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大豆分子育种研究（doc16页）
大豆分子育种
摘要:
不同基因型的大豆子叶节在添加适宜BA的MS培养基上培养,可从子叶节诱导出高频丛生芽,并获得大量再生植株.通过农杆菌介导法,将深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉林43和黑农37品种中.经过在含500mg鯨卡那霉素的筛选培养基中连续筛选,获得一批转基因植株.经PCR检测和DNA分子杂交分析,初步证明外源基因已导入并整合到大豆基因组中.本文重点阐述了组培再生系统和基因转化系统的内在联系和不同点.
型小豆；从相似系数平均值来看，半野生型小豆材料之间亲缘关系较近，而处在进化两极的野生型材料之间、栽培型材料之间亲缘关系都较远；来自我国西南以及日本南部两地区的小豆材料遗传离散度较大，遗传分化系数、相似系数平均值较低。
聚类分析结果表明，163个小豆材料以遗传相似系数0.32为截值，可分为8大类，归类有较明显的地理相关性及遗传类型的趋同性。
――金文林，文自翔，濮绍京等，应用ＲＡＰＤ分析小豆种质资源遗传多样性及遗传演化趋势，中国农业科学2005,38
（2）:
241-249
摘要 本文研究AFLP技术在大豆上的应用,在改进大豆种子DNA提取方法的基础上,比较同位素与银染检测方法的效果,筛选适宜于大豆AFLP分析的酶切和引物组合,从而建立了适用于大豆指纹图谱快速鉴定的AFLP操作程序,并对我国野生大豆和栽培大豆代表性材料进行了AFLP分析。
近年来,大豆种质资源研究中应用的分子标记大体可以分为两大类。
一类是以分子杂交为基础的RFLP技术,另一类是以PCR反应为基础的各种DNA分子标记,包括有DAF、AP-PCR、RAPD、SSR、AFLP等技术。
作为一种有效的分子标记,RFLP最先被应用到大豆遗传研究中（Apuya等1988）[1]。
但是从建立品种指纹图谱来看,RFLP技术单个探针信息量少,鉴别效率不高[2]。
RAPD技术以其快速简单的优点被用来鉴别大豆种质[3,4],但由于所采用引物Tm值较低,扩增结果易受外界条件的影响。
SSR标记在大豆种质研究中应用也较多[5,6],其多态性远远高于RFLP标记,但一次性检测的位点也有限。
因此,发展一种既能高度揭示遗传变异多样性,又相对操作简单的分子标记,对于大豆指纹图谱研究具有重要的意义。
分子标记AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism）是由Zabeau和Vos（1993）发明的[7,8]。
它基于对基因组DNA进行双酶切,片段末端连接上一个接头,经一个与接头和邻接酶切位点相匹配的引物进行PCR选择性扩增,而后用变性聚丙烯酰胺凝胶分离扩增产物。
这种方法结合了RFLP可靠性和PCR高效性的优点,已经成功地应用于大豆遗传图谱构建与遗传多样性研究中[9,10,11]。
但是该方法受专利保护,分析试剂盒十分昂贵,还需要同位素操作,用叶片提取DNA手续较多,也影响到分析的效率,因此有必要建立适用于大豆的优化操作程序。
本研究旨在探索大豆种子提取DNA并用于AFLP分析的可能性,比较银染与同位素技术在检测效率上的相对效果,筛选适用于大豆的酶切和引物组合,完善大豆指纹分析的AFLP技术,为大豆材料真实性和纯度检验、种质亲缘关系的研究提供方法。
1.2.1 DNA的提取关于大豆DNA的提取,前人多采用叶片提取的方法。
McDonald等（1994）[12]对DNA提取法进行了改进,从玉米、大豆、棉花等种子中提出质量较高的DNA。
但是,作者在用该法提取大豆样品,尤其野生大豆时,由于色素及酚类、醌类等多糖类杂质较多,得到的DNA呈淡红、红色,十分粘稠,溶解困难,260/280比值较低,而且降解严重,这样会影响DNA样品的酶切效果。
因此,本研究在McDonald等基础上作了改进,详见结果部分。
2.1大豆种子DNA提取方法的改进
本研究在McDonald等（1994）[12]提取DNA方法的基础上,作了以下改进:
（1）栽培大豆取半粒或单粒种子,野生大豆可取1-2粒种子,以确保DNA样品的纯度
（2）取干种子,无须在液氮条件下研磨,即可保证DNA的完整性；
（3）尽可能除尽种皮,减少种皮中所含杂质对DNA质量的影响
（4）提高SDS提取液的浓度,由1～2%提高到4%,以增加DNA产量；
（5）第一次离心采用10,000转/秒,以后离心速度降为3000转/秒,以防止DNA的降解；
（6）加入高浓度（3M）的盐离子（KAC）,以去除多糖类及色素等杂质,对于野生大豆,还加入PVP或巯基乙醇,以防止酚类、醌类物质对DNA的降解；
（7）增加酚/氯仿抽提步骤,而后再用氯仿进一步抽提,以除去杂质和多余的酚；
（8）加0.2μl的10μg/μlRNaseA,在4℃下过夜,以除去RNA,并进一步抽提,防止RNA对酶切的影响。
本研究单粒野生大豆提取的DNA量约为3-20μg,单粒栽培大豆提取的DNA量约为10-200μg,而一次预扩增仅需DNA100ng左右,所以完全满足测定所需。
与叶片提取方法相比较,直接从种子中提取DNA,不需发芽、光照培养、液氮研磨等过程,可以提高种子的检验效率。
银染法和同位素法检测的总带数相近,但同位素法多态性条带、多态性百分率较高,而银染法平均遗传多样度（H'av）和有效等位基因的数目和略高于同位素法。
鉴于银染法结果与同位素基本相似,可以避免放射性同位素使用,而且经济快速,因而银染法AFLP是可以广泛应用的。
不同的酶切组合和引物组合,扩增结果不相同,本实验通过比较不同酶切组合,发现EcoR-Mse酶切时较容易找到多态性引物组合,而且具有较高的多态性。
本研究还证实“3+3”引物组合用于大豆AFLP分析较为理想,同时找到了多对理想的引物组合,可以用于大豆种质的指纹分析研究。
通常AFLP检测需要使用放射性同位素标记,而且,一般认为,同位素法比银染法更灵敏,尤其使用33P标记效果较好[14]。
本研究证实,用同位素33P检测所得到的带型上下较为均匀,分辨率较高;银染法带型较粗,对不同分子量的条带染色深浅不甚一致,容易出现分辨率上高下低的情况,因而需要更多的技巧。
本研究通过比较还证实,银染法与同位素法除在一些弱带判别上有一定出入外,所得到的带型基本一致。
在实际应用中,不同方法的检测效率是与研究者所掌握的技术水平和熟练程度紧密联系的。
只要充分掌握各个技术环节,银染法可以在避免放射性污染、降低成本的同时,同样得到分辨率较高的指纹图谱。
——田清震，盖钧镒，喻德跃，大豆DNA扩增片段长度多态性（AFLP）研究，大 豆 科 学，2000,19（3）：
210-217
摘要:
利用大豆栽培品种科丰1号和南农1138-2杂交得到的重组近交系ＮＪＲＩＫＹ,通过ＲＦＬＰ、ＳＳＲ、ＲＡＰＤ和ＡＦＬＰ4种分子标记的遗传连锁分析,构建了包含24个连锁群、由792个遗传标记组成的大豆较高密度连锁图谱,该图谱覆盖2320.7ｃＭ,平均图距2.9ｃＭ。
ＳＳＲ标记的多态性较高,在基因组中的位置相对稳定,可以作为锚定标记,有利于连锁群的归并和不同图谱的比较整合;而ＡＦＬＰ标记对于增加图谱密度效率较高,但其容易出现聚集现象,从而造成连锁群上有很大的空隙（ｇａｐ）。
另外,在连锁群中有21.7%的分子标记出现偏分离。
该图谱为基因定位、比较基因组学和重要农艺性状的ＱＴＬ定位等研究打下了基础。
分子标记连锁图为进行植物基因组的结构分析和比较提供了有力的工具。
较高密度的分子图谱已有效地应用于数量性状基因定位（ＱＴＬ）、图位克隆基因、比较基因组学研究和分子标记辅助育种等研究中。
因此,对于具有重要经济价值并得到广泛研究的大豆作物来说,发展一张高密度的遗传连锁图将具有重大意义。
遗传作图中最常用的分子标记有ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ和ＡＦＬＰ标记。
然而,对大豆而言,ＲＦＬＰ有两个缺点:
一是ＲＦＬＰ的多态性程度不高,二是大豆的大多数ＲＦＬＰ标记为多个位点。
ＲＡＰＤ标记虽然过程简单,但多态性低且重复性较差。
微卫星标记（ＳＳＲ）多样性高而位点基本单一稳定,所以利用ＳＳＲ标记作为锚定标记,则有助于图谱的连锁群或染色体的归并和不同连锁群的整合。
ＡＦＬＰ技术结合了ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ的特点,在一次ＰＣＲ反应中能同时检测多个遗传位点,在大豆中平均一个泳道有50～120条带,信息量非常丰富,并且ＡＦＬＰ标记能够填补其他标记之间的空隙。
所以适合用于构建饱和的分子遗传图谱研究。
大豆遗传图谱的发展已经有了10多年的历史。
1988年Ａｐｕｙａ等首次用ＲＦＬＰ标记构建大豆遗传图谱,但是此图谱的ＲＦＬＰ标记仅为11个,组成4个连锁群[1]。
随后,Ｋｅｉｍ等用Ｇ.ｍａｘ×Ｇ.ｓｏｊａ种间杂交作为构图群体,构建了一个ＲＦＬＰ图谱,包括由130个ＲＦＬＰ标记组成的26个连锁群,覆盖大豆基因组1200ｃＭ[2]。
Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ和Ｓｐｅｃｈｔ将来源于不同群体的各种标记整合到一张连锁图谱上[3]。
他们用栽培大豆Ｃｌａｒｋ×Ｈａｒｏｓｏｙ杂交的近等基因系再杂交的Ｆ2代群体构建了含有13个经典标记、7个同工酶标记、110个ＲＦＬＰ标记和8个ＲＡＰＤ标记的遗传图谱。
通过使用一套锚定的ＲＦＬＰ探针,根据这些ＲＦＬＰ位点在Ｃｌａｒｋ×Ｈａｒｏｓｏｙ和Ｇ.ｍａｘ×Ｇ.ｓｏｊａ作图群体中的分离情况,确定分子标记和经典标记图谱间的连锁群同源性。
后来Ｋｅｉｍ等利用ＢＳＲ101×ＰＩ437.654构建的含有300个单株的ＲＩＬ群体,构建了饱和度较高的遗传图谱,该连锁图谱含有28个连锁群,长度为3441ｃＭ,共有165个ＲＦＬＰ标记、25个ＲＡＰＤ标记和650个ＡＦＬＰ标记。
尽管ＡＦＬＰ经常成簇排列,相对于其他分子标记,ＡＦＬＰ更均匀地分布在所有连锁群中[4]。
Ｃｒｅｇａｎ等将606个单一位点的ＳＳＲ标记整合到连锁图谱上,这套ＳＳＲ标记作为锚定标记,将3个不同群体的连锁图谱整合为一个公共图谱[5]。
该图谱包括1423个不同类型的分子标记,其中有606个ＳＳＲ标记、689个ＲＦＬＰ标记、79个ＲＡＰＤ标记、11个ＡＦＬＰ标记、10个同工酶标记和26个经典标记。
由于ＳＳＲ标记是单一位点,不仅增加了遗传图谱中分子标记的数目,同时根据不同图谱上的公共的ＳＳＲ标记,使连锁群数目减少到20个,这与大豆染色体数目相吻合。
如今在所有图谱上共检测出2950个位点。
3.1 图谱构建
构建高密度遗传图谱是大豆基因组研究的重要内容之一。
Ｃｒｅｇａｎ等[5]应用606个ＳＳＲ标记补充已构建的3张图谱使其所包含的单一位点的总数达到1423个,包括606个ＳＳＲ,689个ＲＦＬＰ,79个ＲＡＰＤ,11个ＡＦＬＰ,10个同工酶和26个经典性状标记,建立20个保守连锁群,但仍有几个小连锁群（ＹＩＳＵ,ＣＨ54,ＣＨ24）不能整合进去。
我们在构建高密度大豆遗传图谱时,主要借助于ＳＳＲ标记进行锚定连锁群,利用ＡＦＬＰ标记加密图谱。
ＳＳＲ标记由于其优点是可以用来进行连锁群的锚定,使图谱间的比较易于进行。
虽然ＡＦＬＰ构建遗传图谱的效率比较高,但是由于ＡＦＬＰ平均每对引物在两个亲本间可以检测到65条带,平均可产生10.6条多态带,在进行不同图谱比较或者用于筛选分子标记时,应用起来比较不便。
最近,由于ＡＦＬＰ分析软件的出现和配套技术的完善已经可以做到在1周的时间内,对70000条ＡＦＬＰ带进行基因型分析[12]。
如果将不同的群体的亲本同时进行标定,这样可以准确地将信息量非常大的ＡＦＬＰ整合到公共连锁图谱上,这对于建立高密度的公共连锁图谱是非常有益的,也有利于基因的精细定位。
目前番茄和大麦等作物的整合的ＡＦＬＰ图谱密度已经低于1ｃＭ[13,14]。
本研究构建的大豆分子遗传图谱有24个连锁群,共计792个标记,是国内最为致密的图谱。
目前大豆遗传图谱构建的缺憾是还没有将大豆的连锁群与对应的染色体联系起来。
这主要是因为大豆的基因组是复杂的古四倍体起源。
大豆多基因家族含有两个独立亚组的发现也证明了这一点[15]。
不过随着大豆全套（20个）初级三体的应用,这20个连锁群与大豆20条染色体的对应关系将很快能够确定。
3.2 偏分离现象
偏分离现象普遍存在[17]。
高密度分子连锁图谱的构建,为在整个基因组中调查表现偏分离的位点提供了可能[18]。
有人认为由于遗传搭车效应,与影响偏分离的遗传因子紧密连锁的分子标记则表现有严重偏分离[16]。
目前还有另外两种假说解释偏分离现象,一种认为是配子体选择的结果,Ｆ2群体中偏分离的比例为0∶2∶1（亲本1∶正常∶亲本2）。
另外一种观点认为是花粉选择的结果,这种模式的偏分离位点在群体中以0∶1∶1的比例分离[13]。
张德水等[6]利用栽培品种（Ｇ.ｍａｘ）长农4和半野生种（Ｇ.ｓｏｊａ）新民6的Ｆ2代群体以及刘峰等[7]利用同一对亲本的ＲＩＬ群体进行了大豆分子图谱构建和基因组分析,研究表明绝大多数偏分离标记都偏向于栽培品种长农4,雄配子体选择是ＲＦＬＰ标记偏分离的主要影响因素。
在本研究中,虽然偏分离的标记数高达21.7%,但没有发现明显偏向于某一亲本的趋势。
这里的偏分离可能主要与遗传搭车效应有关,当然也不排除个别配子体选择现象。
3.3标记聚集（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）和标记空隙（Ｇａｐｓ）
构建遗传图谱都期望标记间距尽可能小,并且标记在基因组上应均匀分布。
但是,我们构建的连锁图谱上的分子标记,在每个连锁群上的分布并不是均匀的,很多ＡＦＬＰ标记聚集在一起,形成1～2个集聚区,相应地增加了聚集区以外的标记间距,从而形成比较大的空隙区域（ｇａｐ）。
分子标记的聚集现象在番茄[13]、大麦[14]、玉米[19]、甜菜[20]、马铃薯[21]和大豆[4]等作物中都有报道。
据推测在番茄、大麦和玉米上ＥｃｏＲⅠ+ＭｓｅⅠＡＦＬＰ标记的聚集区域是着丝点附近的异染色质区,但是在大豆、甜菜和马铃薯上还不能肯定这种聚集区是在异染色质区。
Ｓｈｅｒｍａｎ和Ｓｔａｃｋ[22]发现异染色质区的联会丝复合体上的重组节频率比常染色质的低。
Ｈａａｎｓｔｒａ等[13]发现番茄图谱上ＥｃｏＲⅠ+ＭｓｅⅠＡＦＬＰ标记在聚集区中的比例与异染色质区中的ＤＮＡ比例（77%）是一致的。
在我们构建的连锁图谱上,69%的ＡＦＬＰ标记存在于聚集区中。
ＥｃｏＲⅠ+ＭｓｅⅠＡＦＬＰ标记的聚集现象可能与异染色质区重组率低有关。
所以利用对甲基化敏感的限制性内切酶ＰｓｔⅠ代替ＥｃｏＲⅠ,可以在非甲基化的常染色质区识别酶切位点,而不是在异染色质区。
这样虽然ＰｓｔⅠ+ＭｓｅⅠＡＦＬＰ标记虽然少,但是要比ＥｃｏＲⅠ+ＭｓｅⅠＡＦＬＰ标记分布均匀,ＰｓｔⅠ+ＭｓｅⅠＡＦＬＰ标记在水稻ＤＨ群体中分布比较均匀[23]。
因此,要根据不同研究目的选择ＡＦＬＰ的限制性内切酶。
在大多数研究中,特别是ＱＴＬ定位,ＰｓｔⅠ+ＭｓｅⅠＡＦＬＰ标记更合适。
但是这种标记系统往往受基因型和植株发育的影响,因为基因组ＤＮＡ甲基化程度随着基因型和植株发育状态不同而变化。
在基因精细定位和图位克隆基因时,要根据基因处于异染色质区还是常染色质区,来选择合适的ＡＦＬＰ标记。
例如番茄抗病基因Ｃｆ9位于常染色质区,精细定位采用ＰｓｔⅠ+ＭｓｅⅠＡＦＬＰ标记[24]。
而位于异染色质区的番茄抗病基因Ｍｉ图位克隆采用了ＥｃｏＲⅠ+ＭｓｅⅠＡＦＬＰ标记[25]。
在Ｃｒｅｇａｎ等[5]构建的大豆图谱上,也发现了若干ＲＦＬＰ标记和ＳＳＲ标记的密集区,如:
Ｇ.ｍａｘ×Ｇ.ｓｏｊａ图谱中的Ｄ1ａ连锁群,上部16个标记中,13个为ＲＡＰＤ标记,相邻的有11个和18个ＳＳＲ标记组成的两个密集区,中间被8个标记（其中包括7个ＲＦＬＰ标记）隔开。
由于ＲＦＬＰ标记均来自ＰｓｔⅠ基因组克隆,因为ＰｓｔⅠ是对甲基化敏感的内切酶,这些克隆大多为单拷贝或低拷贝,可能并不是随机分布于整个基因组中,因此他们推测,标记密集区很有可能与ＲＦＬＰ位点而不是ＳＳＲ位点有关。
在本图谱中有些连锁群仍存在分子标记分布不均匀现象,甚至有的存在大于20ｃＭ的空隙。
这主要与图谱上的大多数ＡＦＬＰ标记聚集现象有关。
另外,也可能是因为所用亲本之间在某些染色体区段缺乏多态性,某些染色体结构发生了大的变异,导致在这一段染色体上分子标记不能用连锁规律定位。
Ｃｒｅｇａｎ等[5]在构建高密度大豆遗传图谱时也遇到同样的问题,为了在空隙间找到ＳＳＲ标记,他们利用空隙两边的ＲＦＬＰ作探针,筛选ＢＡＣ库,但是在空隙间很难找到合适的标记。
因此发展来源于不同杂交组合的作图群体,以及发展包括微卫星标记,ＲＡＰＤ标记,ＡＦＬＰ标记等新型分子标记都是填补图谱中的缺口,构建覆盖整个基因组的遗传图谱的有效手段。
3.4 基因定位
构建高密度的遗传图谱和筛选与基因紧密连锁的分子标记是图位克隆基因的前提。
大豆Ｆ连锁群上含有多个抗性基因,如抗花叶病毒病基因Ｒｓｖ1、抗花生斑点病基因Ｒｐｖ1和抗蚜虫根腐病基因Ｒｐｓ3[26],最近又报道大豆抗细菌枯病基因Ｒｐｇ1也定位在这个区域[5]。
因此,大豆Ｆ连锁群的构建和抗性基因密集区的精细作图对于图位克隆抗性基因将具有重要意义。
另外,我们将抗大豆花叶病毒基因的ＳＣＡＲ标记定位在Ｊ连锁群、控制花色的基因Ｗ和绒毛有无基因ＲＭ定位于Ｆ1连锁群。
抗花叶病毒基因和定位正在进行中。
——吴晓雷，贺超英，王永军等，大豆遗传图谱的构建和分析，遗传学报，2001，28（11）:
1051～1061
——王晓丹，吕慧颖，张敬等，以PCR为目的的大豆叶片DNA提取方法的比较研究，分子植物育种，2004,2（6）：
891-894
PCR反应的性质决定其对模板DNA的纯度要求不十分严格。
因此,许多实验室发展了适合于不同作物的模板DNA快速分离法[1-。
用叶盘PCR法筛选转化体,省去不必要的报告基因序列,以减少有害的变异,是植物转化实用化的发展趋势[4。
我们用花粉管通道法进行大豆基因转移获得了大量待筛选的种子,用特异引物通过PCR技术初步筛选转化体,具有简便、快速、经济等优点。
但由于样品数量大,模板DNA的分离成了决定筛选效率的关键环节。
尤其是如何解决大批量小样品的研磨问题至关重要。
经过反复探索,用自动螺钉旋具改制成微量样品研磨器,在1.5ml的微量离心管内研样,解决了大豆鲜组织的大批量小样品的无损耗快速研磨问题,并简化了DNA提取的程序,收到了很好的效果。
本文报道具体的操作程序和结果。
1.微量样品研磨器的改制
用中国机械进出口总公司生产的自动螺丝批（螺旋棘轮螺钉旋具）改制微量样品研磨器。
将产品配带的三个十字花形的转头在砂轮上磨一下,使之与微量离心管的下部形状（圆锥形）相吻合。
2.样品的制备
取单株收获的大豆种子,每株4-5粒,放入50ml离心管内发芽（将离心管挤牢在饭盒等容器内,每次可处理数十份）,28℃两到三天。
取下胚轴和胚根0.1-0.2g（或生长在大田的大豆幼苗的未展开叶0.1-0.2g）放入1.5ml微量离心管内,将离心管放入液氮中
冻几秒钟后置工作台上,将微量研样器的转头放入离心管并迅速按动手柄数次。
样品研好后将转头取出,用镊子或硬毛刷剔出转头沟槽中的样品,用蒸馏水涮洗两次,然后用干净纱布擦净转头（或更换转头）可进行下一个样品的操作。
研好的样品放入冰中或-20℃备用。
3.提取缓冲液成分
试验采用两种提取缓冲液:
SDS:
100mMTris-HCl（pH8.0）,500mMNaCl,50mMEDTA,1.25%SDS。
CTAB:
1.0%WVCTAB,0.7MNaCl,10mMEDTA,50mMTris-HCl（pH8.0）,0.1%巯基乙醇。
4.DNA提取程序
a.每管加入500ul在65℃水浴中预热的SDS提取缓冲液,混匀;
b.放入65-80℃水浴中,颠倒离心管数次,放出管内冷气,保温5-20分钟;
c.每管加入150ul5MKAC,混匀,冰浴10分钟并不断混匀;
d.4℃,10000RPM,离心10分钟;
e.将上清移入另一离心管内,加入等体积的氯仿异戊醇（24:
1）,快速颠倒离心管直至形成乳状液不再很快分层;
f.4℃,8000RPM离心5分钟;
g.小心将上清移入另一离心管中,加入2倍体积的冷乙醇,混匀,放置5-10分钟;
h.4℃,10000RPM离心10分钟;
i倒掉上清,用70%乙醇洗管壁和沉淀两次,将离心管倒置在纸巾上,干燥20-30分钟;
j.每管加入200ulTE缓冲液溶解沉淀。
1 微量样品研磨器的效果
中国机械进出口总公司出品的螺旋棘轮螺钉旋具的转头的直径和长度与1.5ml的离心管最为匹配,用其改制的微量样品研磨器效果最好。
快速按动手柄,转头的转速可达300RPM左右,转头上的十字沟槽与离心管壁形成较大研磨力,使经液氮冷冻的样品很容易被研碎。
研磨一个样品只需0.5-1分钟。
大豆下胚轴经液氮冷冻后较硬,如用国产离心管容易破裂,需用进口离心管进行研磨。
叶片、幼苗等不太硬的样品可用国产离心管,以降低成本。
本文的大豆模板DNA分离程序,只用氯仿异戊醇抽提一次,并且提取时间可缩短到5分钟,是目前最简单、快速的方法。
用该程序每天可处理近百个样品（取决于离心机转头的孔数）。
程序中两个关键步骤是:
①氯仿抽提时应反复颠倒离心管（30秒钟以上）直至停止时形成的乳浊液不很快分层;②最后一步DNA溶解时,体积不能太小（100-200ul）。
体积太小,溶解困难,并影响PCR扩增的效果。
我们用0.1-0.2g的样品量,最后溶解体积为200ul,再稀释10-50倍用作模板,PCR扩增的效果很好。
——周思君，小样品大批量大豆模板DNA快速分离法，大豆科学，1999，18（4）：
318-321
应用从6000多份大豆种质资源中筛选出的21个抗大豆花叶病毒病的品种或品系及7个感病的品种或品系,选用20个随机引物,对总DNA进行了随机扩增。
有18个引物扩增得到了稳定的RAPD图谱,OPH-06和OPH-10未能扩增到RAPD产物。
扩增出的片段分子量在0.6-4.6Kb之间。
随机引物扩增出的条带数在5-17条之间,共扩增出165个条带,品种间相同的条带有104个,多态性条带有61个,多态性条带占37%。
这20个引物可分为1无扩增产物的引物;2扩增产物无多态性的引物;3扩增产物多态性低于15%的引物;4扩增产物多态性在15%-30%之间的引物;5扩增产物多态性在30%-50%之间的引物;6扩增产物多态性超过50%的引物。
依据遗传距离进行聚类分析的结果表明,这些材料可以明确地聚成5组。
各组内姊妹系衍生出的品种或品系首先聚在了一起,其次有一定血缘关系的聚在了亚组里。
另外,各组内或亚组内的品种或品系在地理分布上具有一定相关性。
3RAPD反应
20个10-mer随机引物购自Operon公司,所用引物的编号为OPH-01-OPH-20,其碱基序列参见Operon10-merkits′productinformation。
所用随机引物的G+C含量为60-70%。
扩增反应在25μl体积中进行,其中模板DNA2μl（5ng/μl）,随机引物2μl（50μmol/L）,2.5mMdNTPs2μl,10xbuffer2.5μl,TaqDNA聚合酶1u,超纯水16.5μl,上面覆盖20-30μl液体石蜡。
热循环条件为:
94℃变性1分钟,35℃退火2分钟,72℃延伸2分钟,5个循环。
接着94℃0.5分钟,35℃1分钟,72℃1.5分钟,40个循环,然后72℃延伸10分钟。
扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶,1×TAE缓冲
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