糖类色谱分析.docx

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糖类色谱分析

■目　录

１．前言…１

２．糖的种类和物理性质…１

２－１　单糖…1

２－２　二糖・低聚糖…2

３．在糖分析中使用的色谱柱…３

３－１　正相色谱柱…3

３－２　聚合体系强阴离子交换色谱柱…4

３－３　反相色谱柱…5

４．在糖分析中使用的检测器…６

４－１　差示折射率计（RI检测器）…6

４－２　脉冲式电化学（PAD）检测器…7

４－３　萤光检测器…8

【参考文献】…8

５．糖分析实例…９

５－１　利用RI检测器进行糖分析的案例…9

５－２　利用PAD进行糖分析的案例１…15

５－３　利用PAD进行糖分析的案例２…19

５－４　利用PAD进行糖分析的案例３…23

５－５　利用FL检测器进行糖分析的案例１…25

５－６　利用FL检测器进行糖分析的案例２…28

５－７　利用LC-MS进行分析的案例…31

１．前言

糖是三大营养素之一，是人体的构成成分及能源。

糖是由C、H、O三种元素构成，由于可用一般式Cm（H2O）n表示，所以也被称为碳水化合物（carbohydrate）。

广义地说，如“氨糖”、“酸性糖”那样，有时将含氨基以及酸性基的物质也分为糖类。

或者是根据分子大小不同，有时也可将糖分为单糖、二糖等在20碳单位以内的低聚糖和淀粉、糊精、纤维素等多糖。

在本手册中，将对单糖、二糖的分析系统以及分析手法作以介绍。

在使用HPLC进行分析时，由于一般的中性糖在紫外不产生吸收，所以必须对中性糖的检测方法进行深入探讨。

在这里，将对糖分析中使用的色谱柱、检测器的特点、实际的测定系统以及分析案例作以介绍。

２．糖的种类和物理性质

２－１　单糖

单糖类可能形成环状以及直锁状的构造。

如果是直锁状的构造，其末端是醛的单糖类（醛糖※），在水溶液中二种环状构造通过直锁型构造而保持平衡状态。

如果是环状构造，羰基的碳（C1）也形成不齐碳，该位置的氢氧基不同方向的二种异性体被称为各自正位异构体。

而且将C1称为正位异构体碳，将与C1相结合的OH称为正位异构体氢氧基。

※：

形成直锁状而且具有酮基的糖被称为酮糖。

图1　水溶液中D-葡萄糖的构造

单糖类一般极易溶于水，难溶于甲醇、乙醇、丙酮等。

另外，不溶于苯、酯、氯仿等。

２－２　二糖･低聚糖

二糖就是两个单糖，低聚糖是比较多的单糖通过糖苷结合而形成的糖类。

如蔗糖、乳糖那样，二糖类具有人的营养所需要的重要成分。

一般的低聚糖，有作为游离型或者是配糖体（糖和另外的化学种类相结合的物质）而在生理学上具有意义的大小而合成的、或者是作为多糖类的加水分解物而生成的。

从不同结合方式看，由于单糖间的结合方式不同，有还原性二糖类（麦芽糖型）和非还原性二糖类（海藻糖型）两种。

在还原二糖类中，由于单方的正位异构体氢氧基和另外的乙醇性氢氧基结合，具有游离的正位异构体氢氧基，所以具有还原性，存在α型和β型两种异性体。

在还原型二糖类中，有麦芽糖、乳糖、纤维素二糖、龙胆二糖等。

如果是非还原性二糖类，由于构成单糖的正位异构体氢氧基相结合，不显示还原性。

在非还原性二糖类中，有蔗糖、海藻糖等。

低聚糖易溶于水或者水和甲醇或者水和乙腈的混合溶液，不溶于苯、酯、氯仿等。

３．在糖分析中使用的色谱柱

作为糖分析中使用的色谱柱，大致有正相色谱柱、糖分析用色谱柱（强阴离子交换色谱柱）、可使用100％水的反相色谱柱等。

３－１　正相色谱柱

在糖类分析中最常使用的色谱柱是NH2色谱柱。

但是存在一个问题，就是在传统的NH2色谱柱中，氨丙基直接与硅胶结合，氨基的强碱性会使基质硅胶溶出，在含水率高的流动相中，色谱柱寿命比较短。

在CAPCELLPAKNH2UG80中，硅胶表面被硅酮聚合体保护，而且，在NH2基导入前，设置具有架桥构造的聚胺层。

因此，与传统的NH2色谱柱比较，具有极强的化学稳定性。

在SG80类（分离特性相同）中，充填剂表面的聚合体更加严密，其耐久性更加优越。

CAPCELLPAKNH2UG80的物性值如表１所示。

表１　CAPCELLPAKNH2UG80的物性值

基材

高纯度硅胶

官能团

含聚胺的架桥构造的NH2（氨基）

细孔径（nm）

比表面积（m2/g）

450

密度（μmol/m2）

1.4

可使用的pH范围

2–8

流动相使用乙腈／水的混合液。

通过变化乙腈／水的比率，调整保留时间，水的比率越高，溶出越快。

在使用NH2色谱柱的场合，如用水作样品溶剂，与流动相比较，溶出力比较强，会出现保持时间短的峰比较宽的情况。

样品溶剂至少应该选择50%以上的乙腈，最好尽量作成与流动相相近的组成。

糖类一般易溶于水，不溶于乙腈，所以在溶解样品时，应该采取首先将糖类于溶解水，再加乙腈或者是用流动相稀释等方法。

３－２　聚合体系强阴离子交换色谱柱

糖类的乙醇性氢氧基，其pH如达到13以上，就会如图１一样发生解离，成为阴离子。

使用pH13附近的流动相，利用离子交换作用分离糖类的色谱柱，就是聚合体系强阴离子交换色谱柱。

图2　强碱条件下的糖类解离

所谓SUCREBEADI，是在利用二阶段膨润法合成的均一粒径的苯乙烯二乙烯基苯共重合体的单体中，充填结合了４级烷基胺基的强阴离子交换充填剂的糖分析专用色谱柱。

图3　苯乙烯二乙烯基苯共重合体的单体的显微鏡写真

SUCREBEADI的物性值如表２所示。

由于基材是聚合体，可使用pH范围非常广，在1–14之间都可以使用，在强碱性条件下也可能使用。

因此，具有解离后乙醇性氢氧基的糖，可通过离子交换作用进行保持、分离。

表２　SUCREBEADI的物性值

基材

苯乙烯二乙烯基苯共重合体

官能基

４级烷基胺

粒径（nm）

离子交换容量（meq/g）

可使用pH范围

1-14

３－３　逆相系色谱柱

由于糖的极性非常高，所以在逆相状态下保持时间很小。

因此，可使用水系100%的特殊C18色谱柱进行分离。

虽然分离单糖比较困难，但是可分离单糖和低聚糖。

在CAPCELLPAKC18中，AQ系列可使用水系100%进行分离。

AQ的物性值如表３所示。

表３　CAPCELLPAKC18AQ的物性値

基材

高纯度硅胶

官能基

C18

粒径（nm）

5以及3

比表面积（m2/g）

330以及300

12以及11

密度（μmol/m2）

1.7

可使用的pH范围

2-9

另外，在萤光衍生化的糖的分析等方面，可使用通常的C18色谱柱。

４．在糖分析中使用的检测器

由于糖类在构造上不具有吸收，所以不能使用普通的UV检测器。

因此，一般都使用差示折射率计、脉冲式电化学检测器、蒸发光散射检测器等进行检测。

另外，对于进行了萤光衍生化的糖类，可使用萤光检测器进行检测。

在这里，我们对差示折射率计、脉冲式电气化学检测器、萤光检测器进行简单说明。

４－１　差示折射率计（DifferentialRefractometer,通称：

RI检测器）

在RI检测器中，当在夹有检测池结构的对照液和试料液中通过光时，与两液的折射率差相对应，将产生的光的变异转换为电气信号后，以色谱进行记录。

　　　表４　RI检测器的特征

优点

1.是万能型检测器

（对于不具有吸收的乙醇、糖、高分子等，都可使用）

缺点

1.灵敏度低

2.没有选择性

3.对温度变化敏感

4.受流速变化的影响

5.不能在梯度溶离法中使用

因此，可以说本检测器是适用于高浓度而且纯度高的糖样品的等梯度分析的检测器。

４－２　脉冲式电化学检测器（PulsedAmperometricDetector:

PAD）

３－２　如在SUCREBEADI的项目（p.4）中所述，糖类的乙醇性氢氧基在pH13以上时，发生解离，成为离子状态。

该离子化的氢氧基不只是发生分离，同时还可利用在检测上。

由于离子化的氢氧基具有电化学活性，但是，如果在一定电压下使用通常的电化学检测器（Electrochemicaldetector:

ECD），反应后的生成物会不可逆地附着在电极表面上，灵敏度会急速降低。

因此，如图4所示，采用阶越程序脉冲方式使电位发生变化，以电气方式除去生成物，避免产生蓄积。

利用本方法，可对一般糖类进行检测。

图4　阶越程序脉冲方式

表5　PAD的特征

优点

1.选择性高

2.灵敏度高

缺点

1.安定性不好

2.在正相HPLC上不能使用※１

3.有溶存氧的弊端。

※１　由于资生堂NANOSPACEECD3016的电极采用二重构造，参照电极（①）不直接和流动相接触。

因此，通过变更外筒液，可将有机溶剂使用在流动相中。

①Ag

③KCl

或者是

NaClO4

②KCl

图5　特殊构造的参照电极（已申请专利）

４－３　萤光检测器

萤光检测器的特征，由于以励起波长和萤光波长两种因素为基础，所以选择性比较高，同时由于采用发光分析法而灵敏度比较好。

糖的萤光衍生化的分析实例——2-氨吡啶化。

表6　萤光检测器的特征

优点

1.选择性高

2.灵敏度高

缺点

1.流动相的pH以及溶剂的种类会对发光强度产生影响

2.有浓度消光现象

3.励起光源的寿命短

4.有未反应诱导体化试剂的弊端

【参考文献】

1）儿岛明次，松本久男，山本郁男，　新卫生学　第2版　广川书店。

2）理化学辞典　第３版　岩波书店。

3）H.Kutsuna,Y.Ohtsu,M.Yamaguchi,J.Chromatogr.635,35（1993）.

4）A.Ohkubo,O.Shirota,AKobayashi,T.Kimura,Y.Ohtsu,K.Hosoda,N.Tanaka,

J.MicrocolumnSeparations.13,No.1,（2001）.

5）高速液体色谱　改正２版　日本分析化学会关东支部编　丸善。

6）D.C.Johnson,Nature,321,451（1986）.

５．糖分析的案例

５－１　利用RI检测器进行糖分析的案例

本系统是使用在异构糖分析的系统。

由于采用RI检测器，样品中所有成分都可以被检测，因此，本系统是面向高浓度的糖分析以及结构不复杂的高纯度样品的检测系统。

（１）单糖･二糖

是使用NH2色谱柱的分析实例。

在色谱柱中一般使用SG品级，但是UG品级由于采用硅胶聚合体涂层，所以涂层更加细密，推荐今后从事分析的可采用NH2UG80进行。

由于RI检测器的灵敏度比较低，含有%的浓度是前提。

可通过提高乙腈比率，提高全体的保留时间。

1.Rhamnase（鼠李糖）

2..Xylose（木糖）

3.Fructose（果糖）

4.Mannose（甘露糖）

5.Glucose（葡萄糖）

6.Sucrose（蔗糖）

7.Lactose（乳糖）

8.Maltose（麦芽糖）

【HPLCConditions】

Column：

CAPCELLPAKNH2SG80S5：

4.6mmi.d.×250mm

Mobilephase：

CH3CN/H2O=85/15

Flowrate：

1.0mL/min

Temperature：

40℃

Detect：

Inj.vol.：

10µL

Sample：

将各糖溶解在50vol%CH3CN中。

（２）麦芽低聚糖

是使用NH2色谱柱的分析实例。

在色谱柱中可使用SG品级，但是UG品级由于采用硅胶的聚合体涂层，更加细密，推荐今后从事分析的可采用NH2UG80进行分析。

结合了葡萄糖的麦芽低聚糖，在异构条件下可得到非常良好的分离。

1.Glucose（葡萄糖）

2.Maltose（麦芽糖）

3.Maltotriose（麦芽三糖）

4.Maltotetraose（）

5.Maltopentaose

6.Maltohexaose

7.Maltoheptaose

【HPLCConditions】

Column：

CAPCELLPAKNH2SG80S5：

4.6mmi.d.×250mm

Mobilephase：

CH3CN/H2O=65/35

Flowrate：

1.0mL/min

Temperature：

40℃

Detect：

Inj.vol.：

10µL

Sample：

1mg/mL

（３）糖醇

是使用NH2色谱柱的分析实例。

在色谱柱中可使用SG品级，但是UG品级由于采用硅胶的聚合体涂层，所以更加细密，推荐今后从事分析的可采用NH2UG80进行分析。

由于糖醇具有比糖更高的极性，所以可在高浓度乙腈的条件下进行分析。

可得到良好的分离。

1.Glycerin

2.Pentaerythritol

3.D-Sorbitol

4.Mannitol

【HPLCConditions】

Column：

CAPCELLPAKNH2SG80S5：

4.6mmi.d.×250mm

Mobilephase：

CH3CN/H2O=85/15

Flowrate：

1.0mL/min

Temperature：

40℃

Detect：

Inj.vol.：

20µL

（４）单糖・二糖

是使用NH2色谱柱的分析实例。

可得到良好的分离。

1.Fructose

2.Glucose

3.Saccharose

4.Lactose

5.Maltose

【HPLCConditions】

Column：

CAPCELLPAKNH2UG80S5：

4.6mmi.d.×250mm

Mobilephase：

CH3CN/H2O=80/20

Flowrate：

1.0mL/min

Temperature：

40℃

Detect：

Inj.vol.：

10µL

Sample：

1mg/mL

（５）麦芽低聚糖

这是使用ODS色谱柱得到的分析例。

采用三糖以上的低聚糖获得正位异构体分离。

在水溶液中，糖类以正位异构体平衡状态存在（p.1图1参照）。

在该正位异构体的平衡速度差以及充填剂表面的C18基的相互作用下，产生自由能量差（由于相互作用，自由能量低的，保留时间比较大）。

1.Glucose

2.Maltose

3.Maltotriose

4.Maltotetraose

5.Maltopentaose

6.Maltohexaose

7.Maltoheptaose

【HPLCConditions】

Column：

CAPCELLPAKC18AQS5：

4.6mmi.d.×250mm

Mobilephase：

H2O

Flowrate：

1.0mL/min

Temperature：

35℃

Detect：

Inj.vol.：

20µL

Sample：

1000µg/mL

５－２　利用PAD进行糖分析的案例１

通过使用基材为聚合体的糖分析专用色谱柱SUCREBEADI，可将碱性溶液作为流动相使用。

因此，即使在将PAD作为检测器的情况下，不需要在后色谱柱中进行pH调整，也不需要稀释样品，可进行高灵敏度分析。

（１）单糖

1.Fucose

2.Mannose

3.Glucose

4.Galactose

5.Ribose

【HPLCConditions】

Column：

SUCREBEADⅠ：

2.0mmi.d.×250mm

Mobilephase：

300mmol/LNaOH

Flowrate：

100µL/min

Temperature：

20℃

Detect：

PAD（V1）0.15V（V2）0.65V（V3）-0.95V（Gold）

Inj.vol.：

1µL

Sample：

将标准品用水溶解。

（1mg/mL）

（2）

人红血球中的糖代谢物的一齐分析

提供：

兵库县成人病中心临床研究所

可对人红血球中的糖代谢物10种物质进行同时分析。

可对糖尿病时的病态进行解析。

1.myo-Inositol

2.Glycerol

3.Arabitol（I.S.）

4.Sorbitol

5.Mannose

6.Glucose

7.Galactose

8.Fructose

9.Ribose

10.Anhydroglucitol

【HPLCConditions】

Column：

SUCREBEADⅠ：

2.0mmi.d.×250mm

Mobilephase：

300mmol/LNaOH

Flowrate：

100µL/min

Temperature：

20℃

Detect：

PAD

Inj.vol.：

10µL

Sample：

标准试料各200µmol/L、实试料

使用固相萃取进行预处理后的人红血球。

（３）糖乙醇（６种）

1.myo-Inositol

2.meso-Erythritol

3.Xylitol

4.Sorbitol

5.Mannitol

6.Maltitol

【HPLCConditions】

Column：

SUCREBEADⅠ：

2.0mmi.d.×250mm

Mobilephase：

300mmol/LNaOH

Flowrate：

100µL/min

Temperature：

20℃

Detect：

PAD（V1）0.15V（V2）0.65V（V3）-0.95V（Gold）

Inj.vol.：

2µL

Sample：

标准品用H2O进行稀释。

（830µg/mL）

（4）

糖醇（４种）

1.Xylitol

2.Sorbitol

3.Lactitol

4.Maltitol

【HPLCConditions】

Column：

SUCREBEADⅠ：

2.0mmi.d.×250mm

Mobilephase：

300mmol/LNaOH

Flowrate：

100µL/min

Temperature：

20℃

Detect：

PAD（V1）0.15V（V2）0.65V（V3）-0.95V（Gold）

Inj.vol.：

1µL

Sample：

标准品用H2O进行稀释。

（500µg/mL）

５－３　利用PAD检测器进行糖分析的案例２

通过使用基材为聚合体的糖分析用色谱柱SUCREBEADⅠ，可将碱性溶液作为流动相使用。

因此，在将PAD作为检测器的情况下，不需要在后色谱柱中进行pH调整，样品也不需要进行稀释，可进行高灵敏度分析。

而且，在追加一台泵使用RI检测器进行检测时，使不可能的梯度分析成为可能，适应范围非常广。

（１）磷酸糖

通过使流动相中的盐浓度定时发生变化（盐浓度梯度），调节离子交换时的保留时间，可分析各种磷酸糖。

1.Glucose-1-P

2.Glucose-6-P

3.Fructose-6-P

4.Fructose-1,6-diP

１

【HPLCConditions】

Column：

SUCREBEADⅠ：

2.0mmi.d.×250mm

Mobilephase：

（A）300mmol/LNaOH

　（B）300mmol/LNaOH,1.0mol/LCH3COONa

B15%→15%（10min）→40%（25min）→40%（35min）→

15%（35.1min）Gradient

Flowrate：

200µL/min

Temperature：

20℃

Detect：

PAD

Inj.vol.：

5µL

（２）麦芽低聚糖

通过使流动相中的盐浓度定时发生变化（盐浓度梯度），调节离子交换时的保留时间，可分析低聚糖。

与RI检测器比较，灵敏度非常好。

1.Glucose

2.Maltose

3.Maltotriose

4.Maltotetraose

5.Maltopentaose

6.Maltohexaose

7.Maltoheptaose

【HPLCConditions】

Column：

SUCREBEADⅠ：

2.0mmi.d.×250mm

Mobilephase：

（A）300mmol/LNaOH

　（B）300mmol/LNaOH,1.0mol/LCH3COONa

　B5%→30%（60min）Gradient

Flowrate：

200µL/min

Temperature：

35℃

Detect：

PAD

Sample：

1mg/mL

（３）氨糖以及酸性糖

为确保氨糖的分离，会在碱性条件下使解离的糖醛酸溶出，而使用盐浓度梯度方法。

由于是物性完全不同的化合物，保持时间大有不同，分析时间拉长，但是采用梯度法可进行同时分析。

1.Glucosamine

3.Glucuronicacid

2.Galactosamine

【HPLCConditions】

Column：

SUCREBEADⅠ：

2.0mmi.d.×250mm

Mobilephase：

（A）200mmol/LNaOH

　（B）200mmol/LNaOH,400mmol/LCH3COONa

　B5%→5%（10min）→95%（100min）→5%（100.1min）Gradient

Flowrate：

100µL/min

Temperature：

20℃

Detect：

PAD

Inj.vol.：

8µL

Sample：

溶解于H2O　（200µg/mL）

５－４　利用PAD检测器进行糖分析的案例３

在色谱柱中使用NH2或者是ODS时，不能将强碱性溶液作为流动相。

因此，在梯度用的泵中，在色谱柱进行分离后（后色谱柱），可追加一台调整pH的泵，就可利用PAD进行检测了。

但是，由于是在后色谱柱进行调整，所以在pH调整的阶段产生稀释。

另外，保证流动相和pH调整液均一混合（避免产生析出等）是非常重要的。

在pH调整液中，可使用NaOH以及LiOH等。

LiOH对有机溶剂的溶解度比较高，更容易使用。

（１）低聚糖

使用PAD检测器，可通过RI检测器不能完成的梯度法进行分析。

但是，为了能够

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