植物分子生物学实验技术.docx

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植物分子生物学实验技术

植物分子生物学实验技术

班级：

研122班

专业：

作物生物技术

姓名：

陕建国

学号：

20122419

授课教师：

红英老师

实验一：

植物DNA和RNA提取方法的讨论

一、提取植物DNA和RNA的用处

提取植物组织的DNA和RNA，分析其序列，了解序列的排列顺序可以更好的从分子水平上进行研究，从分子水平上改良植物或者说农作物的一些性状、品质等。

（一）提取植物DNA的用处

DNA的提取在植物基因工程以及植物分子生物学研究中占有重要地位，DNA的提取效率直接决定着后续实验的成败。

另外，提取植物DNA在分子育种方面也有很重要的用处。

（二）提取植物RNA的用处

提取RNA可以进行Northern杂交、原位杂交、RT-PCR以及cDNA文库构建等很多分子生物学实验。

提取RNA也是进行基因表达分析及基因克隆等分子生物学研究的基础。

二、植物组织DNA的提取方法

提取植物DNA的试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。

从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。

如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。

DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。

制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。

然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

（一）植物DNA的SDS提取法：

（来自Youaresolate的新浪空间）

试验试剂：

1、研磨缓冲液：

称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：

称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：

用10×SSC溶液稀释10倍。

4、0.1×SSC溶液：

用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：

用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6氯仿－异戊醇：

按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：

称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：

将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：

1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：

H2O＝1：

50（V／V）］。

12.1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、高氯酸溶液。

14、0.05mol/LNaOH。

15、DNA标准液：

取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。

以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：

高氯酸钠溶液＝4：

1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。

此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

（二）植物DNA的CTAB提取法：

（来自Youaresolate的新浪空间）

试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇（24:

1），充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。

充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。

1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存.

（三）植物叶片ＤＮＡ的提取步骤（来自　b04a　43e2　bbfc　d1e1a002dc21）

实验步骤

1、在50ml带盖离心管（放在-20度预冷）中加入20ml提取缓冲液I，60℃水浴预热。

2、水稻幼苗或叶子5~10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30~60分钟（时间长，DNA产量高），不时摇动。

3、加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静止5~10分钟，使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。

4、室温下5000rpm离心5分钟。

5、仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6、在1.5mleppendorf管中加入1mlTE。

用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。

7、如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。

这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。

8、将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。

9、加入5μlRNaseA（10μg/μl）,37℃10分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。

10、加入1/10体积的3mol/LNaAc及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。

11、用玻璃捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。

12、将DNA重新溶解于1mlTE中，－20℃贮存。

三、植物RNA的提取

植物细胞含有细胞质RNA、细胞核RNA和细胞器RNA。

细胞质RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。

细胞核RNA主要有细胞质RNA的前体及小分子细胞核RNA（snRNA）、染色质RNA（chRNA）等。

细胞器RNA主要指线粒体RNA及叶绿体RNA。

这些RNA统称细胞总RNA，其中大量的是rRNA，占80％左右。

基因转录产物mRNA在总RNA中只占1％～5％。

不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列，以及在细胞转录水平等方面各不相同，但真核细胞mRNA3ˊ末端都具有20～200个不等的多聚腺苷酸的尾，称为poly（A）结构。

利用poly（A）结构可以把mRNA从总RNA中分离出来。

对于Northern杂交可以使用植物细胞总RNA，也可以使用由总RNA中分离出的mRNA。

植物细胞RNA提取中的主要问题是防止RNA酶的降解作用。

RNA酶是一类水解核糖核酸的切酶，它与一般作用于核酸的酶类有着显著的不同，不仅生物活性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用时不需要任何辅助因子，而且它的存在非常广泛，除细胞含有丰富的RNA酶外，在实验环境中，如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液、甚至灰尘中都有RNA酶的存在。

因而，生物体源、外源RNA酶的降解作用是导致RNA提取失败的致命因素。

源RNA酶来源于材料的组织细胞，提取自始至终都应对RNase活性进行有效抑制。

RNA提取过程中将蛋白质变性剂与RNase抑制剂联合使用效果较理想。

蛋白质变性剂包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl（十二烷酰肌氨酸钠）、DOC（脱氧胆酸钠）、盐酸胍、异硫氰酸胍、4—氨基水酸钠、三异丙基萘磺酸钠等；RNA酶抑制剂有RNasin（RNase阻抑蛋白）、氧钒核糖核苷复合物等。

外源RNA酶的抑制主要是使用DEPC（焦碳酸二乙酯C2HsOCOOCOOCxH5），它能与RNase分子中的必需基团组氨酸残基上的咪唑环结合而抑制酶活性，用于水、试剂及器皿的RNase灭活。

DEPC与肝素合用效果增强，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不稳定，很快分解成CO2及C2H5OH，因而不能用于Tirs溶液的RNase灭活。

水及其它溶液的灭活一般使用0.05％～0.1％DEPC，37℃处理过夜，也有人采用磁搅0.5小时以上的做法。

DEPC处理后的溶液还需高压灭菌，以去除残存的DEPC。

若DEPC去除不净，会破坏mRNA活性。

不能高压灭菌的试剂要使用经过DEPC处理的灭菌蒸馏水配制，然后用0.22μm滤膜过滤。

含有Tris的试剂用经DEPC处理过的水配制，再经高压消毒。

玻璃器皿可以在180℃烘烤8小时以上，不能烘烤的器皿用0.1％的DEPC水处理过夜后再高压灭菌。

提取全过程必须在清洁无尘的环境中进行。

操作人员要使用一次性的手套拿取物品，尽可能避免一切污染机会。

提取时使用的器皿应经过硅烷化处理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成损失。

RNA电泳使用的电泳槽需用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥。

再浸入3％H202溶液中，室温下放置10分钟以上，再用DEPC溶液处理过的水冲洗干净。

总之，实验中所用的试剂、器皿都要经过RNase灭活处理。

尽管如此，有时还会出现在提取的后期RNA被降解的问题。

这是因为RNase活性的抑制只是一个暂时的现象，一旦抑制剂浓度下降RNase就有可能恢复活性。

对于RNA提取来说，这是一个潜伏的危险。

在提取的前阶段，提取液中无疑是有足够的抑制剂，但到了提取后期，抑制成分逐渐减少，残存的RNase就会复活而引起RNA降解。

另外，提取后期发生的RNase污染，那怕是极轻微的，也会使到手的产品降解，因而提取后期要更加小心。

影响植物RNA提取的另一个问题是水溶性的细胞代谢物如酚、多糖等易与RNA结合成胶冻状的不溶物或有色的复合物，它们能影响RNA的质量及产量。

人们采用了多种处理方法来解决这个问题，如对组织提取液进行高速离心去除多糖；采用低pH值的提取缓冲液抑制酚的解离及氧化；或用β—巯基乙醇、PVP来抑制酚类的干扰等。

（一）小麦叶片及不同时期种子的RNA的提取（双宜，吴耀荣，夏光敏.介绍一种简单高效的植物总RNA提取方法大学生命科学学院,）

1、取510g材料放入研钵中，加入过量液氮，迅速研磨成均匀的粉末（在研磨过程中，保证材料始终浸在液氮中，研磨约30min左右）。

2、待液氮自然挥发干净后，将材料转入100ml的离心管中，加入68倍体积的裂解缓冲液Ⅰ，轻轻搅拌后，0℃冰浴20min。

3、12000r/min，4℃离心15min。

4、取上清液，加1/3体积的3mol/L醋酸钠（pH5.3），1/5体积的氯仿-异戊醇（24:

1），轻轻混匀，0℃冰浴20min（加5倍体积裂解缓冲液Ⅱ溶解沉淀以提取DNA）。

5、12000r/min，4℃离心15min。

6、取上清，加入等体积冰浴冷却的异丙醇，混匀且冰浴10min。

7、5000r/min，4℃离心10min。

将沉淀溶于5ml含有0.1%的SDS缓冲液中，加入8mil/LLiCl使终浓度至2.5mol/L，冰浴4℃过夜。

8、12000r/min，4℃离心10min。

9、70%乙醇洗涤沉淀两次，空气干燥10min后，溶于DE-PC处理的TE或水中。

加入1/10体积10%重复第四、六步进一步除去蛋白质。

-70℃冰箱保存。

裂解缓冲液Ⅰ成分：

7mol/L尿素，50mmol/LTris-ClpH8.0,10mmol/LNa2EDTA,pH8.0,3.5mol/LNaCl,6.25%Tris饱和酚pH8.0,0.1%SDS+0.1%LDS。

裂解缓冲液Ⅱ成分：

7mol/L尿素，50mmol/LTris-ClpH8.0,10mmol/LNa2EDTA,pH8.0,3.5mol/LNaCl,6.25%Tris饱和酚pH8.0,0.1%SDS+1%LDS。

（二）植物总RNA的提取（XX文库）

Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。

在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。

Trizol试剂配制

苯酚饱和液（38%）-380ml/l、硫氰酸胍盐（0.8M-118.16g）、硫氰酸铵（0.4M）--76.12g、醋酸钠pH5（0.1M）-33.4ml、甘油–50ml，加水至1L

实验试剂

1、无RNA酶的无菌水：

用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

2、75%乙醇：

用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

3、氯仿:

异戊醇[24:

1（v/v）]、氯仿。

4、异丙醇、无水乙醇、70％乙醇。

5、Trizol试剂。

操作步骤

1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5mltube分装0.1克样品；

２.　每管加入0.5mlTrizol液，迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

３、室温下静置5～１０分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离

４、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温静置５分钟

５、10000r/min离心10分钟

６、取上清液（水相）转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10分钟，10000r/min离心10分钟。

７、弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡旋混匀，4℃下７５００r/min离心5分钟。

８、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。

然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃

（三）CTAB方法提取植物叶片RNA（XX文库）

操作步骤

1、取叶片材料两克，液氮中研磨成细粉末。

2、每管加入10ml65℃预热的CTAB提取液和500µlβ-巯基乙醇，剧烈涡旋匀浆，65℃水浴温育30min。

3、每管加入10ml氯仿：

异戊醇（24：

1），涡旋混匀，冰浴10min。

4℃，12000rpm离心10min。

4、取上清，加入1∕3体积的8MLiCl和500µlβ-巯基乙醇，-20℃沉淀过夜。

5、4℃，12000rpm离心20min。

6、弃上清，沉淀用4ml异硫氰酸胍变性液溶解，加入120µlβ-巯基乙醇和880µl2MNaAc（pH4.0）,混匀后加入5ml的酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1），涡旋混匀，冰浴5min。

4℃，12000rpm离心10min。

7、取上清，加入等体积酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1），涡旋混匀，冰浴5min。

4℃，12000rpm离心10min。

8、取上清，加入等体积氯仿：

异戊醇（24：

1），涡旋混匀，冰浴5min。

4℃，12000rpm离心10min。

9、取上清，加入1∕10体积的3MNaAc（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置过夜。

10、4℃，14000rpm离心20min。

弃上清，沉淀用预冷的75%乙醇漂洗2次，每次洗涤后，14000rpm离心10min，弃上清。

冰上干燥RNA沉淀。

11、加入100µlRNase-free-ddH2O溶解沉淀。

取10µl稀释200倍检测UVλ230、260、280下的OD值，检测RNA样品的纯度与浓度。

取5μg进行RNA样品的电泳检测，以检测rRNA的完整性，其余样品加入3倍体积的无水乙醇于－70℃下保存。

（四）硅藻土-苯酚法（一种广泛适用的RNA提取方法）（来自晓宇的方法）

利用硅藻土能够有效吸附RNA酶的特性，结合高盐、PVP及乙二醇丁醚沉淀等过程，建立了高效高质量RNA提取方法.该方法适应性广，可以从富含RNase及多糖、多酚等代谢产物提取RNA困难的动、植物及微生物材料中提取高质量总RNA植物组织RNA提取的难点及对策。

具体步骤：

（全过程均在冰上操作，保持样品温度在0～4℃）

1、样品液氮速冻，于研钵中研磨成细微粉末并转入预冷的离心管；

2、按照4ml/g的比例加入硅藻土提取缓冲液，充分震荡后加入1/2体积的水饱和酚和1/2体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），震荡混匀；

3、4℃12000g离心10min，取上清加入等体积5mol/LKAc（pH4.8），混匀后冰浴10min；

4、4℃13000g离心10min，液相转入新管，重复上述酚仿抽提，直至界面清亮；

5、上清移入新管，加入等体积乙二醇丁醚，混合均匀后，冰上放置1h；

6、4℃14000g离心15min，沉淀用75%乙醇洗2次，空气干燥后用适量DEPC-H2O溶解，-70℃保存。

硅藻土提取缓冲液：

20mmol/L柠檬酸钠（pH7.0），10mmol/LEDTA，0.5%SDS，1%β-巯基乙醇，100mmol/LNaCl，1.9g/L处理过的硅藻土。

（121℃高压灭菌20min，冷却后再加入1%β-巯基乙醇，4℃保存）。

硅藻土的处理：

5g硅藻土用50ml50mmol/LTris-HCl（pH7.6）溶解，于100℃放置5min。

室温2500g离心5min。

弃上清，沉淀用40ml50mmol/LTris-HCl（pH7.6）重悬。

重复离心和重悬的步骤两次。

超声1min。

室温3500g离心15min.。

沉淀用30ml50mmol/LTris-HCl（pH7.6）重悬。

4℃储存。

实验二：

PCR及QPCR

普通的PCR是进行定性分析的，而QPCR是进行定量分析的，是检测初始量的，并且在进行PCR是标准曲线的制作是非常重要的。

一、PCR

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。

（一）PCR的原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

（二）PCR反应体系（XX文库）

10×扩增缓冲液

10μl

4种dNTP混合物

200μl

引物

10～100μl

模板DNA

0.1～2μg

TaqDNA聚合酶

2.5μl

Mg2+

1.5mmol/L

加双或三蒸水

100μl

1、无Mg2buffer：

由纯水、kcl、Tris组成。

Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。

kcl可降低退火温度，但不能超过50mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。

2、Mg2:

终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200μmol/L，注意Mg2与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。

其浓度越小，酶的特异性就越高。

3、BSA：

一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。

4、底物（dNTPs）：

dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。

高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。

5、Taq酶：

能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。

能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。

6、模板：

不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。

模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。

7、引物：

引物浓度一般为