精仪器分析实验讲义.docx

精仪器分析实验讲义.docx

《精仪器分析实验讲义.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《精仪器分析实验讲义.docx（20页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

精仪器分析实验讲义

实验一722型分光光度计的性能检测

一、目的

1、学会使用分光光度计

2、掌握分光光度计的性能检验方法

二、提要

1、分光光度计的性能好坏，直接影响到测定结果的准确性，因此新购仪器及使用一定时间后，均需进行检验调整。

2、利用KMnO4溶液的最大吸收峰值来检验波长的精度。

3、用同种厚度的比色皿，由于材料及工艺等原因，往往造成透光率的不一致，从而影响测定结果，故在使用时须加以选择配对。

三、仪器与试剂

1、722型分光光度计；

2、小烧杯；

3、坐标纸；

4、滴管；

5、擦镜纸；

6、KMnO4溶液；

四、操作步骤

1、吸收池透光率的检查（测定透光率）

吸收池透光面玻璃应无色透明，并应无水、干燥。

检查方法如下：

以空气的透光率为100%，则比色皿的透光率应不低于84%，同时在450nm、650nm处测其透光率，各透吸收池透光率差值应小于5%。

2、吸收池的配对性（测定透光率）

同种厚度的吸收池之间，透光率误差应小于0.5%。

检查方法如下：

将蒸馏水分别注入厚度相同的几个吸收池中。

以其中任一个比色皿的溶液做空白，在440nm波长处分别测定其它各比色皿中溶液的透光率，然后选择相差小于0.5%的吸收池使用。

3、重现性（光度重复性）（测定透光率）

仪器在同一工作条件下，用同种溶液连续测定7次，其透光率最大读数与最小读数之差

（极差）应小于0.5%。

检查方法如下：

以蒸馏水的透光率为100%，用同一KMnO4溶液连续测定7次，求出极差，如小于0.5%，则符合要求。

4、波长精度的检查（测定A）

为了检查分光系统的质量，可用KMnO4溶液的最大吸收波长525nm为标准，在待检查仪器上测绘KMnO4溶液的吸收曲线。

检查方法如下：

取3.0×10-5mol/L的KMnO4溶液，以蒸馏水为空白，在460nm~580nm范围内，分别测定460、480、500、510、520、522、524、525、526、528、530、540、550、560、570、580nm波长处的吸光度，在坐标纸上绘出吸收曲线。

若测得的最大吸收波长在

525±10nm以内，说明该仪器符合要求。

五、数据处理

1、吸收池透光率的检查

波长（nm）

1

2

3

4

450

650

2、吸收池的配对性

波长（nm）

1

2

3

4

440

3、仪器重现性考察

波长（nm）

1

2

3

4

5

6

7

525

计算极值：

波长（nm）

460

480

500

510

520

522

524

525

吸光度A

波长（nm）

526

528

530

540

550

560

570

580

吸光度A

4、波长精度检查

以吸收波长为横坐标，吸收度A为纵坐标绘制吸收曲线。

六、思考题

1、在本实验中共用了几种空白溶液，分别是什么？

2、使用722或721型分光光度计时，应注意哪些问题？

1）仪器预热时应将光闸门处于关的位置，可避免光电倍增管照光，延长光电倍增管的使用寿命。

2）如果大幅度改变测试波长时，需要等数分钟，才能正常工作。

因波长大幅移动时，光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢。

3）每台仪器上所配套的吸收池不能与其他仪器上的吸收池单个调换。

4）吸收池每次使用完毕后，应立即用蒸馏水洗净，用吸水纸擦干，存于吸收池盒内。

3、同种比色皿透光率的差异对测定有什么影响？

4、检查分光光度计的波长精度及重现性对测定有什么实际意义？

实验二药物中微量铁的测定

一、目的

1、掌握使用分光光度计

2、了解分光光度法测定药物及水中铁含量的操作方法及原理。

3、学会用工作曲线法测定样品含量。

二、提要

铁是药物和水中常见的一种杂质，含量大时易产生特殊气味，因此对药物和水中的铁要进行检查和测定。

亚铁离子与邻二氮菲生成稳定的橙红色配合物。

应用此反应可测定铁，当铁以Fe3+离子形式存在于溶液中时，可预先用还原剂盐酸羟胺将其还原为Fe2+离子。

2Fe3++2NH2OH·HCl→2Fe2++N2↑+2H2O+4H++2Cl-

显色时溶液PH值应在2~9，若酸度过高（PH﹤2）显色缓慢而色浅；若酸度过低，二价铁离子易水解。

最大吸收波长为508nm，ε=11100。

三、仪器与试剂

722型分光光度计；容量瓶25ml8只；吸量管1ml，2ml，5ml，10ml各1只；吸收池、擦镜纸；洗耳球；小烧杯；万分之一天平；标准铁溶液（10µg.ml-1）；邻二氮菲水溶液

（0.075%）；盐酸羟胺5%水溶液（用时配制）；NaAc（0.5mol·L-1）；HCl（6mol·L-1）。

四、操作步骤

1、标准曲线的制作

在6只25ml容量瓶中，用吸量管分别加入0.0，1.0，3.0，5.0，7.0，9.0ml铁标准液

（10µg·ml-1），分别精密加入1ml盐酸羟胺，5mlNaAc溶液，2ml邻二氮菲，用水稀释至刻度后摇匀，放置10分钟。

用1cm比色皿，以试剂为空白（即0.0ml铁标液），在508nm波长下，测量各溶液的吸光度。

以铁含量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

2、待测样测定

准确吸取待测样5.00ml，置25ml容量瓶中。

按上述制备标准曲线的方法配制溶液并测定吸光度，根据测得的吸光度求出水中总铁量。

据水样测得的吸光度计算水中铁含量。

25ml容量瓶

1（空白）

2

3

4

5

6

7（样品）

铁标准溶液

0.0

1.0

3.0

5.0

7.0

9.0

样品液5.0mL

盐酸羟胺

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

醋酸钠

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

邻二氮菲

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

用蒸馏水稀释至刻度摇匀，静置10min

A（508nm）

以铁含量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，并根据测得样品的吸光度，计算水中总铁量。

A0.4

01030507090（μg/25mL）

C未=X/5=Yμg/ml

四、注意事项

1、测定时由低浓度至高浓度方向测定，可以直接省略蒸馏水润洗过程

2、吸收池中装样高度：

至2/3处即可。

五、思考题

1、本实验中采用的空白溶液为什么?

2、显色反应操作中，加入各标准溶液与样品的含酸量不同，对显色有无影响？

3、根据制备标准曲线测得的数据，判断本次实验所得浓度与吸光度间的线性好不好。

分析其原因。

实验三、四紫外吸收曲线和工作曲线的测绘及含量测定

一、目的

1、掌握紫外-可见分光光度计的使用。

2、掌握吸收曲线的绘制方法。

3、学会从吸收曲线找到最大吸收波长。

4、掌握标准曲线的绘制方法及应用。

5、学会用紫外-可见分光度计测定中药有效成分的含量。

二、仪器与试剂

美谱达可见-紫外分光光度计；容量瓶10ml6只（棕色瓶1只）；吸量管1ml，2ml，5ml

各1只；吸收池、擦镜纸；洗耳球；小烧杯，滴管；95%乙醇；橙皮苷标准液10μg/ml；待

测陈皮母液浓度为60μg/ml。

三、操作步骤

1、配制溶液

分别精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml标准溶液至10ml容量瓶，用95%乙醇定容，摇匀备用。

2、吸收曲线的测绘（目的：

找出最大吸收波长）

在系统主菜单中选择“光谱扫描”项进行吸收曲线的测绘。

1）基线的建立：

取空白溶液（95%乙醇）分别盛装于比色皿后，分别放置在仪器比色架参比池以及样品池位置上。

按照仪器使用方法进行操作，完成一系列设定[扫描设置（起点、终点、间隔、速度）、测定模式（吸光度模式）、Y轴坐标]后，点击100T/0Abs，建立一条系统基线。

2）测定吸收曲线：

将3号橙皮苷标准液放置于样品池位置，点击START/STOP，进行测量。

测得吸收曲线后，点击检索，用方向键（上下移动键）查看波峰的波长，记录最大吸收波长（278nm左右）。

3、工作曲线的测绘

在系统主菜单中选择“定量测量”项进行工作曲线的测绘。

1）基线的建立：

取空白溶液（95%乙醇）分别盛装于比色皿后，分别放置在仪器比色架参比池及样品池位置上。

按照仪器使用方法进行操作，完成一系列设定（最大吸收波长、浓度单位、各标样浓度）后，点击100T/0Abs，机器自动调整到曲线测定波长，并调零。

2）测定工作曲线：

将样品按顺序依次放入光路中，点击START/STOP，测得吸光度。

测量完成后，点击ESC返回标准曲线设定界面。

在最下方可见到系统给出的曲线方程及方程相关系数。

点击曲线查看标准曲线。

4、待测液测定（求出橙皮苷的百分含量）

点击ESC返回定量测量界面，开始测量未知样品浓度。

机器根据测得的吸光度，运用公式，自动计算出浓度。

四、数据处理

1、吸收曲线测绘结果

C=μg/mL；A=；λmax=nm2、工作曲线测绘结果

浓度（μg/mL）

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

吸收度（A）

回归方程：

相关系数：

3、待测液测定结果Cx=μg/mL；A=

4、陈皮中橙皮苷百分含量计算

橙皮苷%=Cx/C陈皮⨯100%=Cx/C陈皮⨯100%=

五、思考题

如何应用UV-Vis分光光度法完成中药有效成分的含量测定？

实验五柱色谱法分离净化生物碱

一、目的

1、掌握色谱柱的制备方法。

2、熟悉用柱色谱分离净化生物碱的过程和方法。

二、提要

氧化铝是一种吸附力较强的吸附剂，具有分离能力强、活性可以控制等优点。

根据氧化铝的的特点，采用95%乙醇作为流动相可以起到分离净化生物碱的目的。

三、仪器与试剂

色谱柱（长15cm，内径1.3cm）2根；带橡皮套的玻璃棒2根；50ml量筒1个；精制棉及圆形滤纸；剪刀；磨口三角瓶30ml2个；25ml容量瓶2个；铁架台，蝴蝶夹；黄连；95%乙醇；氧化铝。

四、操作步骤

1、色谱柱的制备

准备2根洁净干燥的高15cm、内径1.3cm的色谱管，于管底垫一层精制棉（不要太紧），垂直夹在滴定台上，然后把待测氧化铝通过一干燥小漏斗，仔细装入色谱管中至高达约6cm处（约6g），用一带橡皮套的玻璃棒轻轻地均匀地敲打只氧化铝的高度达约5cm处，然后在其表面覆以圆形滤纸一层即得。

2、黄连提取液的配制方法

取10g黄连（粉碎），加95%乙醇没过药材，回流15分钟，滤过，滤液补加乙醇定量到50mL容量瓶中。

3、盐酸小檗碱类生物碱的分离净化

打开活塞，于色谱柱中加入黄连提取液1ml，待溶液全部通过后，立即以95%乙醇20ml淋洗色谱柱，控制流速为20～30滴/min。

流出液收集于25ml量瓶中，最后稀释至刻度。

观察和记录色谱柱中溶液的颜色。

五、注意事项

1、精制棉用量要少，要平整，但不要塞得太紧，以免流速过慢。

2、色谱柱必须具有均匀的紧密度，表面应力求水平，样品应小心地加入，勿使氧化铝表面受到扰动。

实验六铺板

硅胶Ｇ薄层板的制备

称取硅胶Ｇ1.5g、蒸馏水4.5ml，在研钵中沿同一方向研磨混匀，去除表面的气泡后，立即倒在玻璃板上，用研钵研头稍加涂匀，然后用左手持玻璃板，用右手中指在背面轻轻敲击玻璃板，使铺成平坦均匀的薄板。

于室温下，置水平台上晾干，于110℃烘30分钟，冷却后即使用或放入干燥器备用。

同学们下次实验请带尺子和铅笔！

！

七生物碱的薄层色谱鉴定

一、目的

1、掌握薄层硬板的制备方法。

2、掌握薄层色谱的一般操作方法。

3、了解薄层色谱在中药分析中的应用。

二、提要

奎宁、辛可宁属于生物碱类成分，利用薄层色谱可将二者分离，用对照品加以对照，可起到鉴别奎宁、辛可宁的作用。

三、仪器与试剂

层析缸；玻璃板5×15cm；点样毛细管2µl；研钵；喷雾瓶50ml，皮老虎；电吹风；台秤；量筒10ml；烘箱；磨口小三角瓶；硅胶G（薄层层析用）；奎宁，辛可宁对照品；氯仿；乙酸乙酯：

无水乙醇：

二乙胺（7：

1：

1）；改良碘化铋钾试液。

四、操作步骤

1、点样

一般用点样器或定量毛细管点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.0~1.5cm，点样直径一般不大于2mm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。

点样时必须注意勿损伤薄层表面。

分别取奎宁和辛可宁对照品，分别加氯仿制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。

另取吸取奎宁和辛可宁对照品溶液混合，作为供试品溶液，吸取上述三种溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上。

2、展开

点好样的薄层板放入装有展开剂的展开缸中，乙酸乙酯：

无水乙醇：

二乙胺（7：

1：

1）为展开剂，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密封，待展开至规定距离，一般为8~15cm，取出薄层板，用电吹风吹干（吹背面）。

展开缸如需预先用展开剂预平衡，可在缸中加入适量的展开剂，必要时并在壁上贴两条与缸一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，盖严，使展开缸平衡或按规定操作。

3、显色

在薄层板上喷以改良碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

4、定性

分别测定Rf值，鉴别待测样品，是奎宁还是辛可宁。

五、思考题

1、影响吸附薄层色谱Rf值的因素有哪些？

2、薄层板的主要显色方法有哪些？

实验八中药黄连的测定

一、目的

1、了解薄层色谱在中药分析中的应用。

2、了解薄层色谱的原理及应用。

二、提要

中药黄连中的主要成分为盐酸小檗碱，使用对照药材和对照品进行对照，可起到鉴别黄连的作用。

三、仪器与试剂

层析缸；玻璃板5×15cm；毛细管；研钵；喷雾瓶50ml；电吹风；天平（0.1mg）；水浴锅，冷凝器；离心管，离心管架；黄连药材；盐酸小檗碱对照品；乙酸乙酯：

氯仿：

甲醇：

氨水：

二乙胺（8：

2：

2：

1：

0.5）

四、操作步骤

1、对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品,加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,即得.

2、供试品溶液的制备

取实验五中黄连过氧化铝的溶液即可。

学生留存。

3、点样

用毛细管吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，分别点于同一硅胶薄层板上,点样基线距底边1.0~1.5cm，样品直径一般不大于2mm。

4、展开

以乙酸乙酯：

氯仿：

甲醇：

氨水：

二乙胺（8：

2：

2：

1：

0.5）为展开剂，将展开剂倒入层析缸内，预平衡15~30分钟后，将点好样的薄层板放入展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密封，待展开至规定距离（8~15cm），取出，吹干。

5、检视

将吹干后的薄层板在紫外灯下看，供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

五、思考题

产生边缘效应的原因是什么?

实验九气相色谱法的定性分析

一、目的

1、练习气相色谱仪的使用。

2、学会气相色谱定性分析。

二、提要

气相色谱是一种强有力的分离手段，但在定性鉴定上则是软弱无力的，实际工作中，有时遇到的样品其成分大体上是已知的，这时得到的气相色谱图可以借助纯的标样加以对照，利用保留值进行定性，这样的定性鉴定是相当简单的。

三、仪器与试剂

气相色谱仪（FID）；1μl微量近样器（气相用）；磨口小三角瓶5个；培养皿，滤纸；

25ml容量瓶2个，10ml容量瓶3个；水杨酸甲酯；醋酸乙酯；龙脑对照品；合成冰片。

四、操作步骤

仪器条件以聚乙二醇（PEG）-20M为固定相，涂布浓度为10%，柱温110℃.理论塔板数按龙脑峰计算不低于1900。

校正因子的测定取水杨酸甲酯适量，精密称定，加醋酸乙酯制成每1ml含5mg的溶液，作为内标溶液。

另取龙脑对照品5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加内标溶液溶解，并稀释至刻度，摇匀，吸取1μl，注入气相色谱仪中，计算校正因子。

测定取合成冰片约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用内标溶液溶解并稀释至刻

度，摇匀，吸取1μl，注入气相色谱仪，测定。

将保留时间列成表格，确定混合物中各封、峰为何物。

五、注意事项

1、实验前，对色谱仪整个气路系统必须进行检漏。

如有漏气点，应进行排除。

2、为了防止热丝烧断，开机前应先通气，后通桥电流。

关机时应先关桥电流，后断气最高允许桥电流不得超过（仪器说明书）。

3、微量注射器应小心使用，用力不可过猛，芯子不可折弯，也不要全部拉出套外。

若有不清楚之处，应立即报告指导老师妥善处理，样品溶液中如有难挥发溶质，使用完毕立即使用乙醇或丙醇多次清洗，以免芯子受污而卡死。

六、思考题

1、保留时间，调整保留时间和相对保留值如何定义？

它们各自的特点和适用范围如何？

2、根据色谱原理，试推测在实验中水杨酸甲酯、乙酸乙酯、龙脑出峰的先后顺序。

3、GC法定性的原理是什么？

实验十气相色谱法的定量分析

一、目的

1、掌握气相色谱仪的使用。

2、学会内标法定量分析。

二、提要

内标法是选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中，以待测组分和对照物质的响应信号对比，测定待测组分的含量。

三、仪器与试剂

气相色谱仪（FID）；1μl微量近样器（气相用）；磨口小三角瓶5个；培养皿，滤纸；

25ml容量瓶2个，10ml容量瓶3个；水杨酸甲酯；醋酸乙酯；龙脑对照品；合成冰片。

四、操作步骤

仪器条件以聚乙二醇（PEG）-20M为固定相，涂布浓度为10%，柱温110℃.理论塔板数按龙脑峰计算不低于1900。

校正因子的测定取水杨酸甲酯适量，精密称定，加醋酸乙酯制成每1ml含5mg的溶液，作为内标溶液。

另取龙脑对照品5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加内标溶液溶解，并稀释至刻度，摇匀，吸取1μl，注入气相色谱仪中，计算校正因子。

测定取合成冰片约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取1μl，注入气相色谱仪，测定，并计算含量。

五、思考题

1、内标法的优、缺点各是什么？

2、实验中为什么选用水杨酸甲酯作为内标液？

实验十一高效液相色谱法定性分析

一、目的

1、掌握高效液相色谱仪的使用方法

2、学会应用高效液相色谱仪的定性方法

二、提要

利用高效液相色谱仪对已知组分的复方药物分析，比较方便。

本实验是采用已知物对照,即根据同一物质在同一根层析色谱柱上保留时间相同的定性分析法。

三、仪器与试样

高效液相色谱仪（紫外检测器）；微量进样器；C18反相色谱柱（HypersilODS2,250mmn×4.6mmID,5μm）；

一次性注射器，0.45µm微孔滤膜；容量瓶50ml，100ml；移液管，洗耳球；具塞三角瓶（50ml）；超声仪；天平；滤纸，培养皿；离心管，离心管架；

陈皮药材；橙皮苷对照品；

甲醇（分析纯）；甲醇（色谱纯），纯净水。

四、操作步骤

1、色谱条件

1）色谱柱：

HypersilODS2,250mmn×4.6mmID,5μm2）泵：

Waters515pump

2）流动相：

MeOH-H2O（43:

57）

3）柱温：

室温4）流速：

1mL/min

5）检测器：

Waters2487DualλAbsorbanceDetector6）检测波长：

270nm

7）进样量：

10μL

8）理论塔板数：

按橙皮苷计算不低于3000

2、实验用溶液的配制

1）橙皮苷对照品溶液的制备

精密称取橙皮苷对照品1.6mg，置100ml棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（C橙=16µg/mL）。

2）供试品溶液的制备：

取陈皮粉末（过50目筛）0.3g，精密称定，置具锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声15分钟，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，精密吸取5ml到100ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度，经0.45µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

3、定性分析

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5µl，注入液相色谱仪，供试品色谱与对照品色谱中相同的位置相比较，保留时间相同。

五、思考题

1、利用高效液相色谱仪定性的方法有几种?

分别在什么情况下适用?

2、本实验的色谱原理属于哪一类?

实验十二高效液相色谱法定量分析

一、目的

1、练习高效液相色谱仪的使用

2、学会外标法定量分析

二、提要

外标法可分为外标一点法、外标两点法及标准曲线法。

当标准曲线截距为零时，可用外标一点法定量。

在药物分析中，为了减少实验条件波动对分析结果的影响，采用随行外标一点法，即每次测定都同时进对照品与样品溶液。

三、实验条件

高效液相色谱仪（紫外检测器）；微量进样器；C18反相色谱柱（HypersilODS2,250mmn×4.6mmID,5μm）；

一次性注射器，0.45µm微孔滤膜；容量瓶50ml，100ml；移液管，洗耳球；具塞三角瓶（50ml）；超声仪；天平；滤纸，培养皿；离心管，离心管架；

陈皮药材；橙皮苷对照品；

甲醇（分析纯）；甲醇（色谱纯），纯净水。

四、操作步骤

1、色谱条件

1）色谱柱：

HypersilODS2,250mmn×4.6mmID,5μm2）泵：

Waters515pump

2）流动相：

MeOH-H2O（43:

57）

3）柱温：

室温4）流速：

1mL/min

5）检测器：

Waters2487DualλAbsorbanceDetector6）检测波长：

270nm

7）进样量：

10μL

8）理论塔板数：

按橙皮苷计算不低于3000

2、实验用溶液的配制

1）橙皮苷对照品溶液的制备

精密称取橙皮苷对照品1.6mg，置100ml棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（C橙=16µg/mL）。

2）供试品溶液的制备

取陈皮粉末（过50目筛）0.3g，精密称定，置具锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声15分钟，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，精密吸取5ml到100ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度，经0.45µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

3、测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5µl，注入液相色谱仪，测定，并计算含量。

五、数据处理

保留时间（min）

峰面积

橙皮苷对照品

陈皮中橙皮苷

外标一点法计算陈皮中橙皮苷的百分含量（保留两位有效数字）根据A供/A标=C供/C标

则C供=（A供*C标）/A标

橙皮苷%