0.40
1.62±0.39
空白对照组
3.37±0.57
2.21±0.44
3.07±0.52
5、禽喘康冲剂对感染法氏囊病毒（IBDV）雏鸡的免疫器官病理学的影响
选用15日龄海兰白公雏人工感染IBDV（D78），以观察“禽喘康颗粒冲剂”对这些免疫器官组织学变化的影响探讨该药防治家禽传染病的作用机理。
5.1法氏囊显微镜下观察法氏囊粘膜下及间质呈不同程度的水肿、出血和异嗜性粒细胞浸润，严重的见黏膜下水肿可波及到泄殖腔，实质的淋巴细胞变形坏死。
有的被网状细胞取代，坏死严重的呈囊腔状，萎缩的法氏囊淋巴滤泡体积缩小，治疗组和预防组大量的淋巴滤泡（淋巴小结）存在于固有膜中，沿着上皮密集排列，并可见上皮索深入淋巴滤泡。
淋巴滤泡可分为皮质和髓质两部分，髓质在滤泡中央，由上皮细胞和较大的淋巴细胞组成。
5.2 胸腺：
治疗组和预防组，每个胸腺叶的外周由染色较深的皮层和中央染色较浅的髓质构成，无论皮质和髓质的面积均大于对照组，淋巴细胞较密集。
5.3脾脏：
治疗组和预防组，淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞的数目和体积均多于和大于对照组，脾小体多而明显，
升级会员 