发酵豆粕常见指标检测方法.docx

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发酵豆粕常见指标检测方法

粗蛋白含量检测

（GB/T6432）

一、原理：

凯氏法测定样中的含氮量、即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。

加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数，计算出粗蛋白含量。

二、仪器设备：

1.高速粉碎机，粉碎时间1分钟。

2.分样筛；、40目

3.分析天平；感量

4.消化炉

5.滴定管；酸式50mL

6.锥形瓶；250mL

7.定氮仪；以凯氏原理制造的半自动蛋白测定仪

三、试剂

1.硫酸：

含量98%

2.氢氧化钠：

40%水溶液（m/V）

3.硼酸：

2%水溶液（m/V）

4.混合催化剂：

硫酸铜（5个结晶水），6g硫酸钾或硫酸钠，磨碎混匀。

5.混合指示剂：

甲基红%乙醇溶液，溴甲酚绿%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。

6.L盐酸标准溶液：

mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。

标定：

减量法称取左右在270-300℃灼烧2h的无水NaCO3，加水50mL溶解，加10滴混合指示剂，用配好的盐酸滴定成暗红色，煮沸2min，冷却（水中）后再滴至暗红色，同时作空白试验（不加Na2C03）。

计算：

C=

m×1000

（V1-V2）M

式中:

C——硫代硫酸钠标准溶液之物质的量浓度（mol/L）

m——无水碳酸钠的质量，g

V1——盐酸溶液的用量，mL

V2——空白试验盐酸溶液的用量，mL

M——无水碳酸钠的摩尔质量数值，单位为克每摩尔（g/mol）〔M（1/2NaCO3）=〕

7.蔗糖

8.硫酸铵：

分析纯，干燥

四、分析步骤：

（国标推荐法）

1.试样的消煮

2.称取试（含氮量5～80mg）准确至，放入消化管中，加入混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸，于420℃消化炉中消化3小时。

冷却后，加入蒸馏水20ml，待用。

3.氨的蒸馏；

采用半自动定氮仪，将带消化液的消化管插在蒸馏装置上，以25mL硼酸为吸收液，加入2-3滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消化管中加入氢氧化钠溶液，以溶液变黑为宜，即当生成黑色的氢氧化铜时，加碱量已够。

若加碱量不足或过量，分解液呈蓝色而不显黑色，若加碱不够，需再增加氢氧化钠用量，直到分解液呈黑色为止。

蒸馏，蒸馏时间以吸收液体积达到150mL以上时为宜，降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。

4.滴定：

用L的标准盐酸溶液滴定吸收液，溶液由蓝绿色变淡紫色为终点。

5.空白测定：

称取蔗糖，代替试样，按以上分析步骤进行测定，消耗L的标准盐酸溶液的体积不得超过，消耗L的标准盐酸溶液的体积不得超过。

五、计算：

式中：

V1——滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL

V0——滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL

CHCL——盐酸标准溶液浓度，mol/L

m——试样质量，g

——每毫克当量氮的克数

——氮换算成蛋白质的平均系数

水分检测

（GB/T6435—2006）

一、适用范围：

本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和各种单一饲料中水分的测定，但用作饲料的奶制品、动物和植物油脂、矿物质除外。

二、原理：

试样在105℃烘箱内，在大气压下烘干，直至恒重，逸失的重量为水分。

三、试剂和仪器设备：

1．高速粉碎机，粉碎时间1分钟。

2．分析筛孔径（60目）。

3．分析天平感量

4．电热恒温箱（烘箱）可控制温度在105±2℃

5．称样皿玻璃或铝质,直径40mm以上,高25mm以下

6．干燥器以氯化钙或变色硅胶为干燥剂

四、试样的选取和制备：

选取具有代表性的试样，其原始样量应在1000g以上，用四分法缩减至500g，风干后粉碎至全部通过40目筛，再用四分法缩减至200g，装于密封容器中，防止试样成分的变化或变质。

如试样为多汁的鲜样，或无法粉碎时，应预先干燥处理，称取试样200～300g，在105℃烘箱中烘15min，立即降至65℃，烘干5～6h。

取出后，在室内空气中冷却4h，称重，即得风干试样。

分析步骤：

1.洁净称样皿，在103℃烘箱内烘1h，取出，在干燥器中冷却30min，称准至，再烘干30min，同样冷却，称重，直至两次重量之差小于为恒重。

2.用已恒重称样皿称取两份平行试样，每份2～（含水重以上，样品厚度4mm以下）。

准确至，不盖称样皿盖，在105℃烘箱内烘，取出，盖好称样皿盖，在干燥器中冷却30min，称重。

五、计算

水分含量（%）按下式计算：

水分（%）＝

W1－W2

×100%

W1－W0

式中：

W1——105℃烘干前试样及称样皿重，g

W2——105℃烘干后试样及称样皿重，g

W0——已恒重的称样皿重，g

粗灰分检测

（GB/T6438）

一、原理：

饲料样品在550℃灼烧后所得残渣，用质量百分率表示。

残渣中主要是氧化物、盐类等矿物质，也包括混入饲料中的砂石、土等，故称粗灰分。

二、仪器设备：

1.高速粉碎机：

粉碎时间1分钟。

2.分样筛：

孔径（60目）

3.分析天平：

感量

4.高温炉：

有高温计且可控制炉温在550±20℃

5.坩埚：

瓷质，容积50mL

6.干燥器：

用氯化钙（干燥试剂）或变色硅胶作干燥剂

三、试样的选取和制备：

选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化或变质。

四、分析步骤：

将干净坩埚放入高温炉，在550±2℃下灼烧30min。

取出，在空气中冷却约1min，放入干燥器冷却30min，称其质量。

再重复灼烧、冷却、称量，直至两次质量之差小于为恒质。

在恒质的坩埚中称取2～试料（灰分质量在以上），准确至，在电炉中碳化至无烟状态（夏季和冬季，可适当延长时间20min），于550±20℃下灼烧至灰白色，冷却到200℃。

取出，在空气中冷却约1min，放入干燥器中冷却至室温，称取质量。

五、计算：

粗灰分含量（%）按下式计算：

粗灰分（%）＝

m2－m0

×100

m1－m0

式中：

m2——为灰化后坩埚加灰分的的质量，g

m1——为坩埚加试料的质量，g

m0——为恒质空坩埚，g

所得结果应表示至%

酸溶蛋白（肽）含量的测定

（据QB/T2653-2004制定）

一、原理

大分子蛋白质和肽链较长的多肽用三氯醋酸溶液进行沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，其中包括小肽和部分α-氨基酸。

然后经离心、过滤、消化、蒸馏，测定其蛋白质含量即酸溶蛋白。

二、试剂及仪器

100ml烧杯、10ml和25ml移液管、半微量粗蛋白质测定试剂和装置、40目标准筛、15％三氯醋酸溶液（TCA溶液）、4500转/分钟的离心机、定性滤纸等。

三、试验方法

（1）准确称取样品样品，加入15%TCA溶液20ml，混合均匀，静置5分钟。

用定性滤纸过滤，取滤液约5ml，4500转/分钟离心10分钟，取上清液4ml注入干燥的消化管中，加入硫酸铜，硫酸钠3g，再加浓硫酸10ml，消化方法及蒸馏方法与蛋白的测定方法相同。

（2）计算公式：

肽绝对含量（

）

——样品中肽含量（%）

——标准盐酸摩尔/当量浓度

V1——样品消耗盐酸体积

V0——试剂空白消耗盐酸体积

m——样品重量（精确到）

N——为微量法测定粗蛋白时的稀释倍数，若全量法测定则为1

肽相对含量（%）

X0——样品中的粗蛋白含量

不良寡糖定性检测（薄层层析法）

一、原理

薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。

一般层析操作包括薄板活化、点样、展层、显色和结果分析等步骤。

二、试剂配制（注意：

须在通风橱中进行）

1、展层剂

正丁醇：

异丙醇：

乙酸：

蒸馏水=14：

10：

4（8）：

8（如有拖尾现象，可适当加大乙酸的量）

展层剂混匀后倒入展层缸。

2、显色剂

苯胺1ml，二苯胺1g，浓磷酸5ml，丙酮50ml

先将二苯胺溶于丙酮中，最后加浓磷酸。

因为二苯胺不溶于水。

显色剂避光保存，有毒，小心操作。

三、操作步骤

1、样品处理：

称取5g试样溶于40mL蒸馏水，于70℃水浴1h。

2、离心（8000rpm，20min）取上清，放入4℃冰箱保存。

3、硅胶板的活化：

将硅胶板置于烘箱中，110℃活化1h备用。

4、点样，用水苏糖、棉籽糖和蔗糖做标准（5mg/mL）。

配制方法：

称取5mg的水苏糖或棉籽糖、蔗糖，加入1mL蒸馏水。

在硅胶板底部留两厘米，用铅笔划一直线，隔开间距画上点样孔，用毛细管点样，干了再点第二次，干透后展层。

（注意：

点样时若发现上清已变浑浊，则必须重新离心。

）

6、展层：

将点好样的薄层板放入预先饱和的展层装置内，让点样一端浸入展层剂中，其深度约（切记：

样品点不能浸入展层剂中）。

当展层剂上升到离硅胶板的顶端时，停止展层，迅速吹干。

7、显色：

将显色剂喷雾，95℃烘箱显色6min。

8、拍照：

关闭闪光灯，微距拍摄。

挥发性盐基氮检测

（GB/T—2003）

一、原理：

由于酶和细菌的作用，样品腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性物质。

此类物质具有挥发性，在碱性溶液蒸出后，用标准酸溶液滴定计算含量。

二、试剂和仪器设备：

1．盐酸溶液（L）：

取测蛋白用的L盐酸溶液于1000mL溶量瓶中，加水定容至刻度。

2．氧化镁混悬液（10g/L）：

称取克氧化镁，加100mL水，振摇成混悬液。

3．指示剂：

甲基红乙醇指示剂（2g/L），次甲基蓝指示剂（1g/L）。

4．硼酸吸收液（20g/L），可用蛋白测定用的硼酸吸收液

5．半微量定氮仪

三、分析步骤：

称取10克试样（准确至）于碘量瓶中，加水，放入振荡器中振荡30分钟，再倒入离心机中离心5-10分钟。

取上清液倒入锥形瓶中。

上清液置冰箱中备用。

蒸馏滴定：

将盛有20mL吸收液及5-6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，准确吸取上述离心清液于蒸馏器反应室内，加10mL氧化镁混悬液，迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸气，进行蒸馏5分钟即停止，吸收液用盐酸标液滴定，至终点蓝紫色，同时做试剂空白试验。

四、计算：

X（mg/100g）＝

（V－V0）×14×C×10

×100

m

式中：

X—试样中挥发性盐基氮的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）

V—测定用样液消耗盐酸溶液体积，单位为毫升（mL）：

V0—试剂空白消耗盐酸溶液体积，单位为毫升（mL）：

C—盐酸标准溶液的实际浓度，单位为摩尔每升（mol/L）：

14—与盐酸标准滴定溶液﹛C（HCl）=L﹜相当的氮的质量，单位为毫克（mg）

m—试样质量，单位为克（g）。

计算结果保留三位有效数字。

蛋白溶解度检测

（GB/T19541—2004）

一、方法原理

氢氧化钾蛋白溶解度可以反映大豆粕加热过度的情况，不同加热程度的大豆粕，氢氧化钾蛋白溶解度不同。

先测定大豆粕样品在规定的条件下，可溶于氢氧化钾溶液中的粗蛋白质含量；再测定同一大豆粕样品中总的粕蛋白质含量，计算出氢氧化钾蛋白质溶解度。

二、试剂

1．%氢氧化钾溶液，相当于，pH=配成1L）

2．凯氏定氮所需的标准试剂

三、仪器

1.高速粉碎机，粉碎时间1分钟。

2.样品筛：

孔径

3.磁力搅拌器

4.离心机:

转速为2700r/min以上

四、试样的选取和制备

取具有代表性的大豆粕样品，用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过mm孔径的样品筛，充分混匀，装于密封容器中备用。

五、操作步骤

称取大豆粕试样克，精确到，置于250mL高型烧杯中，加入%KOH溶液，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，将溶液转移至离心管中，以2700转的速度离心10分钟后，小心移取上清液，放入消化管中,用测定粗蛋白的方法进行测定，将该结果除以粗蛋白结果即为蛋白溶解度。

六、计算

氢氧化钾蛋白质溶解度X,数值以质量分数表示，按下式计算

X=

W1

×100

W2

式中：

W1——大豆粕试样溶于氢氧化钾溶液中的粗蛋白质含量；%

W2——大豆粕试样总的粗蛋白质含量（以平均结果来计算）；%

计算结果表示到小数点后一位。