版生物高考大一轮复习第十单元现代生物科技专题第35讲细胞工程学案北师大版0403458.docx
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版生物高考大一轮复习第十单元现代生物科技专题第35讲细胞工程学案北师大版0403458
第35讲 细胞工程
[考纲要求] 1.植物的组织培养（Ⅱ）。
2.动物细胞培养与体细胞克隆（Ⅱ）。
3.细胞融合与单克隆抗体（Ⅱ）。
考点一 植物细胞工程
1.植物细胞工程的基本技术
（1）植物组织培养技术
①理论基础：
细胞都具有全能性。
②培养技术种类
a.植物细胞培养技术：
采用的方法主要是细胞悬浮培养。
b.原生质体的培养技术：
利用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞的细胞壁，就可以获得具有活力的原生质体。
对这些原生质体的培养是植物体细胞杂交和显微注射技术的基础。
c.花粉和花药培养技术：
在一年时间里就可以选育出稳定遗传的植株。
d.离体胚培养技术：
可以分为幼胚培养与成熟胚培养两类。
这种技术通过使用相应的培养基使离体胚正常地萌发生长，或诱导其产生愈伤组织，再分化形成完整植株。
③植物组织培养的含义：
指在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，最终诱导产生愈伤组织、丛芽或完整的植株。
（2）植物体细胞杂交技术
①含义：
是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。
②原生质体间的融合一般要利用人工诱导的方法，可以分为物理法和化学法两大类。
（3）植物细胞工程含义：
是利用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，以植物细胞为基本单位进行培养增殖或按照人们的意愿来改造细胞的某些生物学特性，从而获得细胞产品的一门综合技术。
深化拓展 植物体细胞杂交后的遗传物质分析
（1）遗传特性：
杂种植株中含有两种植物的遗传物质，故杂种植株具备两种植物的遗传特性。
（2）染色体组数
①染色体组数＝两种植物体细胞内染色体组数之和。
②植物体细胞杂交形成的杂种植株，有几个染色体组就称为几倍体。
③若一植物细胞含有2x条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb，另一植物细胞含有2y条染色体，2个染色体组，基因型为ccDd，则新植株应为异源四倍体，其体细胞中染色体数为（2x＋2y）条，4个染色体组，基因型为AabbccDd。
2.植物细胞工程的应用
（1）植物的微型快速繁殖
①含义：
利用植物的组织或器官，经过组织培养过程，可以在短时间内获得大量的植物幼苗。
②应用：
现在一些优良的观赏植物、经济林木等都已经实现利用工厂化微型繁殖来进行大规模的无性繁殖。
（2）人工种子
①含义：
是一种以植物组织培养得到的胚状体为主要材料，再在其外面包裹一层有机薄膜制作而成的颗粒体。
②成分：
人工种子的薄膜包含胚状体萌发和发育成幼苗所需的各种养分，还可以缓冲生产、贮存、运输和种植过程中的碰撞。
另外在包裹剂中一般要附加大量的植物生长调节剂、农药、抗生素和一些有益的菌种等。
（3）作物脱毒
①依据：
病毒在植株中的分布是不均一的，成熟的组织和器官中病毒含量高，幼嫩的组织和器官中病毒含量较低，生长点几乎不含病毒或病毒很少。
②应用：
目前已经有多种作物成功利用茎尖组织培养技术进行脱毒处理，使植物在产量和品质上都有了显著的提高。
（4）愈伤组织的诱变育种
①依据：
植物的愈伤组织在培养过程中一直处于分裂增生的状态，其遗传物质极易受到外界因素的影响而发生变异。
②过程：
育种学家利用植物组织先诱导出愈伤组织，然后对愈伤组织进行诱变处理，从再分化得到的植株中筛选、培育出新的品系或品种。
（5）细胞产物的工厂化生产
①依据：
植物细胞培养技术可以快速、高效地得到大量的细胞或细胞产物。
②过程：
利用组织培养方法，培养植物的某些器官或愈伤组织，筛选出高产、高合成能力和生长较快的细胞株系，继而进行大规模工业化生产。
（6）拯救濒危植物
现在科学家正在研究利用植物细胞培养技术来大量培育红豆杉细胞，希望利用这种方法来大量生产紫杉醇，从而拯救红豆杉，拯救我们的自然资源。
1.有关细胞全能性与组织培养的判断
（1）棉花根尖细胞经诱导形成幼苗能体现细胞的全能性（ √ ）
（2）植物的每个细胞在植物体内和体外都能表现出细胞的全能性（ × ）
（3）在诱导离体菊花茎段形成幼苗的过程中，不会发生细胞的增殖和分化（ × ）
（4）愈伤组织是外植体通过脱分化和再分化后形成的（ × ）
（5）经植物组织培养得到的胚状体用人工薄膜包装后可得到人工种子（ √ ）
2.有关植物体细胞杂交技术的判断
（1）利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞进行诱导融合（ × ）
（2）用纤维素酶和果胶酶水解法获得的植物原生质体失去了全能性（ × ）
（3）再生出细胞壁是原生质体融合成功的标志（ √ ）
（4）培养草莓脱毒苗所采用的主要技术是细胞杂交（ × ）
据图分析植物体细胞杂交过程
（1）植物体细胞杂交依据的生物学原理是什么？
提示 细胞膜的流动性、植物细胞的全能性。
（2）如何根据细胞膜表面荧光判断该原生质体是由番茄和马铃薯融合而成的？
提示 融合的细胞表面既有红色荧光又有绿色荧光。
（3）若番茄细胞内有m条染色体，马铃薯细胞内有n条染色体，则“番茄—马铃薯”细胞在有丝分裂后期含有多少条染色体？
提示 2（m＋n）条。
（4）若杂种细胞培育成的“番茄—马铃薯”植株为四倍体，则此杂种植株的花粉经离体培育得到的植株属于几倍体植株？
提示 单倍体植株。
命题点一 植物组织培养过程的分析
1.某兴趣小组拟用组织培养繁殖一种名贵花卉，其技术路线为“取材→消毒→愈伤组织培养→出芽→生根→移栽”。
下列有关叙述错误的是（ ）
A.消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害
B.在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞
C.出芽是细胞再分化的结果，受基因选择性表达的调控
D.生根时，培养基通常应含α－萘乙酸等生长素类调节剂
答案 B
解析 植物组织培养中消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对培养材料的伤害，A项正确；植物体细胞的杂交需先除去细胞壁得到原生质体，再在细胞融合诱导剂作用下获得染色体加倍的细胞，B项错误；细胞分化的实质是基因的选择性表达，C项正确；植物组织培养过程中，生根阶段的培养基中通常应含有生长素类调节剂，D项正确。
2.（2018·临川第一中学模拟）如图是通过植物细胞工程技术获得紫杉醇的途径，下列叙述正确的是（ ）
A.该途径依据的原理是植物细胞具有全能性
B.过程①需控制好培养基中植物激素的比例
C.经过程①细胞的形态和结构未发生变化
D.过程③需使用固体培养基，有利于细胞增殖
答案 B
解析 细胞全能性以细胞发育成个体为标志，而图中并没有形成完整植物体，A项错误；过程①是脱分化，而决定植物脱分化和再分化的关键因素是培养基中植物激素的种类和比例，因此该过程需控制好培养基中植物激素的比例，B项正确；过程①是脱分化，经该过程细胞的形态和结构发生了变化，成为高度液泡化的薄壁细胞，C项错误；过程③需使用液体培养基，有利于细胞增殖，D项错误。
植物组织培养中生长素和细胞分裂素的比值与效果
生长素/细胞分裂素的比值
作用效果
比值高时
促进根分化、抑制芽形成
比值低时
促进芽分化、抑制根形成
比值适中
促进愈伤组织形成
命题点二 植物体细胞杂交过程分析
3.“白菜—甘蓝”是用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长期短、耐热性强和易于储藏等优点。
如图是“白菜—甘蓝”的杂交过程示意图。
以下说法正确的是（ ）
A.除去细胞壁形成原生质体，可运用的酶是纤维素酶、淀粉酶和果胶酶
B.通常可诱导上述原生质体相互融合的方法是PEG和灭活的病毒诱导
C.杂种细胞形成的标志是诱导产生了新的细胞壁
D.愈伤组织形成“白菜—甘蓝”植物体必须经过脱分化和再分化两个过程
答案 C
解析 除去细胞壁的酶有纤维素酶和果胶酶；诱导植物原生质体融合不能用灭活的病毒；杂种细胞形成的标志是诱导产生了新的细胞壁；愈伤组织形成“白菜—甘蓝”植物体属于再分化过程。
4.下列关于植物体细胞杂交的叙述中，错误的是（ ）
A.不同种植物原生质体融合的过程属于植物体细胞杂交过程
B.参与杂种细胞细胞壁形成的细胞器主要是线粒体和核糖体
C.植物体细胞杂交技术可克服生殖隔离的限制，培育远缘杂交植株
D.杂种植株表现出的性状是基因选择性表达的结果
答案 B
解析 植物体细胞杂交就是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。
杂种植株能具有两种植物的性状，但是由于基因的选择性表达，其不能表现两种植物所有的性状，细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，形成过程与高尔基体有关。
命题点三 植物细胞工程的综合应用
5.为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。
请回答下列问题：
（1）外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为_________________________________。
（2）在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如下图所示。
细胞干重在12d后下降的原因有__________________；培养液中蔗糖的作用是________________、________________。
（3）多倍体愈伤组织细胞产生的次生代谢产物量常高于二倍体。
二倍体愈伤组织细胞经________________处理，会产生染色体加倍的细胞。
为检测愈伤组织细胞染色体数目，压片前常用纤维素酶和________酶解离愈伤组织。
若愈伤组织细胞（2n）经诱导处理后，观察到染色体数为8n的细胞，合理的解释是_____________________、_____________________________________________________________。
答案
（1）脱分化
（2）蔗糖浓度下降，pH降低 提供能源 调节渗透压 （3）秋水仙素（低温） 果胶 经加倍到4n的细胞处于有丝分裂后期 经加倍到8n的细胞处于有丝分裂中期
解析
（1）外植体经诱导形成愈伤组织的过程称为脱分化。
（2）观察图示可知，12d后蔗糖浓度和pH都下降到较低水平，影响能量的供应和酶的活性，导致细胞干重下降。
另外，培养液中的蔗糖还具有调节渗透压的作用。
（3）在细胞分裂过程中，用低温或秋水仙素处理，都可抑制纺锤体的形成，使染色体不能移向两极，从而使细胞中染色体数目加倍。
愈伤组织的细胞之间含有纤维素和果胶，欲将其分散成单个细胞，压片前需用纤维素酶和果胶酶处理。
愈伤组织细胞经诱导处理后，有的细胞染色体数目加倍（4n），有的细胞染色体数目未加倍（2n），也可能有的细胞在连续分裂中每次都因低温或秋水仙素抑制了纺锤体的形成，导致细胞中染色体数目连续加倍，出现染色体数目为8n的细胞。
所以染色体数目加倍到4n的细胞处于有丝分裂后期时染色体数目为8n，染色体数目加倍到8n的细胞处于有丝分裂中期时染色体数目也为8n。
6.利用相关工程技术可以获得抗黑腐病杂种黑芥—花椰菜植株，已知野生黑芥具有黑腐病的抗性基因，而花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病，技术人员用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力，再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，流程如下图。
据图回答下列问题：
（1）该过程用到的工程技术有________________和________________。
（2）过程①所需的酶是____________________________，过程②PEG的作用是________________，经过②操作后，需筛选出融合的杂种细胞，显微镜下观察融合的活细胞中有供体的叶绿体存在可作为初步筛选杂种细胞的标志。
（3）原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是__________________________。
原生质体经过细胞壁再生，进而分裂和脱分化形成________________________________________________________________________。
（4）若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和双亲植株的根尖，制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的______________；将杂种植株栽培在含有________________的环境中，可筛选出具有高抗性的杂种植株。
答案
（1）植物体细胞杂交 植物组织培养
（2）纤维素酶和果胶酶 促进原生质体的融合 （3）保持原生质体完整性 愈伤组织 （4）形态和数目 黑腐病菌
解析
（1）据图可知，该流程图表示先去掉两种植物细胞的细胞壁，然后诱导融合获得杂种细胞，通过植物组织培养获得杂种植株，该过程是植物体细胞杂交。
（2）植物细胞细胞壁的成分是纤维素和果胶，因此采用纤维素酶和果胶酶去掉植物细胞的细胞壁；聚乙二醇（PEG）的作用是促进原生质体的融合。
（3）去掉细胞壁后获得的原生质体需要放在适宜浓度的甘露醇溶液中，保持原生质体完整性，避免失水或吸水；在植物组织培养中，经过脱分化后形成愈伤组织。
（4）由于染色体在显微镜下能看见，因此可以制作临时装片，观察染色体的形态和数目，以确定是否发生染色体变异；对杂种植物进行鉴定最简单的方法是从个体水平上进行检测，即接种黑腐病菌，观察植物的性状。
植物体细胞杂交过程中杂种细胞类型及检测方法
（1）诱导产生的细胞（假设用于杂交的两种植物细胞分别为A、B）
①未融合的细胞：
A和B。
②两两融合的细胞：
AA、BB和AB。
③多细胞融合体。
（2）检测方法：
对诱导产生的细胞进行植物组织培养，然后根据得到的植物性状进行判断。
①若得到的是一种植物的性状，说明是未融合细胞。
②若得到的是具有两种亲本性状的植物，说明是杂种植株。
③若得到的是具有两种亲本性状的植物，且一种植物的性状得到加强，则是多细胞融合体。
④若得到的是一种植物的性状且效果得到加强，则是同种细胞融合的结果。
考点二 动物细胞工程
1.动物细胞工程的主要技术
动物细胞工程就是应用细胞学的方法，按照我们人类的需要和预定的设计，有目的、有计划地保存、改变动物细胞和创造新的动物细胞，进而培育成新的物种或者品种的一门科学技术。
动物细胞工程包括很多种常用的技术，如动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体和动物体细胞克隆等。
（1）哺乳动物细胞培养技术
①动物细胞培养条件
a.动物细胞都要在液体培养基中进行培养。
培养液的营养成分主要包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。
b.培养容器中必须有足够的氧气和一定的二氧化碳，以保证细胞代谢活动的进行。
c.动物细胞培养环境的温度与动物体内的温度要保持一致。
②动物细胞培养流程
a.取材：
一般都取自动物的胚胎或幼龄动物的组织或器官。
b.过程
i.在无菌条件下，从动物体内取出组织块并剪碎，然后加入适量的胰蛋白酶或胶原纤维酶消化以使细胞分散。
ii.经过滤、离心后将动物细胞再接种到无菌的培养液中，在适宜的条件下进行静止或慢速转动培养，这个过程称为原代培养。
iii.出现接触抑制的细胞按一定的比例分散到另外的培养瓶内，并加入新的培养液，细胞就会解除接触抑制、恢复生长，这种分瓶培养称为传代培养。
③细胞生长特点：
贴壁生长、接触抑制。
④细胞株与细胞系
细胞株是指一般可以传到40～50代的细胞。
细胞系是指遗传物质发生了改变，可以无限制地传代下去，成为“长生不老”的细胞。
深化拓展 植物组织培养与动物细胞培养的比较
比较项目
植物组织培养
动物细胞培养
理论基础
植物细胞的全能性
细胞增殖
前处理
无菌、离体
无菌；用胰蛋白酶处理，使组织细胞相互分散开
取材
植物较幼嫩的部位或花药等
动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织
培养基性质
固体
液体
培养基成分
水、矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素、琼脂等
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等
结果
最终产生新个体，体现了细胞的全能性
细胞培养产生大量细胞，不形成新个体，不能体现细胞的全能性
相同点
①都需人工条件下的无菌操作；②都需要适宜的温度、pH等条件；③都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂
（2）细胞融合与单克隆抗体技术
①细胞融合
a.含义：
是在一些融合因子的作用下，将两个或两个以上的细胞合并成为一个细胞的技术。
b.诱导因素：
如利用聚乙二醇、电流刺激或病毒等。
c.原理：
在诱导因素的作用下，细胞膜会发生一定程度的损伤，从而细胞就可以实现相互粘连而融合在一起。
深化拓展 植物体细胞杂交与动物细胞融合比较
植物体细胞杂交
动物细胞融合
培养条件
营养物质（水、无机盐、蔗糖、氨基酸和有机酸等）、激素（细胞分裂素、生长素等）及其他条件（无菌、适宜的温度和pH等）
葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血清或血浆等天然成分
细胞融
合原理
细胞膜的流动性、细胞的全能性
细胞膜的流动性、细胞增殖
细胞融
合方法
用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后诱导原生质体融合
用胰蛋白酶或胶原纤维酶使细胞分散成单个细胞后，诱导细胞融合
诱导手段
①物理法：
离心、振动、电刺激等
②化学法：
聚乙二醇（PEG）
①物理、化学法：
与植物体细胞杂交的相同
②生物法：
灭活的病毒
结果
获得杂种植株
获得杂种细胞，以生产细胞产品
用途
克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍
制备单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素等
②单克隆抗体
a.含义：
由一个B淋巴细胞增殖形成的细胞群所产生的单一型抗体分子。
b.应用：
用单克隆抗体可以快捷、准确地诊断和治疗一些疾病。
c.制备：
用小鼠体内的B淋巴细胞和一种营养缺陷型的骨髓瘤细胞作为实验材料，利用聚乙二醇为融合剂，使两种细胞发生融合。
然后利用只有杂交瘤细胞才能生长的选择培养液来筛选出杂交瘤细胞使之产生特异性抗体。
（3）动物体细胞克隆技术
①多莉的培育过程
利用细胞核移植技术，将饥饿处理过的羊乳腺上皮细胞与去核卵细胞电脉冲融合后，实现体细胞的核转移到无核的卵细胞中。
然后，融合细胞借助于卵的发育能力，由体细胞核主导而发育形成新的个体。
②存在的问题：
克隆羊多莉和其他一些克隆动物在培养和生长历程中出现的一系列异常表明，动物体细胞克隆技术仍然存在着一些不足和缺陷，我们对克隆技术的探索仍然是任重道远。
2.动物细胞工程的应用
（1）快速繁殖优良品种。
（2）克隆转基因动物。
（3）拯救濒临灭绝的动物。
（4）培育人造器官。
1.有关哺乳动物细胞培养技术的判断
（1）制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理（ × ）
（2）肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2刺激细胞呼吸（ × ）
（3）在25℃的实验条件下可顺利完成大鼠神经细胞的培养（ × ）
（4）培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞（ × ）
（5）克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变（ × ）
（6）二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的（ × ）
2.有关植物体细胞杂交与动物细胞融合的判断
（1）植物原生质体融合与动物细胞融合原理是相同的（ √ ）
（2）体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体（ × ）
（3）小鼠骨髓瘤细胞的染色体数为40，B淋巴细胞的染色体数为46，融合后形成的杂交瘤细胞DNA分子数为86（ × ）
（4）杂交瘤细胞进行体内培养，是为了获得能产生单克隆抗体的胚胎（ × ）
（5）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞经细胞融合后有三种细胞类型（若仅考虑两两融合的情况）（ √ ）
3.有关动物体细胞克隆技术的判断
（1）动物细胞核移植的受体细胞必须是卵细胞（ × ）
（2）克隆动物的性状与供体动物完全相同（ × ）
（3）与“多莉”羊等克隆哺乳动物相关的技术有胚胎移植、细胞培养和核移植（ √ ）
（4）用于核移植的供体细胞一般都选用10代以内的培养细胞（ √ ）
1.如图为动物细胞培养过程中细胞增殖情况的变化曲线，图中B、E两点表示经筛选、分装后继续培养。
据图分析：
（1）原代培养和传代培养的分界点是哪个？
提示 B点之前的培养称为原代培养，之后的培养称为传代培养。
（2）AB段和DE段繁殖速度缓慢的原因是什么？
提示 AB段发生了接触抑制；DE段细胞大部分衰老失去分裂能力。
（3）E点后的细胞大多数具有异倍体核型，这样的细胞有什么特点？
提示 E点后的细胞属于细胞系，能无限增殖。
2.下图为制备单克隆抗体和多克隆抗体的示意图，据图分析：
（1）与多克隆抗体相比，单克隆抗体的优点有哪些？
提示 单克隆抗体的优点是特异性强、灵敏度高，可大量制备。
（2）图中第一次筛选和第二次筛选的目的有何不同？
提示 第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生所需单克隆抗体的杂交瘤细胞。
命题点一 动物细胞培养过程的分析
1.下列有关动物细胞培养的叙述，正确的是（ ）
A.动物细胞培养过程中，可用胃蛋白酶处理使细胞分散开
B.通过动物细胞培养获得大量细胞，可证明动物细胞具有全能性
C.动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础
D.动物细胞培养选用的培养材料大多是动物的受精卵
答案 C
解析 动物细胞培养过程中，应用胰蛋白酶或胶原纤维酶处理使细胞分散开，A项错误；通过动物细胞培养获得大量细胞，没有获得完整个体，不能证明动物细胞具有全能性，B项错误；动物细胞培养选用的培养材料大多是幼龄动物的组织或细胞，D项错误。
2.回答下列有关动物细胞培养的问题：
（1）在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面______________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的____________。
此时，瓶壁上形成的细胞是________层。
要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，用到的酶是____________。
（2）随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现__________________现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而获得________，该种细胞的黏着性________，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量________。
（3）现用某种大分子染料对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不被染色，原因是_______________________________________________________________________。
（4）检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用分裂________期的细胞在显微镜下进行观察。
（5）在细胞培养过程中，通常在________条件下保存细胞。
因为在这种条件下，细胞中________的活性降低，细胞______________速率降低。
答案
（1）相互接触 接触抑制 单（或一） 胰蛋白酶（或胶原纤维酶）
（2）衰老甚至死亡 不死性 降低 减少 （3）活细胞的细胞膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内（或死细胞的细胞膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色） （4）中（5）冷冻（或超低温、液氮） 酶 新陈代谢
解析
（1）细胞接触抑制是指细胞表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。
基于上述特性，瓶壁上形成的细胞是单层排列的。
需要用胰蛋白酶将贴壁的细胞从瓶壁上分离下来。
（2）随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡现象，但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成不死性细胞。
该种细胞由于细胞表面糖蛋白减少，其黏着性降低。
（3）活细胞的细胞膜具有选择透
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