大鼠海马神经元的培养及细胞培养注意事项.docx
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大鼠海马神经元的培养及细胞培养注意事项
1.成年大鼠海马神经元的培养
●步骤
1.获得海马细胞
◆大鼠乙醚麻醉，断头处理；
◆迅速解剖海马组织，置于含有2ml4℃的HibernateA/B27的35mm的培养皿中；
◆随后将其移入含有同上培养基的培养皿，去除脑膜及多余的脑白质（？
）；
◆将海马移入组织切碎机冷处理台面上事先用HibernateA/B27润湿的滤纸上，沿海马长轴将组织切成的薄片，随后将其移入含有5ml4℃的HibernateA/B27的离心管中；
◆30℃震荡8min。
◆大吸管将其移入含有木瓜蛋白酶（预热至30℃）的离心管，置于170rpm的旋转平台（保持组织片悬浮状态），30℃水域温育30min；
◆将海马组织切片移入15ml含有2mlHibernateA/B27的离心管中，30℃温育5min，吸管吹打10次（30s），静置2min，将上清移入另一离心管，重复上述步骤2次；
2.梯度分离
◆将细胞悬液加入Nycoprepgradient（4ml）的上方，室温，1900rpm，离心15min；去除最上方的碎片；吸管收集含有细胞的部分；用5mlHibernateA稀释；第三层富含神经元；将第四层用2mlB27:
NeurobasalA重悬，1100rpm离心1min；
3.盖玻片处理：
50ug/mL多聚-D-赖氨酸（无菌水溶解）包被过夜，吸去多余的多聚赖氨酸，无菌水漂洗一次，自然干燥1h；
4.
◆细胞接种：
以目标密度稀释于B27:
NeurobasalA，以每盖玻片60到120Ul接种，置于5%CO2:
9%O2中孵育1h；
◆将盖玻片移入24孔培养板中,每孔以0.4ml37℃B27/NeurobasalA漂洗一次，去除未贴壁细胞及细胞碎片；改用的生长培养基；
◆培养后4天，每3-4天更换一半培养基；新的培养基中的FGF2含量是远培养基的2倍；
1.培养器皿的准备：
1）溶液瓶——装配各种溶液——输液瓶；
2）螺口瓶——血清或培养基；
3）培养瓶——细胞培养——一般采用带螺口的，清洗时注意防止盖子中垫片的丢失；
4）培养皿——细胞组织的分离、培养、染色——包括直径为30mm、60mm、120mm
5）血球细胞计数板——细胞计数
6）移液管——连接上手动（吸耳球）或电动负压吸取装置——在移液管尾部塞入少量脱脂棉；
7）离心管——分离、漂洗、收集细胞——一般选用螺口带盖的；Eppendorf——塑料尖底带盖的离心管
8）磁力搅拌器：
用于神经细胞的分离机溶液的配置；最好配合使用可调温度的加热装置；可用高压蒸汽消毒。
9）加样器：
微量加样器——一般采用紫外线消毒：
超净台内，<30cm，20~30min；移液器吸嘴置于移液器吸嘴盒中高压消毒。
10）培养板（塑料消毒密封装备的即用型）——盖板及带圆孔的底板；
2.无菌室操作规范：
1）使用无菌间前先用无菌间的紫外灯照射30min，然后打开通风装置30min以消除实验室中的臭氧。
操作结束后及时清理无菌间，紫外灯照射20min。
2）进入无菌间前洗手，带好口罩、手套，更换无菌间的鞋子、衣服方可进入
3.超净台操作规范：
1）超净台使用前先用70~75%酒精擦拭，然后用超净台的紫外灯消毒30min，关灯打开风机后使用；使用完成后及时清理台面并用酒精擦拭台面；
2）超净台内不放与实验无关的东西；
3）超净台内非一次性物品都需灭菌处理，不能高压灭菌的用70%-75%的酒精消毒；
4）操作人员的手套用70%-75%的酒精消毒方可进入超净台操作；
5）操作时尽量接近酒精灯；拿取吸管时避免接触使用端；不要在开口器上方操作；吸取不同液体用不同的吸管；吸管不接触瓶口；培养用吸管、培养瓶等开口常规在酒精灯上过火；
4.常用仪器的使用：
（一）电热干燥箱:
1）用于玻璃器皿的消毒，而塑料、橡胶制品及金属器械不用于干热消毒
2）干热消毒的温度一般为160-170℃；用于RNA实验的器皿为250℃；
3）进行消毒后，鼓风和升温同时开始，待温度升至100℃时，关闭鼓风；消毒结束后，待温度降至100℃以下时打开箱门；
4）消毒完成后，将灭菌处理的器皿置于56℃电热干燥箱内长期保存
（二）CO2培养箱
1）将不透气的培养瓶/培养皿置于培养箱时，应旋松螺口使之与外界气流相通维持PH的恒定；取出是应旋紧开口；
2）保持培养箱内空气的洁净，定期用酒精或紫外线消毒；
3）保持培养箱内较高的湿度——定期在外箱内加水或将无菌潮湿的纱布置于托盘内；
（三）高压蒸汽灭菌器——适用于玻璃器皿、塑料器皿、橡胶制品、金属制品及培养用水、平衡盐液、布料的消毒灭菌。
1）灭菌的液体应置于耐高温的玻璃器皿中，容量为总容量的1/2~3/4，瓶塞要有通气口；
5.培养用液：
（一）水
1）培养用水一般使用三蒸水，或者二蒸水+去离子处理；高压蒸汽灭菌后使用；
2）新鲜使用，一般不超过2周；
3）外购的蒸馏水一般为金属蒸馏器制备，一般需要用石英或玻璃蒸馏器在蒸馏一次
（二）平衡盐：
1）取材和分离细胞中，细胞必须全程维持于生理PH和渗透压的平衡盐液中；
2）以酚红作为指示剂，正常呈红色，酸性呈黄色，碱性呈紫色；酚红一般对细胞无毒，但在强光下可产生细胞毒性。
3）碳酸氢盐缓冲系统在空气中易变碱；磷酸盐缓冲系统、HEPES可维持空气中的酸碱平衡。
4）配置时：
用新鲜培养用水配置；溶质称量应准确；先溶解Ca,Mg，再溶解其他成分，且前一种物质溶解后再溶解后一种物质；先将物质溶解于少量液体，配置完后再定容；
5）用高压蒸汽灭菌（8磅15min）或过滤除菌
6）灭菌后4℃贮存
7）配置的平衡盐的PH并不是细胞最合适的，根据情况调节PH至
8）Hanks（HBSS）——D-Hanks（不含Ca,Mg，不含葡萄糖）
（三）血清：
1）外观：
清亮透明，棕黄色或土黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠
2）清蛋白>35~45g,球蛋白<20g,血红蛋白越低越好
3）存储：
●新购血清——56℃30min热灭活（高品质胎牛血清及新生牛血清可不灭活）；
●若一次用不完，将其分装，置于-20℃，保存6~12月；
●使用时，从-20℃取出，置于4℃24h（4℃可保存1月），置于37℃水域温热；溶解过程中必须规则缓慢摇匀。
●避免反复冻融。
（四）基础培养基
1）认真阅读说明书，注意添加成分；
2）配置时应充分溶解，NaCO3应最后添加
3）配置所用器皿应十分清洁，所用水为培养用水；
4）配置后超净台内过滤除菌，4℃保存（=<7d）
5）使用前37℃预热；
6）如DMEM（营养成分浓度高，含有Ca,Mg），F12（营养成分丰富，浓度较低）
（五）谷氨酰胺补充液：
（146g/mol）
1）谷氨酰胺不稳定，一般配置成100×的贮液，-20℃保存
2）配置时应加温至30℃，充分溶解后过滤除菌，-20℃保存；
3）使用前添加，终浓度为2mmol/L
4）若培养基内已添加谷氨酰胺，4℃储存2~4周应加入原剂量的谷氨酰胺
（六）胰蛋白酶液
1）称取胰蛋白酶置于容器内加入少量D-hanks液调至糊状——然后加入D-hanks至100ml——加入NaCO3调节PH至8——4℃过夜——NaCO3/mol/LHCl调节PH至——粗滤纸过滤——过滤除菌——分装成小份-20℃保存
2）使用时4℃过夜，室温/水浴活化
3）使用时终浓度为0.05%
（七）DNA酶
1）降解DNA，有助于细胞分离——在吹打分离细胞时加入
2）称取酶置于容器内加入少量D-hanks液调至糊状——然后加入D-hanks至100ml——4℃过夜——NaCO3/HCl调节PH至——粗滤纸过滤——过滤除菌——分装成小份-20℃保存
3）使用时4℃过夜，室温/水浴活化
（八）Neurosal：
——未开封4℃避光保存6月，开封后4℃避光保存1月
（九）B27：
新购后分装，-70℃保存；4℃保存一周。
避免反复冻融
（十）多聚赖氨酸
1）使用浓度：
100ug/ml；使用剂量：
2）新购后应立即分装，-20℃保存。
使用前溶解（室温30min），4℃保存1周。
3）避免反复冻融，冻融2次后不要使用
（十一）抗生素液
1）将10000u的青霉素/10mg链霉素加入PBS液中溶解——加PBS液至100ml——分装-20℃贮存
2）使用时加入培养基：
终浓度为青霉素100u/mL，链霉素100ug/mL。
6.培养器皿的清洗消毒灭菌
（一）玻璃器皿的清洗
1）浸泡：
●重复使用的器皿使用后立即浸泡于自来水中；
●新使用的器皿使用前先浸泡于自来水中，然后用5%HCl浸泡过夜；
●要求：
完全浸泡于水中，器皿内完全充满清水不留有空气死腔；
2）刷洗：
用优质的洗涤液及软毛刷刷洗，刷洗后用水冲尽洗涤剂，晾干；
3）浸酸：
将器皿浸于配置好的酸液中
要求：
完全浸泡于水中，器皿内完全充满酸液不留有空气死腔
浸泡过夜（至少>6h）
注意：
酸液呈棕红色，若呈绿色提示酸液失效，应更换酸液；
4）冲洗：
方法一：
用洗涤装置冲洗；自然晾干；
方法二：
流水灌满后倒掉（>15次）然后蒸馏水冲洗2~3次;自然晾干；
（二）塑料器皿的清洗灭菌
●塑料器皿一般为一次性使用，拆开包装即可使用，使用后即弃；
●若欲重复使用，可按如下步骤：
流水冲净，晾干——2%NaOH浸泡过夜——自来水冲洗数遍——5%HCl浸泡30min——自来水冲洗（15遍）——单蒸水浸洗3次——双蒸水浸泡24h——70%酒精浸泡>1h——超净台紫外线照射>1h——使用；
（三）胶塞、盖子的清洗
自来水浸泡——2%NaOH煮沸10~20min——自来水冲洗5~6遍——1%HCL浸泡1h——自来水冲洗5~6遍——蒸馏水漂洗2—3遍——晾干；
（四）手术器械的清洗：
纱布拭去表面污物——自来水洗净——酒精棉球擦拭
（五）注射器的清洗：
使用后用来苏水冲洗数次——单蒸水洗3次——95%酒精洗3次——置于铝饭盒中。
（六）滤器的清洗消毒及使用
1）清洗：
使用后用清洗液清洗——自来水冲洗15min——去离子水浸泡24h——三蒸水浸泡24h
2）消毒：
新的滤膜（每次更换）于双蒸水中浸泡5~10min，正面朝上置于滤器中，稍旋旋钮（不宜过紧），包装后高压蒸汽消毒——消毒后无菌条件下旋紧旋钮——行过滤
3）过滤完成后常规打开滤器，核实滤器有无破裂或移动。
（七）包装：
1）培养瓶、培养皿、胶塞、盖子等直接置于铝饭盒中（螺口旋松）；
2）移液管、吸管头端用脱脂棉球将接口端堵塞，置于消毒桶中，桶底部垫纱布；
3）注射器，金属器械用纱布包好后置于铝饭盒中；
4）移液器的吸管头、小滤器置于专用的塑料盒中；
（八）消毒灭菌
1）干热消毒——适用于玻璃器皿160~170℃90~120min
2）湿热消毒——适用于玻璃器皿、布类、金属器械、橡胶制品的消毒灭菌
金属器械、玻璃器皿、布类——15磅30min；
常规使用液体——15磅15min；
橡胶制品——10磅10min；
湿热消毒后应置于37~56℃的温箱中储存；
3）过滤消毒——适用于培养基、消化液及血清的消毒灭菌；
4）经高压蒸汽灭菌，用双层布包裹置于干燥环境中可保持无菌10~14d；
7.为了便于固定及染色细胞，可将细胞接种于盖玻片上，盖玻片置于培养皿或培养板中，盖玻片可取出固定染色及封片
8.组织获取：
时间尽可能短，保持组织无菌状态，保持组织的湿润。
9.细胞的分离——单细胞悬液
方法：
1）使用不含Ca，Mg等二价阳离子的平衡盐溶液收集、分散细胞
2）酶消化法：
1不用含有Ca，Mg等二价阳离子的平衡盐溶液/含血清或其他蛋白质的溶液溶解酶
2控制于适宜的PH环境
3消化处理后及时终止酶的活性——离心漂洗/加入血清或特殊抑制剂
3）机械吹打法：
1吹打口径越小对细胞损伤越大
2不时让未离散的组织块下沉，及时收集含有分散细胞的悬液；加入新的平衡盐液重复上述过程
3将组织块从吸管中排除时，应将吸管置于液面以上，并贴于试管壁排除——避免产生气泡及由此引起的细胞的破裂
4要缓慢吹打。
吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢
10.培养物的维持：
1）维持于能自动注入空气及CO2的培养箱内
2）保持较高的湿度，减少蒸发
3）温度：
维持于略低于37℃，细胞在>39℃时可迅速死亡
4）换液时间依不同细胞而定。
11.培养板：
1）培养板属于半开放培养，有利于培养箱中CO2的交换。
2）孔直径愈小，细胞聚集现象越明显，24、96孔板这种现象不可避免，因为液体的附壁使得孔内培养液不是成一个液平面，而是周边高，就像凹镜一样，而使用这两种孔板由于需要加干预等原因而不能加足量培养液，使得细胞随培养液一起出现“边集”现象，如果为了使孔中央也有均匀细胞而增加接种细胞数量的话，这要看你需要观察何种指标，如果是MTT，免疫组化的话会因为细胞成层而影响结果。
对策：
消化细胞时要注意吹打均匀，避免细胞成团；
孔内培养液量要足够，接种时加足量培养液，加干预时换一次液，干预液加培养液量等于接种时培养液量，这样的话“边集”现象会有所改观。
培养种板之前，把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和后再取出。
种入细胞时力量要轻，可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让细胞悬液流入板孔中。
铺板后不要做圆周的晃动，做十字晃动，即上下左右晃动。
教你如何用WORD文档（2012-06-27192246）转载▼
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杂谈
1.问：
WORD里边怎样设置每页不同的页眉？
如何使不同的章节显示的页眉不同？
答：
分节，每节可以设置不同的页眉。
文件――页面设置――版式――页眉和页脚――首页不同。
2.问：
请问word中怎样让每一章用不同的页眉？
怎么我现在只能用一个页眉，一改就全部改了？
答：
在插入分隔符里，选插入分节符，可以选连续的那个，然后下一页改页眉前，按一下“同前”钮，再做的改动就不影响前面的了。
简言之，分节符使得它们独立了。
这个工具栏上的“同前”按钮就显示在工具栏上，不过是图标的形式，把光标移到上面就显示出”同前“两个字来。
3.问：
如何合并两个WORD文档，不同的页眉需要先写两个文件，然后合并，如何做？
答：
页眉设置中，选择奇偶页不同与前不同等选项。
4.问：
WORD编辑页眉设置，如何实现奇偶页不同比如：
单页浙江大学学位论文，这一个容易设；双页：
（每章标题），这一个有什么技巧啊？
答：
插入节分隔符，与前节设置相同去掉，再设置奇偶页不同。
5.问：
怎样使WORD文档只有第一页没有页眉，页脚？
答：
页面设置－页眉和页脚，选首页不同，然后选中首页页眉中的小箭头，格式－边框和底纹，选择无，这个只要在“视图”――“页眉页脚”，其中的页面设置里，不要整个文档，就可以看到一个“同前”的标志，不选，前后的设置情况就不同了。
6.问：
如何从第三页起设置页眉？
答：
在第二页末插入分节符，在第三页的页眉格式中去掉同前节，如果第一、二页还有页眉，把它设置成正文就可以了
●在新建文档中，菜单―视图―页脚―插入页码―页码格式―起始页码为0，确定；●菜单―文件―页面设置―版式―首页不同，确定；●将光标放到第一页末，菜单―文件―页面设置―版式―首页不同―应用于插入点之后，确定。
第2步与第三步差别在于第2步应用于整篇文档，第3步应用于插入点之后。
这样，做两次首页不同以后，页码从第三页开始从1编号，完成。
7.问：
WORD页眉自动出现一根直线，请问怎么处理？
答：
格式从“页眉”改为“清除格式”，就在“格式”快捷工具栏最左边；选中页眉文字和箭头，格式－边框和底纹－设置选无。
8.问：
页眉一般是---------，上面写上题目或者其它，想做的是把这根线变为双线，WORD中修改页眉的那根线怎么改成双线的
答：
按以下步骤操作去做：
●选中页眉的文字，包括最后面的箭头●格式－边框和底纹●选线性为双线的●在预览里，点击左下小方块，预览的图形会出现双线●确定▲上面和下面自己可以设置，点击在预览周围的四个小方块，页眉线就可以在不同的位置。
9.问：
Word中的脚注如何删除？
把正文相应的符号删除，内容可以删除，但最后那个格式还在，应该怎么办？
答：
步骤如下：
1、切换到普通视图，菜单中“视图”――“脚注”，这时最下方出现了尾注的编辑栏。
2、在尾注的下拉菜单中选择“尾注分隔符”，这时那条短横线出现了，选中它，删除。
3、再在下拉菜单中选择“尾注延续分隔符”，这是那条长横线出现了，选中它，删除。
4、切换回到页面视图。
尾注和脚注应该都是一样的。
10.问：
Word里面有没有自动断词得功能常常有得单词太长了，如果能设置下自动断词就好了
答：
在工具―语言―断字―自动断字，勾上，word还是很强大的。
11.问：
如何将word文档里的繁体字改为简化字？
答：
工具―语言―中文简繁转换。
12.问：
怎样微调WORD表格线？
WORD表格上下竖线不能对齐，用鼠标拖动其中一条线，可是一拖就跑老远，想微调表格竖线让上下对齐，请问该怎么办？
答：
选定上下两个单元格，然后指定其宽度就可以对齐了，再怎么拉都行pressAlt，打开绘图，其中有个调整坐标线，单击，将其中水平间距与垂直间距都调到最小值即可。
打开绘图，然后在左下脚的绘图网格里设置，把水平和垂直间距设置得最小。
13.问：
怎样微调word表格线？
我的word表格上下竖线不能对齐，用鼠标拖动其中一条线，可是一拖就跑老远，我想微调表格竖线让上下对齐，请问该怎么办？
答：
可以如下操作：
●按住ctl键还是shift，你haveatry●doubleclicktheline,tryit）●打开绘图，设置一下网格（在左下角）。
使水平和垂直都为最小，试一把！
？
●pressAlt
14.问：
怎么把word文档里已经有的分页符去掉？
答：
先在工具――选项――视图――格式标记，选中全部，然后就能够看到分页符，delete就ok了。
15.问：
Word中下标的大小可以改的吗
答：
格式―字体
16.问：
Word里怎么自动生成目录啊
答：
用“格式样式和格式”编辑文章中的小标题，然后插入-索引和目录
17.问：
Word的文档结构图能否整个复制论文要写目录了，不想再照着文档结构图输入一遍，有办法复制粘贴过来吗？
答：
可以自动生成的，插入索引目录。
18.问：
做目录的时候有什么办法时右边的页码对齐？
比如：
1.1标题..........11.2标题...............2
答：
画表格，然后把页码都放到一个格子里靠右或居中，然后让表格的线条消隐就可以了，打印出来就很整齐。
19.问：
怎样在word中将所有大写字母转为小写？
比如一句全大写的转为全小写的答：
格式-更改大小写-小写
20.问：
在存盘的时候，出现了问题，症状如下：
磁盘已满或打开文件过多，不能保存，另开新窗口重存也不管用。
如何解决？
答：
把word文档全选，然后复制，然后关掉word，电脑提示你粘贴板上有东西，要不要用于别的程序，选是，然后，再重
新打开word，然后粘贴，然后，保存。
21.问：
WORD中的表格一复制粘贴到PPT中就散掉了，怎么把WORD里面的表格原样粘贴到PPT中？
答：
1）比较好的方法是：
先把表格单独存为一WORD文件，然后插入－－对象，选由文件创建，然后选中上面的WORD文件，确定；2）还可以先把表格copy到excel中，然后copy到PPT中，这个也是比较好的办法；3）可以先做成文本框，再粘贴过去；4）复制粘贴，但是在PPT中不能粘在文本框里面；5）拷屏，做成图片，再弄到PPT里面。
22.问：
有没有办法将PPT的文字拷入WORD里面？
答：
另存就可以了。
只要以.rtf格式另存即可
23.问：
word中图片的分栏如何处理？
假如有：
12图34这样的结构，我想实现：
13图（要横跨两栏）24但是，试了半天总是：
12图34怎么办呀？
help！
答：
设置图片格式――版式――高级――文字环绕――环绕方式选上下型――图片位置――对齐方式选居中――度量依据选页面，要先改文字环绕，然后才能改图片位置
24.问：
用word写东西时字距老是变动，有时候自动隔得很开，有时候进入下一行的时侯，上一行的字距又自动变大了，这是为什么？
怎么纠正啊？
答：
是因为自动对齐的功能，格式――段落――对齐方式可以选。
还有允许断字的功能如果check上，就不会出现你说的情况了。
25.问：
在使用WORD的样式之后，如标题1、标题2之类的，在这些样式前面总会出现一个黑黑的方块，虽然打印的时候看不到，但看着总是不舒服，有没有办法让它不要显示呢？
答：
“视图”－－“显示段落标志”，把前面的勾去掉。
其实这个很有用，可以便于知道哪个是标题段落
26.问：
文章第一页下面要写作者联系方式等。
通常格式是一条短划线，下面是联系方式，基金支持等。
这样的格式怎么做出来？
就是注明页脚吗？
答：
插入――脚注和尾注
27.问：
文字双栏，而有一张图片特别大，想通栏显示，应该怎么操作？
答：
可以选择的内容，按双栏排。
选择其他内容，按单栏排。
28.问：
Word里面如何不显示回车换行符？
答：
把视图-显示段落标记的勾去掉或工具-选项-视图-段落标记
29.问：
有没有方法把WORD里的软回车一下子替换掉？
识别出来的文字全带着软回车，能把他们一次全删掉吗？
？
答：
查找＋替换，按CTRL+H；软回车好象是^l，在特殊字符里有
30.问：
在WORD里的框框里怎么打勾？
答：
画个文本框，文本框里写一个钩，然后拖过去；或者先在WORD里插入符号“√”，然后选中“√”，到-》格式-》中文版式-》带圈字符-》选“□”
31.问：
还是不行，这样拷过去的框框字体是windings的，而原来的是宋体的，两者有很大的区别。
答：
根据模板新建专业型，里面有框，双击后打勾，copy就ok
32.问：
Word中怎么在一个英文字母上打对号？
答：
透明方式插入图片对象，内容是一个√
33.问：
WORD里怎么显示修订文档的状态？
文档修订后，改后标记很多，但是在菜单里没有“显示修订最终状态”等，怎么调出来？
答：
工具－自定义－命令－类别（工具）－命令（修订）－把“修订”等拖到工具栏上
34.问：
怎样把许多分开的word文档合并成一个文档。
我的论文是按照章节分开写的，但现在图书馆要提交电子版的学位论文，是一个文档的，我找了很多选项但好象不能合并，选择插入文件功能，可以加入内容，但文档中的页眉却插不进去，有谁有高见？
答：
acrobat6可以直接把多个文档打印成一个pdf文档。
可以提交pdf格式的论文，先一个一个word文档转换为pdf格式的，然后在pdf文档菜单的文件菜单中，选上作为pdf格式打开，追加上就可。
35.问：
Word里面要写方程式怎么办啊？
答：
插入－对象－公式编辑器equation，如果没有公式编辑器Equation，要自
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