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名词解释

基因工程：

用人工方法,在体外对DNA分子进行切割、连接，组成重组DNA分子，再导入生物体内,并使其在异种生物内复制、表达,从而使受体生物获得新的遗传性状,这一全过程称为基因工程。

（PPT）

限制酶：

限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

（P21页）

DNA连接酶：

DNA连接酶是一种能够将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。

（或DNA连接酶是一种能够催化双链DNA片段紧靠在一起的3`羟基末端与5`磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来的酶）（P27页）

DNA聚合酶：

DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶。

（P30页）

DNA修饰酶：

DNA修饰酶是一类通过添加或删除化学基团来修饰DNA分子的酶，主要有末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）、碱性磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶等。

（P22页与网上整理结合）

质粒：

质粒是一些存在于微生物细胞染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，是能够进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。

（P42页）

穿梭质粒：

穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制，并可以携带着外源DNA在不同物种的细胞之间往返穿梭的质粒载体。

（P56页）：

噬菌粒：

噬菌粒是一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列。

（P77页）

粘粒载体：

粘粒又称柯斯质粒，是一类由人工构建的含有λDNA粘性末端cos序列和质粒复制子的杂种质粒载体。

（P70页）

M13噬菌体载体：

M13噬菌体是一种含有6.4kb环状单链DNA分子的大肠杆菌丝状噬菌体。

（73页及PPT）

克隆载体：

克隆载体是指具有在细胞内进行自我复制能力的DNA分子，是外源基因的运载体，又称无性繁殖载体。

末端脱氧核苷酸转移酶：

末端脱氧核苷酸转移酶是一种来源于小牛胸腺，为核酸末端加上一个同聚物尾巴的DNA修饰酶。

T4噬菌体多核苷酸激酶：

T4多聚核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase）酶是由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质。

该酶催化r（是拉丁文不是字母）-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5’-OH末端,生成5’－P。

碱性磷酸酶：

碱性磷酸酶有两种不同来源，一种是从大肠杆菌中纯化出来的细菌碱性磷酸酶，另一种是从小牛肠中纯化出来的小牛肠碱性磷酸酶。

它们的共同特性是能够催化核酸分子脱掉5’磷酸基团,从而使DNA（或RNA）的5’-P末端转化为5’-OH末端。

（P36）

定向克隆：

当用两种不同的限制酶消化外源DNA时，可以产生非互补突出末端的外缘DNA片段，此种片段可采用定向克隆法，即只以一个方向很容易地将其插入到同样用这两种限制酶进行消化而产生相匹配粘端的载体当中。

（P104）

DNA体外重组：

DNA体外重组是将目的基因用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上，这种重新组合的DNA称为重组DNA。

（P101）

转化：

将带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程。

转染：

将带有目的基因的重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程。

转导：

将带有目的基因的重组噬菌体DNA包装到噬菌体头部成为有感染力的颗粒，再导入受体细胞中的过程。

电穿孔转化法：

将宿主细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，瞬时提高细胞膜的通透性周围基质中的DNA可渗进细胞

化学转化法：

化学药物如氯化钙等的转化

氯化钙法转化细胞：

细菌处于0℃及CaCl2低渗溶液中时，菌细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理促进细胞吸收DNA复合物。

适用于大部分大肠杆菌菌株，并具有简单快速、重复性好的优点。

感受态细胞：

受体细胞经过电穿孔、CaCl2、RbCl（KCl,铷）等处理后，细胞膜的通透性暂时改变，允许外源DNA分子进入。

放射性探针：

是指一段带有放射性同位素标记的、与目的DNA或RNA片段的序列互补的单链核苷酸，将它与一个DNA片段进行杂交可检测该片段中是否含有目的序列（放射自显影技术）。

抗生素抗性基因插入失活法：

许多质粒载体都含有抗生素抗性基因，这些基因内有某些酶的识别位点。

当用某种限制酶消化并插入外源目的基因时，抗药性基因将不被表达，从而在药物筛选平板上培养时，可区分出重组转化子的菌株的方法。

β-半乳糖苷酶插入失活法：

许多载体带有来自大肠杆菌Lac操纵子DNA区段（含β-半乳糖苷酶的头146个编码信息和调控序列，还插入了一个多克隆位点）。

而宿主细胞可编码β-半乳糖苷酶C端，两者之间可以实现基因内的互补，成为具有酶学活性的蛋白质。

Lac+细菌在有诱导物，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落。

当多克隆位点上插入了外源基因时，LacZ的N端片段失活。

因此带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。

基因产物鉴定法：

通过鉴定产物从而确定所克隆的DNA片段或分离的mRNA是否是目的片段或其mRNA。

复制子：

DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元（replicon）。

启动子：

是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列，是基因表达调控的重要元件。

终止子：

是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列。

转录启动后，RNA酶沿着DNA链移动，持续合成RNA链，直到遇到终止信号为止。

起始密码：

也称翻译起始密码子，是翻译的起始位点,通常为AUG（ATG）,是首选的起始密码子，编码甲硫氨酸，也有极少数生物利用其他密码子作为翻译的起始位点。

终止密码：

即翻译终止密码子，翻译过程中，当核糖体移动遇到终止密码子，核糖体就从mRNA上模板上脱落，终止蛋白质的翻译过程。

密码偏好性：

编码氨基酸的密码子具有简并性，而每种生物对同义密码子的选择都有自己的偏好性。

SD序列：

核糖体结合位点，指原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列，即SD序列。

基因定点诱变法：

是在体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术,包括盒式取代诱变、寡核苷酸引物诱变及PCR定点诱变等。

电镜R-环检测法：

是一种采用mRNA作探针，用于检测具有外源DNA插入片段重组体分子的核酸杂交法。

其原理是：

在临近双链DNA变性温度下和高浓度（70%）的甲酰胺溶液中，双链的DNA-RNA杂交分子要比双链的DNA-DNA分子更稳定。

SOUTHERNBLOT：

一种可以用来确定克隆的特定DNA序列，判明插入片段来自染色体基因组的哪一部位，还可以证明是否带有目的基因片段的方法。

1.基因工程操作步骤

（1）获取外源目的基因.

（2）外源目的基因的加工.

（3）基因运载体的分离提纯.（4）重组DNA分子的形成.

（5）重组DNA转入受体细胞．（6）重组菌的筛选、鉴定和分析．

（7）工程菌的获得和基因产物的分离.

2.如何将基因信息转化成基因实物?

3.PCR扩增目的基因的原理及步骤

原理：

由于DNA在高温下会裂解为两条链，当温度下降后能够复性成为双链，所以可以通过控制温度的变化，设计引物作为启动子，加入dNTP和taqDNA聚合酶，可以实现PCR体外扩增。

步骤：

1、变性，温度升高至94oC，DNA双链裂解为单链；

2、退火（复性）温度下降至40-60oC，使之与引物结合；

3、延伸，在72oC下，以dNTP为原料，按半保留复制和碱基互补配对原则合成新链。

4、重复1-3.

4.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的功能，Klenow如何获得,有那些特性及用途?

功能：

5’至3’聚合酶活性

5’至3’核酸外切酶活性

3’至5’核酸外切酶活性

获得：

Klenow是枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶1而产生出来的大片段分子，或者通过克隆技术而得到的单一多肽链，由全酶中去除了5‘至3‘核酸外切酶活性。

特性：

去除了5‘至3‘核酸外切酶活性,而5’至3’聚合酶活性和3’至5’核酸外切酶活性均不受影响。

用途：

1、补平限制酶切割DNA后产生的3‘凹端；2、用[32P]dNTPPT对DNA片段的3‘凹端进行末端标记；3、在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；4、应用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序。

5.理想质粒的特点？

质粒的基本构成（有哪几部分）pBR322的构成部件？

为什么相同复制子的不同载体不能在同一宿主中共存？

理想质粒的特点：

1）具有复制起点（必不可少的基本条件）即具有复制子（Replicon）功能,且复制起始区中没有所需限制酶切位点

2）具有两种易被检测的选择性标记

理想的质粒克隆载体应具有两种抗菌素抗性基因，在插入外源DNA片断之后所形成的重组质粒中,至少保留一个强选择标记

3）具有多种限制酶的单一识别位点

具有多种限制酶单一切点,适用于各种限制酶产生的DNA片断的插入,满足克隆需要.

4）具有尽可能小的相对分子量

分子量小有利于分离纯化,有利于克隆较长DNA片断,有利于质粒DNA的制备以及使克隆基因的剂量增加,使限制酶的多重识别位点的机率降低.

5）应该属于松弛复制型

松弛复制型的质粒载体DNA在氯霉素存在下大量扩增其拷贝数,使细胞中克隆基因的剂量增加

6）应为非传递性质粒。

从生物的安全防护考虑。

质粒的组成：

必要区：

在必要区中与质粒DNA复制有关的基因，他们对质粒的存活及复制功能都极为重要

非必要区：

在非必要区中，有直接影响细胞表现，如结合转移，对毒物的抗性等形状的基因存在。

pBR322质粒是由3个不同来源的部分组成。

1、pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）

2、pSC101质粒的四环素抗性基因（Tetr）

3、ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）

相同复制子的不同载体在细胞内复制时会相互竞争，由于大小不同，复制所需时间不同。

较小的载体所需时间短，经过一段时间的复制后其数量会远超过较大载体，从而将较大载体淘汰掉。

所以相同复制子的不同载体不能共存于同一宿主。

6.穿梭质粒必备的功能元件。

以穿梭质粒为代表介绍：

基因组成元件

1）DNA复制启始序列，含大肠杆菌和酵母中复制的两套复制子。

2）选择标记，分为缺陷型（与宿主基因有关，载体可弥补之，β-半乳糖苷酶）和显性两类（增加其性状，如抗生素抗性，常用）。

3）启动子---大小约1~2kb，一般活性低，故需强启动子，以及增强子。

4）分泌信号序列---提高蛋白的分泌?

正常不能分泌.

5）终止子---终止转录

有丝分裂稳定区---保证能够平均分配到子代细胞

7.质粒、噬菌体、黏粒载体的运载DNA能力有多大?

原因是？

质粒：

大小4KB,一般复制能力10KB,所以运载能力小于10KB,一般在5KB左右

噬菌体：

其头部蛋白质外壳对所包装DNA大小有严格要求，只有75-105%的野生型λDNA长度（38-52kbDNA）才能被包装成噬菌体颗粒。

故插入型10KB左右,取代型10-20KB,因为噬菌体一般为48KB

粘粒载体（柯斯质粒）：

35-45KB,,大到47KB,小到31KB

8.放射性标记探针的各种制备方法

（1）切口平移法

1.加入微量的DNaseⅠ造成断裂，产生缺口

2.DNA多聚酶Ⅰ附着在切口上，由于该酶的5′→3′外切酶活性，它可以从切口开始沿5′→3′方向逐个地切除脱氧核苷酸。

3.DNA多聚酶Ⅰ附着在切口上，由于该酶的5′→3′外切酶活性，它可以从切口开始沿5′→3′方向逐个地切除脱氧核苷酸。

4.切口就不断向右移动，同时切口左侧的新合成的DNA链不断延长。

5.如果加入反应系统的四种dNTP中有任何一种或两种是用3H或32P标记，那么由于切口平移而新合成的DNA链便具有放射性了，而且其碱基序列仍与反应前的DNA分子完全一样，这样就可以用作杂交探针。

（2）引物延伸法

DNA聚合酶可利用寡核苷酸作引物，沿单链模板起始DNA的合成。

随机引物可从一些厂家购买，也可在自动DNA合成仪上合成一个八聚体分子集群作为引物。

使用一种［32P］dNTP和3种未标记的dNTP为前体，可合成高比活度的标记DNA探针。

（3）体外转录合成

以DNA为模板在体外制备单链探针主要有两种方法，

1）一种是合成可与克隆于M13噬菌体载体上的序列互补的单链DNA探针，

2）另一种是将克隆于特定载体的靶序列转录成RNA探针。

第二种方法只需用不含RNA酶的DNA酶Ⅰ便可容易地除去DNA模板，故该法成为合成单链探针的首选方法

而且RNA探针与DNA形成的杂交体更稳定，也不会被RNA酶消化，可用该酶除去非特异结合的探针

该法应具备以下条件：

①线状化重组质粒DNA模板。

应含平端或5′突出端，质粒DNA被限制酶切割完全（线状化），反应中模板浓度应约为20nmol/L。

②重组质粒含有噬菌体强启动子。

在插入的外源目的序列的上游（即多克隆位点的上游）带有来自SP6、T7或T3噬菌体的强启动子，下游提供一个限制酶切位点，以便于使重组质粒线状化。

③特异性的噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶：

SP6、T7或T3噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶对其相对应的启动子有特异性。

当它与线状质粒及4种rNTP混合温育时，所有的RNA转录合成都起始于强启动子，终止于线状DNA末端。

④核苷酸浓度：

当每种rNTP浓度都大于一定值时，90%以上转录物（RNA）是全长的。

一般用［1-32P］GTP和其他3种未标记的rNTP为前体。

放射性RNA探针的合成程序：

①用适当限制酶消化制备2pmol的模板DNA；

②如需要，可用DNA聚合酶处理消化DNA，以除去突出的3′末端；

③用酚：

氯仿抽提并用乙醇沉淀模板DNA以纯化之；

④于微量离心管混合各种反应物，在37℃（T3、T7聚合物）或40℃（SP6聚合物）温育反应1~2h；

⑤加入无RNA酶的胰DNA酶Ⅰ，于37℃温育15min以除去DNA模板；

⑥抽提，纯化并回收RNA，贮于-70℃备用。

（4）cDNA探针的合成

扣除杂交法

若cDNA探针需用于筛选cDNA文库或基因组文库时，目的系列的浓度应较高，但是检测稀有mRNA的cDNA克隆是很困难的。

为此，可采用所谓扣除杂交的方法，如图7-8所示，制取单链标记cDNA吸收探针，使cDNA探针中某一特定序列的浓度得以提高。

具体方法是：

①用从一种表达目的基因的细胞中提取总mRNA作模板，反转录合成放射性标记cDNA探针；

②再从不表达目的基因的另一种细胞提取总mRNA，并以10倍于标记cDNA的量与之充分杂交；

③通过羟基磷灰石柱层析将DNA∶RNA杂交体与未杂交的标记cDNA（单链）分开；

④未杂交的单链标记cDNA再与mRNA重复杂交一次，并再经柱层析分开，剩下的单链标记cDNA即为吸收探针。

（5）合成寡核苷酸探针

①特定序列的单一寡核苷酸探针

②较短而简并性较高的成套寡核苷酸探针。

这种探针是对少量高度纯化的蛋白质进行测序，并得出其中一小段氨基酸的序列后，再按照遗传密码的简并性推导而得的寡核苷酸片段，经末端标记后便可作为杂交探针，如图7-9所示。

例如一套含有32段（每段长17个核苷酸）互不相同的寡核苷酸，便可囊括编码PheMetGluTrpHisLysAsn这一肽段的所有编码方式。

③较长而简并性较低的成套寡核苷酸探针。

一种是寡核苷酸中只含有对应于每一氨基酸位置的所有可能的密码中的一部分（即猜测体），它含有最可能与真正的基因相配对的密码子的组合；另一种是在简并位点上带上一个“中性”碱基，如次黄苷酸，

酶促磷酸化反应标记合成的寡核苷酸制备探针的过程如下：

①配制反应混合液［寡核苷酸、（2-32P）ATP、水等］，充分混匀；

②加入T4噬菌体多核苷酸激酶并混匀，于37℃温育45min；

③于68℃将反应液加热10min以失活酶；

④若探针的浓度符合要求，则对标记探针进行纯化。

9.放射性抗体检测法筛选重组菌体的原理与简单过程。

原理：

通过制备针对该克隆基因的蛋白质产物的抗血清或单克隆抗体，与目的蛋白结合成抗原-抗体复合物吸附于固体支持物（如聚乙烯薄膜）上，并与用125I放射性同位素标记后的第二种抗体一道温育，通过放射自显影技术测定复合物位置，据此确定在原平板中能够合成抗原的菌落位置。

附：

最佳抗体应当是与目的蛋白（抗原）不同表位反应的一组单克隆抗体混合物，或者是不与宿主成分反应的高滴度多克隆抗体

简单过程：

1）将转化菌落涂布平板，制备影印的复制平板

2）把平板放置在氯仿蒸气中处理

3）将连结在固体支持物上的抗体，缓慢地同溶解的细胞接触，以利于抗原吸附到抗体上

4）将固体支持物与标记后第二种抗体一道温育

5）通过放射自显影技术测定抗原-抗体复合物的位置

10.DNA与质粒连接有那些方法，及其优劣？

（P102-112）

方法主要有：

1、粘性末端连接法2、定向克隆法3、平末端连接法4、同聚物加尾法5、加人工接头连接法6、加DNA衔接物连接法7、其他转换末端形式连接法

1）粘性末端连接法：

选用一种对载体DNA只具惟一限制位点的限制酶作特异切割，再将外源DNA也用同一种限制酶作同样的消化，将载体及外源DNA混合后，由于具有相同粘性末端，能够形成双链结合体，其中单链缺口经DNA连接酶封闭后，产生稳定的杂种分子。

此外，常需调整连接反应中两种DNA的浓度或用碱性磷酸酶（BAP或CIP），预先处理线性的载体DNA分子，防止载体自身环化。

优点：

经过同一限制酶酶切消化的外源DNA与载体DNA容易进行退火连接；缺点：

酶切后载体DNA分子可能发生自身环化作用，也有可能形成串联卦聚物，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合的环形结构。

此外，导入的外源DNA有两种彼此相反的取向，对于基因克隆不方便。

2）定向克隆法：

当质粒载体和外源DNA片段用同样的限制酶切割时，两种DNA能共价地连接起来，但由此引导的外源DNA片段的插入，可以有彼此相反的取向；因此应用两种不同的限制酶消化外源DNA，产生带有非互补突出末端的外源DNA片段，可以只以一个方向容易地将其插入到用相同两种限制酶消化而产生相匹配粘性末端的载体中。

优点：

载体片段两端突出末端不互补，不能自身环化，与外源DNA片段定向重组效率高。

3）平末端连接法：

某些限制酶切割后产生具有平末端的DNA片段，可用T4噬菌体DNA连接酶催化平末端DNA片段互相连接。

优点：

对于两种具有不互补粘性末端的DNA片段，或是其中一种具平末端，另一种具粘性末端的DNA片段，可用S1核酸酶修饰成平末端后用T4噬菌体DNA连接酶连接。

缺点：

平末端连接属于低效反应，且重组之后一般不能原位删除。

4）同聚物加尾法：

利用末端脱氧核苷酸转移酶可催化dNTP加到单链或双链DNA3’羟基端的能力，在目的DNA和质粒载体上加入互补同聚物，两者再通过互补同聚物之间的氢键形成可以转化大肠杆菌的开环重组分子。

优点：

可使两个具平末端的DNA片段进行连接，也可使具平末端和粘性末端的DNA片段连接。

缺点：

只对质粒载体有效，所产生cDNA文库较难贮存和复制；质粒和cDNA上的同聚物长度难于控制相等，影响克隆效率；用其转化宿主菌的效率依不同菌株有较大差别。

5）加人工接头连接法：

人工接头是化学合成的两个自相互补核苷酸寡聚体，可形成带一个或以上的酶切位点的平末端双链寡核苷酸短片段。

人工接头的5’端经磷酸化后，通过T4DNA连接酶与平末端的外源DNA片段连接；具衔接物的载体DNA和外源DNA，用适当限制酶消化后，产生彼此互补的粘性末端后再连接。

优点：

兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法的优点，且可以根据实验的不同要求，设计出具有不同限制酶位点的人工接头。

缺点：

若待克隆的DNA片段或基因内部含有与所加人工接头相同的酶切位点，则在酶切消化人工接头时也会把外源DNA切成不同片段，影响后续操作。

6）加DNA衔接物连接法：

DNA衔接物为人工合成的一头为平末端（可与双链目的DNA连接），另一头为带有某种限制酶位点粘性末端（可与载体相应粘性端连接）的双链寡核苷酸，它与双链目的DNA连接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载体DNA连接。

缺点：

反应体系中的DNA衔接物因互补粘性末端易形成二聚体分子，具DNA衔接物的目的DNA易发生自身环化；需要修饰DNA衔接物的粘性末端使之无法形成二聚体。

11.目的基因合成设计时，需要考虑哪些因素？

1）寡聚核苷酸片段划分的长度，一般将基因划分为30~50核苷酸对的若干个片段

2）限制酶位点：

通过密码子的简并性改换部分密码子，以消除基因内部多余的限制酶位点。

3）排除基因内部正反向重复序列：

正反向重复序列（片段间重叠区）会影响拼接效率

4）选择表达宿主偏爱的密码子

5）加起始与终止密码子

6）基因表达因素；根据所选载体的不同，还要考虑调整合适的阅读框，加核糖体结合位点，加信号肽与保守序列等。

12．含目的基因重组克隆的五大种筛选方法及其简单原理?

1）抗生素抗性基因插入失活法：

很多质粒载体都带有1个或多个抗生素抗性基因标记，在这些抗药性基因内有酶的识别位点。

当用某种限制酶消化并在此位点插入外源目的DNA时，抗药性基因不再被表达，称为基因插入失活。

因此，当此插入外源DNA的重组质粒载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时，根据对该药物由抗性转变为敏感，便可筛选出重组转化子（重组体）。

2）β-半乳糖苷酶基因插入失活法：

许多载体都带有一个来自大肠杆菌的Lac操纵子DNA区段，基因含有编码β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息（LacZ’）和调控序列（LacI），还插入了一个多克隆位点（不破坏阅读框）。

而宿主细胞可编码β-半乳糖苷酶C端，两者之间可以实现基因内的互补（称为α-互补），成为具有酶学活性的蛋白质。

Lac+细菌在有诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和生色底物5-溴-4-氯-3’-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落。

然而，当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，使LacZ的N端片段失活，破坏了α互补作用。

因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落，通过目测就可轻易识别并筛选出可能带有重组质粒的转化子菌落。

3）快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法：

配制一种破碎细胞缓冲液，其中含有十二烷基硫酸钠（SDS）和乙二胺四乙酸（EDTA）。

SDS能溶解膜蛋白使细胞破裂，并解聚核蛋白，还能与蛋白质结合成复合物，使蛋白质沉淀；EDTA能螯合金属离子，防止脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。

细胞破碎后经高速离心，去除细胞碎片和大部分的染色体DNA、RNA、蛋白，得到含有质粒DNA的上清液。

将含有质粒DNA的上清液（单菌落溶菌物），直接进行点样凝胶电泳和分离测定。

在琼脂糖凝胶电泳上分离，包括染色体DNA、不同大小的质粒DNA以及RNA，它们都可经肉眼观察或拍照而显示。

一个单菌落会有大量的质粒DNA，它足以在染色体DNA前面形成一条独立的电泳谱带

由于带有外源DNA插入序列的相对分子质量较大，其重组体DNA比未插入外源DNA的相对分子质量较小的质粒DNA，在凝胶中的迁移