基因工程的基础知识与基本技术PPT格式课件下载.pptx

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,共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA,1.2电泳迁移率同凝胶及浓度的关系,凝胶类型：

琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶浓度：

高、低,天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。

琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。

1.3电泳迁移率与电场的关系,在一定电场中，电压越高，电泳速度越快；

随着电压的升高，不同长度的DNA流动泳动的增加程度不同，因而凝胶的有效分离范围反而下降,分子生物学实验室核酸电泳系统,琼脂糖电泳,样品配制与加样DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，,含有10%-15%蔗糖或5%10%甘油，以增加其比重，使样品集中。

1.4染料,EB:

溴化乙锭,Goldview,SYBRGreenI,分子生物学实验室凝胶成像系统,染色和拍照常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。

2PCR（polymerasechainreaction）技术,PCR技术产生背景1958年，DNA聚合酶（polymerase）分离1976年，Chien分离出热稳定的聚合酶1983年，Mullis建立了PCR的反应过程，并获得了诺贝尔奖1986年，分离出适用于PCR的Taq热稳定聚合酶人工合成寡核苷酸方法的发展与成熟,2.1PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,变性,变性不完全：

导致PCR失败，未完全变性的双链DNA会很快复性，减少DNA产量；

变性时间过长或温度过高：

导致聚合酶活性下降，扩增效率降低Taq酶活性的半衰期为：

92.5度130min;

95度40min;

97度5min,退火引物退火的温度和所需时间取决于引物的碱基组成、引物的长度，引物与模板的匹配程度及引物的浓度。

退火温度越高，所得产物的特异性也越高实际使用的退火温度双扩增引物的Tm值低5-10度,退火温度的选择,两条引物间的Tm值相差小于5，最好1。

退火温度以两条引物中Tm值较低的为准，并且低5-10Tm=（A+T）X2+（C+G）X4退火温度=Tm-（5-10）ATCG指引物与模板直接配对的部分，外加碱基不算Tm=69.3+0.41*（G+C）/N*100-650/N,延伸延伸反应通常在72度进行，接近Taq酶的最适温度75度。

在一般反应体系中，Taq酶每分钟可以合成约2kb长的DNA片段。

在能完成DNA合成的前提下应尽量缩短延伸时间，减少Taq酶活性的损失。

循环次数当其他参数确定后，循环次数主要取决于模板DNA的浓度。

一般来说，循环次数2535轮已足够。

循环次数过多，会使PCR产物严重出错，非特异性产物增加。

2.1PCR反应程序,PCR反应的温度循环周期,在实际操作过程中，会增加预变性3-5min,2.2PCR反应成分,

（1）引物DNA聚合酶需要一小段双链DNA来启动新链的合成。

所谓PCR扩增引物，是指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段，其长度在1530个核苷酸之间。

上游引物，是与基因的5端互补的寡核苷酸，用于扩增编码链；

下游引物，是与基因的3端相同的寡核苷酸，用于扩增DNA模板链。

两引物在模板DNA上结合之间的距离决定了扩增区段的长度。

实验表明，1kb之内是理想的扩增长度；

2kb是有效的扩增长度；

3kb以上则难上有效的扩增。

设计引物的基本原则,引物长度：

15-30b，指模版与引物相配对的碱基数；

应随机排列，避免同一碱基串联。

e.g.引物长度为8个核苷酸：

4865536bp43000个可能17个核苷酸：

41717179869184bp超过5倍人类基因组DNA长度：

3109bp,可以在5端加适量的保护碱基或酶切位点序列原因：

5端的无关序列不会影响引物特异序列的退火引物的3末端和模板的碱基要完全配对,设计引物的基本原则,防止引物对间及引物内的同源性，尤其是3端不能出现碱基同源，3最好不出现碱基A,设计引物的基本原则,GC的合理含量与Tm值的范围目的：

ATGGGAAGCTGCTGTTACTCCGCACTTCGGAC-CTCCTAAGACACTCTCTACAG-3上游序列：

ATGGGAAGCTGCTGTTACCTCG+C含量=？

%下游序列：

CTGTAGAGAGTGTCTTAGGAG-3G+C含量=？

%,诱变寡核苷酸引物的设计,设计原则：

与靶DNA的适当链互补，与靶的其它区域不能错误杂交足够的长度与靶序列特异结合，1-2个碱基改变的引物要求至少25bp长3.3.错配碱基位于中央位置，使每侧有10-15bp与模板链完全配对。

有效引入多于3个核苷酸突变时，要求引物在诱变点的每侧有30个核苷酸与模板互补4.4.5端与模板完全互补，从上游引物起始的DNA合成不会取代诱变寡核苷酸,DNA聚合酶的53外切核酸酶活性是造成上游DNA合成取代5核苷酸的原因,诱变寡核苷酸引物3区域有10-15bp与模板链完全配对，形成足够稳定的杂交分子，有效地从诱变寡核苷酸引物3端引发DNA的合成无回文、重复或自身互补序列，否则，形成二级结构，与靶序列杂交率降低，导致得不到突变体必要时可在诱变寡核苷酸上加上新的酶切位点，或消除靠近诱变点的已有酶切位点，便于诱变后通过限制酶消化筛选侯选突变子,引物的设计软件：

Oligo6,PremierPrimer,DNAstar,FastPCRetc.其他概念：

简并引物，嵌套引物,PCR反应成分,

（2）Taq酶（3）反应缓冲液10-50mMTris-HCl，50mMKCl，2.5mMMgCl2（4）dNTPs:

dATP,dTTP（dUTP）,dGTP,dCTP（5）模板：

DNA,RNA,cDNA等,5,Primer15Primer2,Cycle2,Cycle1,5,5,5,5,5,5,TemplateDNA,5,5,55,5,5,5,5,一、基本工作原理,Cycle3,5,5,55,5,5,5,5,55,55,55,55,2530次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。

几种重要的PCR衍生技术,

（一）反转录PCR技术

（二）实时PCR技术（三）梯度PCR技术,反转录PCR（ReversetranscriptionPCR，RT-PCR）,反转录PCR：

mRNA-cDNA-PCR抽提RNA反转录合成cDNAPCR扩增,AAAAAAA-3,AAAAAAA-3TTTTTTT-5,mRNA,cDNA,TTTTTTT-5,cDNAPCRRT-PCR,反转录酶+dNTPs,RT-PCR检测LOX基因表达情况,LOX-3,LOX-5,M123456,M123456,1:

03d,2:

016w,3:

63d,4:

616w,5:

200d,6:

2015d,18SrRNA,实时荧光定量PCR,PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；

刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上;

PCR扩增时，Taq酶的5端3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

实时PCR技术原理,梯度PCR,利用梯度PCR仪对解链、退火及延伸设置温度梯度，适用于摸索试验条件时，多次试验可在一台仪器上完成，既节省试验时间，提高效率，又节省试验成本。

梯度PCR,锚定PCR不对称PCR反向PCR多重PCR（例如:

RAPD）着色PCR,3分子杂交印迹技术,核酸分子杂交在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在异源的分子之间形成杂化双链.。

一、分子杂交与印迹技术的原理,复性,RNA,DNA,印迹技术经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子都是在杂交之前通过毛细管作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原位地“复印”上去的，这一过程称为“印迹”。

二、印迹技术的类别及应用,

（一）DNA印迹技术（Southernblotting）用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。

（二）RNA印迹技术（Northernblotting）用于RNA的定性定量分析。

（三）蛋白质的印迹分析（Westernblotting）用于蛋白质定性定量及相互作用研究。

斑点杂交（dotblotting）原位杂交（insituhybridization）DNA芯片技术（DNAchip）RNA芯片技术（RNAchip）蛋白质芯片（RNAchip）,三、印迹技术的特点,灵敏度高特异性强,三、印迹技术的操作步骤,1、样品的准备2、探针的制备3、杂交4、显示结果,核酸探针标记,一、探针的类型,核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物标记的、能与特定的靶分子发生特异性相互作用的DNA或RNA片段。

1基因组DNA探针：

病毒DNA等2cDNA探针；

最常用3寡核苷酸探针：

10-50bp，测序、点突变4RNA探针：

稳定性高、特异性强，但RNA极易降解，不宜操作。

二、探针的标记物,理想的标记物：

敏感度高；

特异性强；

不影响探针分子的主要理化特性；

标记、检测方法简单、探针保存时间长；

对环境无污染、对人体无损害；

价格低廉。

一）放射性标记物二）非放射性标记物,

（一）放射性标记物-放射性核素,利用放射性核素能产生射线的特性将核素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通过一定方法掺入到DNA或RNA中去制成探针，与待测的核酸杂交后，核素产生的或射线可使底片感光的特性，通过放射自显影的方法进行检测。

产生射线的核素：

P、H、S产生射线的核素：

I,放射性标记物的优缺点,优点：

灵敏度高：

0.01pg特异性强缺点：

放射性污染成本高、半衰期短，不能长期保存,二）非放射性标记物,1、优缺点优点：

无放射性污染成本低、操作简单缺点：

敏感性、特异性均低于放射性核素常用：

半抗原类（生物素、地高辛）酶类（辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）,三、探针的标记方法,随机引物法末端标记法cDNA探针的标记RNA探针的标记,

（二）杂交的基本过程：

变性,杂交,洗膜,杂交信号的检测,分子杂交实验,、变性（Denaturation）,热变性：

95-100,5-10分钟碱变性：

0.5mol/LNaOH,30分钟,、杂交（hybridization）,变性的单连DNA按碱基配对的原则，在适当的条件下重新缔合形成双链的过程。

、洗膜,离子强度：

0.1xSSC洗膜温度：

低于Tm值5-12Ce.g.探针长500bp，G+C含量42%,离子强度0.1xSSC,不含甲酰胺，Tm值为67，则洗膜温度为55-62.（,、Southern印迹杂交（Southernblot）：

检测DNA大小、存在状态DNA电泳,变性,转膜,杂交,Southern杂交结果，转基因植株鉴定,3|、Northern印迹杂交（Northernblot）：

检测RNA的大小和状态,RNA电泳洗膜,转印显色,杂交,Etr4,PRP,Pink,PRPPRPTurningRed,PRPGreen,果实成熟过程的乙烯受体基因表达模式,CK,ASA12366084108132156180（H）,不同处理对EXP2基因表达模式的影响,Western-blot杂交,以一抗与蛋白质抗原杂交，然后二抗与一抗杂交，显色。

ELISA：

酶联免疫反应,三种印迹技术的,组织、细胞的原位杂交,用标记的核酸探针与组织切片或细胞涂片中的核酸进行杂交并对其进行检测和定位的方法,组织原位杂交,切片技术检测细胞的转录情况RNA的环境（DNA探针与染色体DNA的杂交,或cDNA与细胞中RNA的杂交）,DNA序列分析（测序）,Sanger发明的双脱氧法，酶法Maxam和Gilbert发明的化学降解法测序仪：

ABI最新全自动测序仪包括电泳系统、激光检测装置、电脑、彩色打印机、序列分析软件、DNA片段大小和定量分析软件。

4基因突变技术,定义：

是基因组DNA分子在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，并引起个体表型的改变，而使生物体发生遗传性变异。

基因突变可分为自然突变和人工诱变。

基因突变是生物界中存在的普遍现象。

由基因突变而产生的变异性而使生物在自然界中发生不断的进化，从而可保证物种对各种环境的适应性。

在自然界中引起基因突变的因素有物理因素（如紫外线、电离辐射和X线等）和化学因素（如羟胺、烷化剂、亚硝酸盐和碱基类似物等）和生物因素（如麻疹、风疹、乙肝、疱疹等病毒和由真菌产生的毒素如黄曲霉素等）。

基因突变就是用酶学和化学方法来切割或合成DNA，从而将突变碱基或序列导入克隆化的基因中，再将改变的基因重新送回到生物体中,以分析该基因的功能变化的一项高新技术。

基因的体外突变技术对于生物学和医学的研究及生物技术的发展，使分子生物学领域发生了一场革命，产生了“反向遗传学”这一全新的概念，即先改变基因序列，再验证基因的功能，这也为有效地进行蛋白质工程研究打开了大门。

基因突变的分类,按照突变生成的过程：

自发突变、诱发突变按突变发生的细胞种类不同：

生殖细胞突变、体细胞突变根据DNA碱基序列改变的情况不同：

点突变、碱基插入突变、碱基缺失突变,碱基替代（点突变），碱基插入或缺失结果，从对三联体密码的影响及遗传信息的改变来看，又有下述几种不同的情况发生。

（1）同义突变:

同义突变是指碱基被替代后,没有改变产物氨基酸序列

（2）错义突变:

指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的序列改变（3）无义突变:

指某个碱基的改变可使某种氨基酸的密码子突变为终止密码子。

DNA的定位诱变,定位诱变技术:

指按照设计要求，在体外将基因特定区域的碱基进行突变，这样就有可能在缺乏表型选择时进行遗传分析，以便于研究基因结构与功能的关系和基因表达调控的过程。

其诱变技术有两种类型：

区域随机诱变和点突变,区域随机诱变,定义：

是在含有靶位点的一段DNA序列上引入随机碱基序列而发生基因突变。

操作：

（1）首先将靶DNA从载体上切割下来,然后在体外用诱变剂处理,常用诱变剂有亚硝酸、甲氧基胺及羟胺等，处理以后再将靶DNA（利用原来切点）重新连接到载体上。

（2）是先将一段靶DNA区域加工制成单链区,然后用单链DNA诱变剂如亚硫酸钠处理单链DNA。

点突变技术,寡核苷酸介导的定点突变技术：

使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作为引物，启动单链M13噬菌体DNA进行复制,随后这段寡核苷酸引物便成为新合成DNA子链的一个组成部分,新生成的子链便具有发生突变的碱基序列。

PCR诱变,PCR点突变技术,AGCTCCATGACCCAG5CGCTCCATGACCCAG3,1、重叠延伸PCR（over-lapextensionPCR,OE-PCR）2、大引物PCR法（megaprimerPCR）3、环状诱变PCR法4、TAMS定点诱变技术,1、重叠延伸PCR（OE-PCR）,首先设计两个PCR反应以产生两个含突变位点的DNA片段，随后将上述两个PCR产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互为引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次PCR产物进行纯化处理可显著提高突变效率,2、大引物PCR法（megaprimerPCR）,先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA片段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。

因为作为引物使用的DNA片段较通常的引物要大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物PCR法。

大引物PCR定点诱变技术路线,（圆点指突变位点）,3、环状诱变PCR法,定义：

以整个带有目的基因的质粒为模板，用诱变剂进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。

方法：

两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平末端的线性DNA，需用T4连接酶环化处理。

以Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表，两个引物也是反向的并且其5端有l5个碱基以上的重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自行环化。

环状诱变PCR法,环状诱变PCR法,4、TAMS定点诱变技术,有目的地扩增突变链定点诱变技术:

能够一次引入多个位点的突变，并且能够有目的扩增突变链，从而使突变链效率几乎达到100%1、线性单链DNA模板的制备。

（线性PCR）2、突变链的合成:

用2个锚锭引物（Anchor5和Anchor3）和多个诱变引物（Mut1和Mut2），首先在多核苷酸激酶的作用下使每个引物磷酸化，接着在DNA聚合酶的作用下使引物与线性模板退火、延伸，最后在DNA连接酶的作用下。

合成突变链。

3、有目的地扩增突变链：

设计扩增引物（PCR5和PCR3），使其3端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩增引物只能退火到突变链而不是亲本链，所以只有突变链才能扩增。

TAMS定点诱变技术,