RNAi在抗病毒中的应用(修改).doc

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RNA干扰在抗病毒治疗中的作用

摘要：

RNA干扰是指由短双链RNA诱发的同源mRNA高效特异性降解从而干扰基因表达及调控的现象。

近几年来RNAi研究取得了突破性进展，该技术由于其特异性、简易性和不易引起机体免疫反应的特点而被广泛用于探索基因功能以及传染性疾病和恶性肿瘤的治疗方面。

由于人类中也发现了类似的RNA干扰作用，因此有关RNA干扰的抗病毒作用为研究人类抵御病毒侵染提供了新途径。

本文拟从RNA干扰的原理出发，对RNA干扰在病毒性疾病的治疗方面的最新研究进展作一些介绍。

由于各病毒不同的代表性和受关注程度，本文将主要介绍RNA干扰在抗HIV-1、肝炎病毒和流感病毒方面治疗的研究进展。

关键词：

RNAi，siRNA，病毒，HIV-1

1．RNAi简介

1.1．什么是RNAi

RNAi是一种通过导入双链RNA（dsRNA）引起生物体或细胞内同源mRNA降解，从而导致同源基因沉默的生物学现象。

导入的dsRNA在细胞内被一种称为Dicer的核酶（RNaseⅢ）[1]裂解成长约21～23个核苷酸（nt）的小分子干扰RNA（siRNA）[2]，siRNA随后与胞浆蛋白质成分结合成RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC），活化的RISC可通过反义siRNA的碱基配对与同源mRNA结合并使其降解。

1.2.RNAi的发现

RNAi最初在植物和真菌中发现，随后在线虫及果蝇的研究中发现并得到更深入的研究，后来在人类及哺乳动物中也发现了该现象。

1990年，Jorgensen等为使喇叭花紫色加深，将一种产色素基因置于一个强启动子后导入喇叭花，结果喇叭花紫色反而变得更浅甚至成白色。

这种导入基因与同源性内源基因表达同时受抑制的现象，被称为“共抑制（cosuppression）”。

发生在喇叭花的共抑制现象实质上是一种转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）。

最初，研究者认为这可能是一种局限于喇叭花及少数几种植物的特有现象，但随后通过线虫及果蝇等的研究发现这是一种普遍纯在的现象。

1995年，Guo等在研究线虫par-1基因功能时发现注射正义RNA和注射反义RNA一样能封闭par-1基因表达[3]。

1998年，Fire等将正义和反义链混合的dsRNA导入线虫并发现与单独注射正义或反义链相比，注射dsRNA引起基因沉默的效率高得多[4]。

这种现象后来就被称为RNA干扰。

1.2．RNAi的机制

RNAi的机制首先被注意到与内源mRNA的降解有关。

当线虫接触到dsRNA时，其内源同源的mRNA的水平迅速下降。

而如果dsRNA序列是某个基因的启动子序列，则没有明显的抑制效应。

Hammond等人认为可能是dsRNA诱导了一种序列特异性的核酸酶的产生，这种核酸酶称为RNA诱导的沉默复合物（RISC），需要RNA和蛋白质两种成分存在,从而诱导特异的mRNA降解。

这种沉默复合物后来通过生化方法已经从果蝇细胞提取物中分离出来。

然而,后来的一些研究表明RNAi可能还牵涉到更加复杂的机制。

在植物中，双链RNA可以使靶基因在基因组上的序列甲基化，在果蝇、线虫和真菌上的实验表明，RNAi的机制可能还与染色质的结构改变有关。

在线虫上还发现，内源编码的RNAi诱导物，如lin24基因的产物，也会在转译水平上抑制基因的表达。

具体来说，现在认为主要有以下几种机制。

1.转录后沉默机制：

RNAi应用和研究中最重要的机制。

据此模型,基因沉默的第一步是通过某种机制来识别dsRNA并使之转换成21～23nt的siRNA。

siRNA的出现是RNAi及其他基因沉默现象最重要的特征。

接着siRNA通过结合一系列蛋白质而形成RISC来识别特异mRNA并最终将其降解。

图1RNAi作用机制示意简图

图2RNAi作用机制示意详细图

2.基因组DNA甲基化机制：

证据表明RNAi导致的染色质的结构改变[5]或使基因组上的基因甲基化可能是通过一类梳状蛋白实现的。

梳状蛋白通过调节染色质处于“开”或“关”的构象状态，从而产生稳定的可遗传的基因表达模式。

3.转译水平的基因沉默机制：

对线虫两个时序发育调控基因lin24和let27的研究为RNA及RNAi对基因表达的调控机制作了新的补充，表明stRNA对基因表达的调控是发生在翻译水平，而不是发生在转录或者转录后水平。

该发现大大拓宽了RNAi的应用，特别是siRNA和潜在的microRNAs的应用价值。

2．RNAi在病毒性疾病的防治方面的进展

尽管在哺乳动物中RNAi的作用没有在植物和无脊椎动物中重要，这方面研究还是取得了较大的进展。

迄今为止，不同的研究小组已成功的激活了针对不同复制策略的病毒RNAi通路，包括HIV、HBV/HCV、HPV、poliovirus、herpesVirus、HTLV-1、respiratorysyncytialvirus、EBV、SARS-COV等。

本文主要介绍RNA干扰在HIV-1、肝炎病毒和流感病毒方面治疗的研究进展。

2．1．RNAi与HIV-1

艾滋病的治疗一般以env编码的gp120和gp41作为靶点，但迄今为止还不能产生有效的抗体，近几十年主要采用高活性抗逆转录病毒疗法（highlyactiveantiretroviraltherapy，HAART），包含两种核苷酸逆转录酶抑制剂，何大一的鸡尾酒疗法采用了三种核苷酸逆转录酶抑制剂，在延长病人寿命方面取得了一定的成功，但仍存在无法完全治愈，价格昂贵，易产生耐药株等缺点。

目前艾滋病的治疗主要存在的困难在于HIV-1可减少MHC-1类分子的表达，env，gag等位点易突变以逃逸免疫反应，且不能确定诱导特异免疫反应的抗原。

而RNAi可能是最普遍的基因调节机制，是原始的“免疫系统”，通过RNAi技术沉默HIV病毒的RNA成了新的希望。

2．1．1．以HIV-1RNA基因组作为RNAi的靶点

在原病毒形成并转录后降解全部转录产物比较困难，且病毒核酸一旦进入蛋白衣壳RNA干扰就失去了作用，而HIV的RNA基因组进入逆转录复合体也会使问题复杂化，所以比较合理的进行RNA干扰的时期为病毒尚未整合前。

将siRNA转入细胞再感染HIV-1的多个实验已表明该法有很好的抑制复制的的作用。

在这些实验中，已被作为靶点的基因位点有env、gag、pol（结构基因），tat、rev（调节基因），nef、vif（附属基因），有报道称TIR结构域内的非翻译RNA序列也可以作为RNAi的靶点。

实验表明，细胞内源性的siRNA也可发挥RNAi的作用，而通过细胞内表达siRNA具有一定的优势，因为转染外源性的RNA需要长期提供siRNA以保证其长期活性。

还有实验证明长dsRNA（500-700nt）尽管对基因表达抑制作用不强，且可激活干扰素反应，但也可诱导序列特异性的RNAi。

但不管怎样，RNAi技术成功的关键在于其特异性，一个碱基的错配就可显著的降低其对病毒RNA的沉默作用，这就带来了HIV-1的高度变异性可逃脱siRNA的抗病毒作用的问题，因此只有以保守的RNA序列为靶目标才可减少siRNA耐受病毒的产生。

另外一个问题是并非所有的病毒RNA序列都对siRNA同样敏感，因为靶RNA中的一些序列可能包埋在二级结构或高度折叠的区域，或者与结合蛋白结合。

2．1．2．以细胞的HIV-1感染相关因子作为RNAi的靶点

如上所述，以病毒的RNA为靶点还存在许多问题，以HIV-1感染宿主细胞的病毒受体CD4或辅受体CCR5/CXCR4以及细胞内转录因子、集合因子为代表的HIV-1感染相关因子作为RNAi的靶点成了许多实验的方向。

有实验表明[6]针对CD4受体基因的特异性siRNA可使细胞表面的CD4降为原来的1/4，但它的应用存在两个问题，首先是细胞表面已有的CD4受体的降解需要时间，在此期间病毒的感染将继续进行，还有就是CD4在免疫系统功能的发挥上起着重要的作用，降低其表达可能带来很多并发的问题。

图3HIV-1生命周期中RNAi的靶位点

幸运的是CCR5（细胞趋化因子受体5）对人体正常生理功能的发挥并未发现有影响，尽管与直接以病毒RNA为靶目标相比，间接的沉默病毒受体在减少病毒产量的效率上有所降低，但它有其优点，首先大多数HIV-1毒株的侵染都需要CCR5作为受体，其次CCR5对人类非必需，实际上许多研究结果表明CCR5突变的纯合人类个体几乎可以完全抵抗HIV-1亲CCR5毒株的感染[7]。

DC-SIGN为不依赖于CD4和共受体的促进HIV-1感染的分子，不表达DC-SIGN的DC不能将感染的HIV-1递呈给T细胞，因此其基因也可作为一个靶点[8]。

转录因子NF-κB可和HIV-1的LTR结合调节转录延伸，其关键亚单位P65也可和TAR结合从而激活HIV-1转录的延长[9]。

但NF-κB也和CD4一样，对细胞免疫功能的调节有重要意义。

hRIP为Rev的细胞内共因子，是Rev辅助病毒RNAs正确定位于胞浆所必需的。

还有一些可能的位点，如人DHS、亲环素A、PARP-1等。

2．1．3．影响HIV-1对RNAi敏感性的因素

已有实验证实脊髓灰质炎病毒可逃脱体外siRNA的抑制作用[10].，所以现在公认的有前景的siRNA治疗的方法是对多个病毒功能必需靶点进行联合治疗。

病毒有多种逃脱机制，例如nef的突变可以导致RNA折叠的构象改变，从而导致RISC不能与nef的RNA结合。

再例如，一项实验表明[11]CD4特异的siRNA与CD8特异的siRNA竞争的沉默T细胞。

这说明RNAi机制是可饱和的，它将限制个体细胞中许多siRNA的使用。

研究还发现，在一些细胞（如巨噬细胞，树突状细胞）中HIV-1始终可以远离RNAi。

病毒群异质性（变异）可以阻止有效沉默。

逆转录复合体中，病毒RNA一些区域在RNP中与病毒蛋白紧密相连，使siRNA不易接近。

巨噬细胞中，病毒聚集于胞质MHCⅡ隔室内，在树突状细胞中，胞外病毒摄入后内化成小泡，这些都会形成长期的感染，是有效的RNAi必需解决的问题。

2．1．4．抗HIV-1基因疗法策略

siRNA表达呈递策略主要有两种，第一种为人工合成之后转染，该法现已广泛应用于各种细胞系和原代细胞，它具有作用稳定的特点，但这种直接转导入细胞的方法有点冒险。

第二种方法试图将RNAi与基因治疗相结合，以使机体可以稳定的产生内源性的siRNA或shRNA，该方法在HIV-1，HCV和HBV等病毒的实验中均被证明有效。

在具体应用中，一种普遍方法为将siRNA盒置于PolⅢ启动子的调控下（如U6或Hi启动子）其后siRNA可以shRNA形式表达。

或者可用不同启动子分别表达正义链和反义链，再形成双链RNA。

为便于将siRNA表达盒引入细胞，实验一般采用病毒载体，现已证明慢病毒载体表达的siRNA可使体外细胞及小鼠的大脑和肝脏内的外源基因或内源基因的表达减弱。

[12]

2．1．5．排除RNAi对细胞的负面影响

外源性siRNA可能会影响内源性的RNAi途径，从而扰乱细胞基因表达的正常调节。

siRNA还可与细胞的mRNA发生交叉沉默。

除此以外，这项新技术还有一些困难需要克服，其中最明显的一个是如何将得到的siRNA活性成分转入人类所有的细胞，现已有两种方法，一种是骨髓法，即用RNAi表达盒转导HIV感染个体骨髓中的造血干细胞，再将其转种回患者体内，这些干细胞就会增殖为能抵抗HIV-1感染的成熟T细胞。

经过病毒的选择，这些细胞会逐渐成为体内的优势群体[13]。

另一方案为利用肠道病毒和细菌，它们具有物质呈递的能力，因此可成为良好的载体。

2．1．6．问题和展望

虽然在体外siRNA显示了良好的抗HIV-1等病毒感染作用，是较有前途的基因治疗方法，但仍有许多问题需要解决：

（1）针对HIV-1变异，如何设计有效的siRNA。

因为一些病毒能产生突变的子代分子，可以逃避免疫监视及药物，对抗siRNA的识别，因此必须使所设计的siRNA作用于病毒RNA保守、在不同毒株间不存在突变的序列，并要设计作用于RNA保守序列的多个siRNA；同时siRNA很少引起免疫反应，siRNA容易与其他siRNA结合产生协同或相加效应，因而多个siRNA同时使用可有效对抗HIV的突变株。

（2）如何将siRNA更有效地转人体内。

siRNA转染载体较多，常用的如慢病毒载体；有人还利用变异的MPG作为siRNA进入哺乳动物的载体。

MPG为一种以多肽为基础的基因传递系统，来源于HIV-1gp41蛋白的融合多肽域及SV40大T抗原的核定位序列（NLS），MPG与核酸形成稳定的非共价复合体并促进核酸的传递，NLS参与DNA的静电作用和核内的靶向作用[14]；阳离子载体如脂质体包埋siRNA。

但仍需解决转染效率及载体安全性问题。

（3）怎样增强siRNA在体内的稳定性。

如在siRNA链中加入某些化学元素如氟等以对抗核酸酶的降解等。

（4）怎样将siRNA与抗HIV-1药物有效结合起来：

因为它们之间可能存在协同或相加效应。

目前RNA干扰技术已成为基因治疗研究的热门课题，并取得了一定的成果，相信随着对RNA干扰机制的进一步认识，这一技术能够成为抗病毒，特别是HIV-1感染的有力武器。

2．2．RNAi与肝炎病毒

病毒性肝炎为我国常见的传染病，不仅直接影响人群的健康，严重影响工作和学习，还危及人们的生命安全，其造成的经济损失也很大。

因此，肝炎病毒很快成了RNAi的热门靶目标。

2．2．1.RNAi与甲肝病毒

用以DNA为基础的HAV复制子细胞培养系统表明了在Huh-T7细胞中用针对病毒序列或包含有病毒基因组的报道基因的siRNA可以特异性的抑制HAVRNA的复制，该实验表明部分siRNA可以明显抑制靶基因的表达，但有些靶基因的表达反而上升[15]。

可能的一种解释是病毒在复制过程中受到更大的选择压力，发生了突变，导致靶基因表达上升。

一般认为RNA的二级结构对RNAi作用效果有很大的影响[16]，而突变可能使其二级结构发生了变化。

研究也表明重组的人Dicer在体外切割dsRNA形成的siRNA可以明显的抑制基因的表达[16]，由于siRNA的可接近性可能依赖于靶RNA的二级结构，而且siRNA的有效性也依赖于靶基因内部特异性的靶位点，实验证明联合应用siRNA的有效性将优于单一的siRNA。

2．2．1.RNAi与乙肝病毒

将RNAi应用于HBV的抑制方面的实验已有很多，应用特异的针对HBV不同基因部分的特异性siRNA，可检测到大部分相应靶基因的表达均下降（见表1）[17]。

但并不是所有的siRNA均可以有效的靶定基因并进行有效的抑制，如HBVU6no.1，但其他六种HBVU6均可观察到HBsAg的下降，而在着六种有效siRNA中，其对靶基因的抑制效果也不同，尤其是HBVU6no.2和HBVU6no.6对HBsAg的抑制最明显。

名称

靶定的部位

pSUPERcore

pSUPERX

HBVU6no.1

HBVU6no.2

HBVU6no.3

HBVU6no.4

HBVU6no.5

HBVU6no.6

HBVU6no.7

siHBV

core基因

X基因

S基因

Core，pol

S基因

S基因

X基因

core基因

core基因

core基因

表1部分针对HBV不同部分的siRNA序列

在一项研究中，RNAi可用于在培养的细胞或转染有HBV质粒的经过适当免疫的小鼠及免疫缺陷鼠中，抑制HBV复制中间产物的产生。

在该研究中，将与HBVmRNA同源的表达shRNA的质粒转染细胞，可引发RNAi反应，该实验分泌型HBsAg在培养的细胞，鼠血清和肝细胞中平均下降了90%以上[18]。

在体实验表明，携带HBV基因组和siRNA的两种质粒共注射导致HBsAg和HBeAg都减少，而且还带来了三种病毒mRNA的50%的减少[19]，Uprichard等不同实验系统的的实验也取得了类似的结果[20]。

2．2．1.RNAi与丙肝病毒

很多研究小组已使用HCV的复制子系统评估了RNAi的抗病毒潜力，但迄今为止尚无可以感染动物细胞的病毒可以编码RNAi的抑制子在所有的实验中，不论通过检测复制子报道基因表达水平还是检测HCV蛋白表达水平，在给予siRNA后HCV表达水平均下降。

最近的实验表明，针对病毒非编码序列的siRNA在抑制HCV的复制方面显示了较好的效果[21]。

另外，高度保守的HCVRNA5’UTR的内部核糖体进入位点（internalribosomal-entrysite，IRES）也是一个较好的靶点[22]。

2．3．RNAi与流感病毒

2．3．1．RNAi治疗流感病毒感染

由于流感病毒高度的变异性和方便的传播模式，新的流感病毒暴发并流行的威胁依然存在，但现有的疫苗和治疗方法对流感病毒感染的预防和治疗价值仍然有限，而一系列RNAi在流感病毒研究中的研究为流感病毒的治疗提供了新的途径。

已有实验确定了能在细胞系和鸡胚中有效抑制流感病毒产物的siRNA，且结果表明最有效的siRNA不仅能以序列特异性的方式干扰病毒mRNA的聚集，还可以对病毒的其他所有RNA的转录起广泛的抑制作用[23]。

由于流感病毒与HIV一样有较高的变异性。

研究人员将目标主要集中在病毒基因组在不同亚型和不同物种的不同变异株中高度保守的区域。

所设计的siRNA除满足21个核苷酸中不到一个的错配外，还要求与已知的人类基因没有任何同源性。

研究人员已经试验了20种针对病毒NP，PA,PB1,PB2,M和NS基因的siRNA（HA和NA在不同物种毒株间存在较大变异）。

在MDCK细胞内RNAi抑制流感病毒产物的实验中，siRNA以电穿孔方式导入MDCK，8h后，细胞被PR8或WSN病毒感染，在感染后的不同阶段，通过HA检测确定病毒滴度。

作为对照的是GFP特异性的siRNA（GFP-949）。

结果表明，转染GFP-949不影响病毒产物，却明显抑制了GFP的表达。

转染流感病毒特异性的siRNA后产生了三种结果：

45%的siRNA对病毒滴度无影响;40%可明显抑制，但程度取决于感染的是PR8还是WSN病毒;15%有效抑制病毒产物，并且不受所感染病毒种类影响，其中有些抑制效果十分明显以致培养物上清中无检测到HA活性，进一步的实验筛选出NP-1496能非常有效的抑制流感病毒产物，并且在病毒感染后应用也同样有效。

更进一步在鸡胚内的研究证明siRNA可有效的抑制特异mRNA的聚集，在NP-1496存在的情况下，NP特异性的vRNA和cRNA也同样被消除，在用NP-1496处理的细胞中，M，NS，PB1,PB2和PA基因的mRNA，vRNA和cRNA聚集也被抑制，不过其他的siRNA并没有得到这么好的结果。

因此，依赖于序列特异性，一些siRNA可产生抑制所有病毒RNA的全面效应。

最近的研究还发现在高致病性禽流感中RNAi显著的抑制作用，该法不仅在小鼠体内获得了成功，还在一个慢病毒载体的PolIII聚合酶启动子下显示出高度的活性[24]。

2．3．1．展望

在已检测的20种siRNA中，以NP和RNA转录没的一个组分作为靶标的siRNA尤其有效。

一系列研究结果为进一步发展用于预防和治疗人类六分部的感染的siRNA提供了基础。

流感病毒自然感染人上呼吸道和肺的上皮细胞，可像应用干扰素一样通过鼻部和肺部通道方便的应用siRNA。

3．RNAi在病毒性疾病的防治方面面临的问题和展望

综合以上病毒的RNAi治疗的实验和研究不难看出，尽管RNAi在病毒性疾病的治疗方面存在设计、构建和检测的相对简单的优势，并且RNAi领域的迅速崛起，特别是siRNA，提供了一个潜在的低成本和相对快捷的对抗世界性的病毒的方式，而且RNAi还可以在人类疾病以外的其他病毒性疾病的治疗方面发挥作用。

但还存在很多问题，总结如下。

3．1．RNAi作用的适用性问题

以HCV为例，在siRNA取得最显著抑制效率的抗HCV研究中，多以复制子为研究模型。

HCV复制子只能在Huh-7细胞中复制，而在别的细胞中则很困难，提示Huh-7细胞中可能含有其它肝细胞株不存在的元件支持HCV复制。

同样，含有复制子的Huh-7细胞可能拥有RNAi作用所必需的功能元件，而在正常感染状态下，受HCV感染的人肝细胞是否具有这些必需元件或者HCV将抑制RNAi的作用还需要明确。

3．2．病毒的特性问题

对HBV基因区的选择还未能明确最有效的靶基因区，并且还有一些非特异的抑制作用。

因为HBV共价闭合环状DNA位于细胞核中，而RNAi难以进入细胞核，因此，RNAi抗HBV作用很难从根本上改变现行抗HBV治疗的效果。

3．3．药物靶向问题

考虑到脱靶效应，用siRNA靶定特异性的细胞或病毒转录物极大的依赖于内源性的RNAi机器的利用，而我们对其机制所知甚少，比如说让面提到的RNAi饱和现象的潜在机制是什么。

尽管有证据表明RISC至少在细胞培养环境中会被饱和，但RNAi通路似乎对高浓度的外源性siRNA十分敏感[30]。

RNAi干扰的给药方式和药物靶向问题还需要RNAi作用机制和通路的进一步研究才可能解决。

3．4．病毒变异问题

RNAi对特异性要求较高，单个碱基的错配即可显著降低其抑制效率。

许多病毒如HIV、HBV、流感均存在较高的变异率[31]，现在的方法就是选择保守性的靶位点和多种siRNA的联合应用。

这方面的研究取得了较好的成绩。

图4siRNA产生及作用过程全图[32]

综合RNAi在病毒性疾病的治疗方面取得的进展和对目前存在的一些问题的解决情况看，RNAi很可能给许多病毒性疾病的最终克服带来关键的突破，利用RNAi通路来实现RNA沉默也为其他领域（如农牧业）抵抗病毒感染提供了有力的工具。

RNAi和病毒之间的相互作用十分复杂，因为病毒可能作为诱导子、抑制子或者成为沉默的实际靶点。

RNAi能否在不远的将来进入临床取决于一系列问题的解决。

一直以来，都有一批科学家坚持不懈的研究RNA，而RNAi的出现无疑为RNA研究带来了春天，也给许多难以解决的病毒性疾病的防治带来了希望。

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5．RobinAUshire．RNAian