烟草及烟草制品淀粉的测定酶水解离子色谱法标准方法论证.docx
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烟草及烟草制品淀粉的测定酶水解离子色谱法标准方法论证
《烟草与烟草制品中纤维素、半纤维素、木质素的测定洗涤剂法》
试验报告
一.概述
纤维素、半纤维素和木质素是构成植物细胞壁的主要物质，占植物所有多糖的50%以上，以往的研究表明，各等级烟叶总细胞壁物质含量在20％～30％左右，在烟梗和烟草薄片中甚至要占到总质量的三分之一以上。
他们对于烟叶的燃烧性能和烟丝的填充值以及卷烟的香吃味都有很直接的影响，例如，纤维素会对卷烟燃吸品质产生副作用，会产生一种尖刺的刺激性和一种“烧纸”的气味。
另外，对他们的测定为进一步加强对烟草及其制品的认识，对提高烟叶原料品质评价水平、加强对卷烟、梗丝和造纸法薄片制造工艺研究等具有较大的指导意义。
对于纤维素、半纤维素和木质素的分析测定工作大致可以分为三个阶段：
粗纤维法、纤维洗涤剂法和酶法，当然还有其他一些方法和最新的方法，各国各行业采用的标准主要还是这三类方法。
这三类方法有一个共同点，就是它们的基本原理都是基于纤维素、半纤维素和木质素的化学性质，使其与试样中的其他物质分离而进行测定。
100多年前德国科学家Henneberg和Stohmann提出的粗纤维法，是采用稀酸稀碱的一系列浸提、干燥后得到的纤维总量，由于通过这种方法测定出来的粗纤维是一个比较模糊的概念，里面包含着大部分的纤维素以及部分的半纤维素和木质素，是一个“粗”的总量。
但由于其分析过程较为简单，所以一些行业现在仍然也还在使用粗纤维法。
1963年，美国人VanSoest提出了纤维洗涤剂法，也叫凡氏方法，提出了中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）及酸性洗涤木质素（ADL）的概念，一般认为，用中性洗涤剂洗涤已被有机溶剂提取过的样品，样品中的糖、淀粉、蛋白质、果胶等物质被溶解除去，不能消化的残渣为NDF，主要包括几乎全部的纤维素、半纤维素和木质素和少量的蛋白质。
在酸性洗涤剂的作用下，除NDF体系被除去的物质以外，半纤维素亦被去除得到ADF，ADF经过72％硫酸消化得到的不溶物即为ADL。
通过以上几个公式就可以分别得出纤维素、半纤维素和木质素的量，这一方法目前已经是较为主流的方法。
洗涤剂法的主要流程见下图，AOAC和GB分别有相应的方法和标准。
图1烟草中纤维素测定试验路线图
20世纪70年代末80年代初，日本人阿布亮提出了酶法，而且由于对于食品营养的不断关注，对于食品中膳食纤维的测定也越来越采用这一方法。
这种方法主要还是模拟人体的消化过程，利用各种酶对试样进行分离，就象凡氏方法把细胞壁物质分为NDF、ADF、ADL一样，他把之分为可溶性纤维和不可溶性纤维，主要还是针对人体和动物的吸收来说的，简而言之，与凡氏方法相比，就是用酶处理代替了洗涤剂处理，但对于纤维素和半纤维素、以及木质素并没有明确的界定。
对于纤维素、半纤维素和木质素的测定也有其他的一些方法，例如我国造纸行业采用的综纤维法，还有菲莫公司利用核磁共振技术进行的研究，以及通过一系列的分离、水解将纤维素、半纤维素转化为单糖进行分析的方法。
表1国内外对于纤维素、半纤维素和木质素的一些测定标准
方法
主要标准
粗纤维法
AOAC920系列茶叶、烘焙咖啡、可可制品中的粗纤维
GB/T8310-2002茶粗纤维的测定
GB/T6434-94饲料中粗纤维测定方法
洗涤剂测定法
（VanSoest法）
AOAC973.18动物饲料中的酸性洗涤纤维和木质素
ASTMD1106-96木材中酸洗木质素的标准测定方法
GB/T12394-90食物中不溶性膳食纤维的测定方法
GB/T9822-88谷物不溶性膳食纤维的测定方法
GB/T2677.8－94造纸原料酸不溶木素含量的测定
GB/T20805-2006饲料中酸性洗涤木质素的测定
GB/T20806-2006饲料中中性洗涤纤维的测定
酶法
AOAC985.29食品中总的膳食纤维——酶重量法
其他方法
GB/T2677.10－1995造纸原料综纤维素含量的测定
可以说不同时期不同国家不同行业对于不同原料中纤维素、半纤维素和木质素含量进行测定的目的、侧重点、条件都有所不同，例如造纸行业，往往是考虑在加工过程中不要造成纤维素的过多损失以及尽量取出木质素，在食品、饲料行业主要考虑的是营养价值。
现阶段我们烟草行业还没有一个较为统一的方法，在不同文献调研和不同研究过程中，给许多研究造成了困难。
为此，本标准制订工作希望以洗涤剂法为基础，并在此基础上考证酶法的可行性，借鉴已有国标，结合烟草行业实际，建立较为科学、适合我们烟草行业推广使用的纤维素、半纤维素以及木质素的测定标准。
二.实验部分
2.1仪器
2.1植物样品粉碎机
2.2试验筛：
孔径0.42mm（40目）
2.3分析天平：
分度值：
0.0001g
2.4电热恒温箱
2.5抽滤装置：
抽滤瓶和真空泵或水抽泵
2.6pH计
2.7纤维分析仪（FOSS2010型），配置石英坩锅P2（孔径大小）
2.8马弗炉
2.9干燥器：
无水氯化钙或变色硅胶为干燥剂
2.10脱脂装置：
配冷凝管的250mL圆底烧瓶
2.11电加热装置（可调功率）
2.2试剂
所有试剂均为分析纯级试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。
苯，乙醇，乙醚，十二烷基硫酸钠，乙二胺四乙酸二钠，四硼酸钠（Na2B4O7·10H2O），无水磷酸氢二钠，乙二醇乙醚，正辛醇（消泡剂），丙酮，98％浓硫酸，十六烷基三甲胺溴，-高温淀粉酶（活性100kU/g，105℃），石英砂。
2.3试剂配制
2.3.1中性洗涤剂（3％十二烷基硫酸钠）：
称取18.6g乙二胺四乙酸二钠和6.8g四硼酸钠，放入100mL烧杯中，加入适量蒸馏水，震荡溶解（可加热），再加入30g十二烷基硫酸钠（C12H25OSO3Na）和10mL乙二醇乙醚；称取4.65g磷酸氢二钠置于另一烧杯中，加蒸馏水加热溶解，冷却后将上述两溶液转入1000mL在电热煲上加热后震荡溶解。
用玻璃棒将其转移至1000mL容量瓶中并用水定容。
此溶液pH值应在6.9～7.1之间（pH值一般不用调整）。
2.3.2酸性洗涤剂（2％十六烷基三甲胺溴）：
量取约27.87mL98％浓硫酸，缓慢加入已装有500mL蒸馏水的烧杯中，冷却后注入1000mL容量瓶定容配置成1N硫酸；称取20g十六烷基三甲胺溴于1000ml烧杯中，加入配置好的1N硫酸，搅拌溶解，注入1000mL容量瓶定容。
2.3.372％硫酸：
将98%浓硫酸稀释至72%。
2.4样品测试
2.4.1抽取烟草或烟草制品为实验室样品，粉碎后过40目筛，测定样品含水率。
2.4.2试样脱脂
准确称取约5g样品（记作m1），置于250mL圆底烧瓶中。
向圆底烧瓶中依次加入50mL苯、50mL乙醇和10mL乙醚。
将加入试剂后的圆底烧瓶中置于电加热装置上，并在圆底烧瓶上搭好冷凝管开启冷凝水后，开始加热。
待液体沸腾后，调节电加热装置功率至维持其微沸状态，保持微沸4h。
另取小烧杯和已按上述流程脱脂和丙酮冲洗后的滤纸置于烘箱中烘干至恒重，测定其准确质量，记作m2后，放入干燥器中备用。
待停止加热后，将烧瓶静置、冷却，将烧瓶中的液体全部转移到滤纸上进行抽滤，用丙酮冲洗至滤出液无色，然后将滤纸和滤渣一起转移到小烧杯中，放入（105±2）℃烘箱中烘干至恒重。
称出其总质量（记作m3）。
最后滤渣置于干燥器中备用。
2.4.3中性洗涤纤维的测定
称取约2g石英砂放入实验用石英坩埚中，然后准确称取脱脂后的试样约0.5g（记作m4）放于石英砂的上面，将坩埚样品放在纤维分析仪的热浸提单元上，加入大约100mL中性洗涤剂（如遇淀粉含量较高，可加入0.2mLα-高温淀粉酶），并加入1.0mL正辛醇作为消泡剂。
将加热强度调至最大。
待溶液沸腾后，保持微沸1h，结束后，立即开始抽滤。
并用热水（90～100）℃冲洗管壁和剩余物，直至滤出液无泡沫为止。
将热浸提后的试样和坩锅放在纤维分析仪的冷浸提单元上，用丙酮冲洗剩余物3次，确保剩余物与丙酮充分混和。
抽干后将坩锅和剩余物放入（105±2）℃烘箱中烘干3～4h至恒量。
在干燥器中冷却后称量。
再烘干30min，冷却，称量，直至两次称量之差小于0.002g为恒量。
记录坩锅和剩余物的总重为m5。
然后将坩埚和剩余物置于马弗炉中，在（510±10）℃，灰化6h，于干燥器冷却后称重，记作m6。
2.4.4酸性洗涤纤维的测定
称取约2g石英砂放入实验用石英坩埚中，然后准确称取脱脂后的试样约0.5g（记作m7）放于石英砂的上面，将坩埚样品放在纤维分析仪的热浸提单元上，加入大约100mL酸性洗涤剂，并加入1.0mL正辛醇作为消泡剂。
将加热强度调至最大。
待溶液沸腾后，保持微沸1h，结束后，立即开始抽滤。
并用热水（90～100）℃冲洗管壁和剩余物，直至滤出液无泡沫为止。
将热浸提后的试样和坩锅放在纤维分析仪的冷浸提单元上，用丙酮冲洗剩余物3次，确保剩余物与丙酮充分混和。
抽干后将坩锅和剩余物放入（105±2）℃烘箱中烘干3～4h至恒量，在干燥器中冷却后称量。
再烘干30min，冷却，称量，直至两次称量之差小于0.002g为恒量。
记录坩锅和剩余物的总重为m8。
然后将坩埚和剩余物置于马弗炉中，在（510±10）℃，灰化6h，于干燥器冷却后称重，记作m9。
2.4.5酸洗木质素的测定
称取约2g石英砂放入实验用石英坩埚中，然后准确称取脱脂后的试样约0.5g（记作m10）放于石英砂的上面，将坩埚样品放在纤维分析仪的热浸提单元上，加入大约100mL酸性洗涤剂，并加入1.0mL正辛醇作为消泡剂。
将加热强度调至最大。
待溶液沸腾后，保持微沸1h，结束后，立即开始抽滤。
并用热水（90～100）℃冲洗管壁和剩余物，直至滤出液无泡沫为止。
将热浸提后的试样和坩锅放在纤维分析仪的冷浸提单元上，用丙酮冲洗剩余物3次，确保剩余物与丙酮充分混和。
抽干后在每个坩锅内放置一玻棒，加入25mL72％硫酸，并不时搅拌，3小时后过滤。
过滤后用热水（90～100）℃冲洗管壁和剩余物，直至滤出液无酸性为止。
将坩锅和剩余物放入（105±2）℃烘箱中烘干3～4h至恒量，在干燥器中冷却后称量。
再烘干30min，冷却，称量，直至两次称量之差小于0.002g为恒量。
记录坩锅和剩余物的总重为m11。
然后将坩埚和剩余物置于马弗炉中，在（510±10）℃，灰化6h，于干燥器冷却后称重，记作m12。
（在每个坩锅内放置一玻棒以便搅拌）。
2.5结果的计算与表述
2.5.1样品脱脂剩余率（ƒ）的计算
烟草及烟草制品样品脱脂剩余率按下式
（1）计算得出：
……………………
（1）
2.5.2以干基计的中性洗涤纤维（NDF）含量的计算
……………………
（2）
式中：
NDF——样品的中性洗涤纤维含量，单位为质量百分数（％）；
ƒ——样品脱脂剩余率；
W——样品含水率，单位为质量百分数（%）。
2.5.3以干基计的酸性洗涤纤维（ADF）含量的计算
……………………（3）
式中：
ADF——样品的酸性洗涤纤维含量，单位为质量百分数（％）；
ƒ——样品脱脂剩余率；
W——样品含水率，单位为质量百分数（%）。
2.5.4以干基计的酸洗木质素（ADL）含量的计算
……………………（4）
式中：
ADL——样品的酸洗木质素含量，单位为质量百分数（％）；
ƒ——样品脱脂剩余率；
W——样品含水率，单位为质量百分数（%）。
2.5.5以干基计的纤维素含量
……………………（5）
式中：
C——样品的纤维素含量，单位为质量百分数（％）；
ADF——样品的酸性洗涤纤维含量，单位为质量百分数（％）；
ADL——样品的酸洗木质素含量，单位为质量百分数（％）。
2.5.6以干基计的半纤维素含量
……………………（6）
式中：
S——样品的半纤维素含量，单位为质量百分数（％）；
NDF——样品的中性洗涤纤维含量，单位为质量百分数（％）；
ADF——样品的酸性洗涤纤维含量，单位为质量百分数（％）。
2.5.7以干基计的木质素含量
……………………（7）
式中：
S——样品的木质素含量，单位为质量百分数（％）；
ADL——样品的酸洗木质素含量，单位为质量百分数（％）。
三.结果与讨论
3.1助滤剂的选择及空白实验
由于烟草及其制品在用洗涤剂法进行纤维分析时过滤较为困难，残渣容易堵塞石英坩锅滤芯，影响测试效率和准确性。
因此，选择了国内外标准常用的助滤剂进行了常规的空白实验，考察助滤剂的流失和空白实验情况。
选择一定量的酸洗硅藻土和石英砂分别进行中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）和酸洗木质素（ADL）的测定，数据见下表。
表2助滤剂的损失和空白实验（N=7）
损失/g
酸洗硅藻土/1g
石英砂/2g
NDF测试
0.0008
0.0006
ADF测试
0.0015
0.0008
ADL测试
0.0032
0.0013
试验表明，石英砂的损失要小于酸洗硅藻土，同时，石英砂的过滤效果也较好于酸洗硅藻土，因此本标准选择石英砂作为助滤剂。
同时，本空白实验表明，因为一般的烟草及其烟草制品的上样量约为1.0g（根据实际情况略有差异），因此，可以判定根据本标准烟草及其制品中中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸洗木质素的检测限约为烟草干物质的0.1%左右。
3.2样品脱脂方式的选择和对测定结果的影响
由于烟草样品种类较多，成分较其他分析样品更为复杂、且差异较大，为了有效去除脂溶性干扰物质的影响，一般需先脱脂才能进行样品分析。
对烟草样品脱脂后分析，一方面可以减小干扰物质带来的误差，提高分析的准确性，另一方面，经过脱脂，可以增加分析检测的上样量，提高分析的重复性，此外脱脂对提高后续步骤的过滤速度、延长坩锅寿命都有一定的好处。
脱脂的方法有冷浸提、热浸提、索氏抽提等方法，浸提的效果略有不同。
在借鉴文献、其他国内外标准，同时考虑方便快捷的基础上，本研究对脱脂的方式、溶剂、时间等条件进行了选择，研究表明，虽然部分样品即使不进行脱脂，最后检测结果的差异很小，但部分样品的数据差异较大（见表3），主要原因是洗涤剂并不能完全将烟草及其制品中的非纤维类物质洗脱干净，由于待测样品的不确定性，本研究还是选择了采取热抽提的脱脂方式，并经过傅立叶红外光谱对抽提前后的样品进行了验证，基本确认用苯、乙醇、乙醚混合溶剂回流4小时基本能除去大部分酯溶性的干扰物质。
表3脱脂对部分样品检测结果的影响
单位/%
样品A
样品B
NDF
ADF
ADL
纤维素
半纤维素
NDF
ADF
ADL
纤维素
半纤维素
脱脂
21.49
16.40
1.30
15.10
5.09
16.06
13.20
0.87
12.33
2.86
未脱脂
21.57
16.45
1.35
15.10
5.12
18.62
14.91
1.44
13.47
3.71
图2烟草样品脱脂的失重曲线
图3脱脂前后的烟草制品的傅立叶红外光谱图
（上图为吸收光谱，下图为光谱的二阶倒数处理）
运用红外光谱比较了抽提前后烟草主要成分的变化（见图3）。
上图显示为抽提前后烟草的吸收光谱，箭头所示的两处吸收峰2922cm-1和1732cm-1左右（肩峰）分别为-CH2和R-C=O-O化合物的吸收区域。
特别是1720-1750cm-1间的吸收峰，常被用来判定脂质化合物存在与否。
同时在1100cm-1附近有该两类化合物强烈的伸缩振动区域，表明该两处吸收峰主要是脂类化合物引起的分子振动，且在烟草中含有较高的比重。
洗涤后，2922cm-1和1732cm-1两处的吸收峰难以辨认，基本可以确认脂类化合物被去除。
下图为上图的二阶导数处理，有利于辨别难以用吸收光谱直接观测出的微小差别。
从抽提前后的二阶导数谱中可以看出，原始谱中脂质判定峰1745cm-1洗涤后同测试噪音相似，可以判定该样本中无脂质类化合物。
因此确认该烟草前处理方法对脂质类化合物去除有效。
3.3烟草和烟草制品中中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸洗木质素的测定
根据2.4和2.5相关内容，对烤烟、白肋烟、晒烟、烟梗、造纸法薄片等不同烟草和卷烟制品中的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸洗木质素的含量进行了测定，并根据计算得到烟草和烟草制品中的纤维素、半纤维素和木质素含量。
具体数据见表4。
表4不同烟草和烟草制品中NDF、ADF、ADL及纤维素、半纤维素和木质素的含量
单位/%
NDF
ADF
ADL
纤维素
半纤维素
木质素
国内烤烟A
19.96
12.30
1.18
11.12
7.66
1.18
国内烤烟B
19.73
10.70
2.19
8.51
9.03
2.19
国内烤烟C
17.89
10.97
1.20
9.77
6.92
1.20
国外烤烟
21.33
12.58
2.15
10.43
8.75
2.15
白肋烟
16.06
13.20
0.87
12.33
2.86
0.87
晒烟
20.86
14.02
1.47
12.55
6.84
1.47
香料烟
16.93
8.77
1.12
7.65
8.16
1.12
烟草薄片
40.36
37.69
1.64
36.05
2.67
1.64
烟梗
26.96
25.81
2.12
23.69
1.15
2.12
烤烟型卷烟A
20.75
13.75
1.45
12.3
7.00
1.45
烤烟型卷烟B
21.49
16.40
1.30
15.1
5.09
1.30
混合型卷烟A
21.78
15.12
1.29
13.83
6.66
1.29
混合型卷烟B
24.09
17.24
1.65
15.59
6.85
1.65
可以看出，烟梗、造纸法薄片的纤维素含量相对较高，半纤维素含量较低，而香料烟的纤维素含量相对较低；卷烟中由于梗丝和薄片的使用，纤维素的含量也较高；另外，烟草制品的木质素含量基本都在3％以下，这些都是与以往的研究结果相一致的。
3.4重复性实验
选择某样品进行重复性分析测试，数据如下：
表5重复性实验数据
NDF
ADF
ADL
纤维素
半纤维素
木质素
1
19.87
12.69
1.27
11.41
7.18
1.27
2
20.04
13.51
1.43
12.08
6.53
1.43
3
18.23
12.40
1.36
11.04
5.83
1.36
4
18.72
11.99
1.43
10.55
6.73
1.43
5
18.70
12.62
1.25
11.37
6.08
1.25
6
19.36
12.41
1.45
10.96
6.95
1.45
7
19.27
12.37
1.60
10.78
6.90
1.60
8
19.06
12.56
1.40
11.16
6.50
1.40
平均值/%
19.16
12.57
1.40
11.17
6.59
1.40
SD
0.61
0.44
0.11
0.47
0.45
0.11
RSD
3.19%
3.48%
7.82%
4.19%
6.89%
7.82%
可以看出，NDF、ADF的测试重复性较好，ADL的含量由于相对较低，RSD略大。
而纤维素、半纤维素是根据NDF、ADF、ADL的差值计算得到，RSD会较实测值略大。
3.5回收率实验
取微晶纤维素样品0.50g按2.4相关步骤分别进行NDF、ADF、ADL的实验，测试表明，微晶纤维素的中性洗涤纤维和酸性洗涤含量在96.99％和99.89％，而酸洗木质素含量为0.01%，表明本方法是对检测样品中的纤维素含量有较好的选择性和灵敏度。
另取烟草样品分别加入0.05g左右微晶纤维素标准品按2.4和2.5相关步骤分别进行NDF、ADF、ADL的实验，数据（如下表6）表明本方法对纤维素的回收率较好。
由于半纤维素和酸洗木质素的标准品无法获取，因而，对于半纤维素和木质素的回收率未进行考察。
表6样品回收率、检出率测试结果单位：
％
样品名称
NDF
加入纤维素量
测定值
回收率
ADF
加入纤维素量
测定值
回收率
ADL
加入纤维素量
测定值
检出率
空白样品
0.00
100.00
96.99
96.99
0.00
100.00
99.89
99.89
0.00
100.00
0.01
0.01
样品一
24.09
8.39
31.58
89.29
17.24
8.36
25.08
93.82
1.65
8.32
1.72
0.80
样品二
18.47
8.78
27.38
101.44
12.54
8.46
20.69
96.28
1.56
8.29
1.55
-0.11
样品名称
纤维素
加入纤维素量
测定值
回收率
半纤维素
加入纤维素量
测定值
检出率
木质素
加入纤维素量
测定值
检出率
空白样品
0.00
100.00
99.88
99.88
0.00
100.00
-2.90
-2.90
0.00
100.00
0.01
0.01
样品一
15.58
8.36
23.43
93.82
6.85
8.39
6.50
-4.20
1.65
8.32
1.72
0.80
样品二
10.99
8.46
19.13
96.28
5.93
8.78
6.69
8.67
1.56
8.29
1.55
-0.11
备注：
1.半纤维素、酸洗木质素的标样无法获取；
2.纤维素不应在ADL（木质素）、半纤维素测试中检出，故标注“检出率”。
3.6对于酶法测试纤维素的探索
洗涤剂法是对纤维素等细胞壁物质分析的经典方法，但是方法还是存在分析周期长、低含量时重现性不高等弊端，因此，本研究对可否利用酶催化专一性的特性，采用纤维素酶将纤维素水解为单糖，然后用分析精度较高的液相色谱对水解所得的单糖进行分析做了一定的探索性研究，以图为纤维素的分析开辟新的方法。
采用一定的前处理方法，使纤维素从半纤维素和木质素的包裹中脱离出来，并使纤维素结晶区无定形化，是纤维素完全酶解的先决条件。
综合目前该领域的研究成果，前处理方法一般有：
机械粉碎、高温高压爆破、酸处理、碱处理、微波处理、超声处理等等。
针对不同的应用条件，这些方法各有自身的特点。
在本标准研究中，我们原计划在碱处理、微波处理、超声处理这3种手段中找出一种组合，获得最优的前处理效果，以最大程度提高后续的酶解处理效率。
但是无论利用碱处理、微波处理还是超声处
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