新一代的流行性乙型脑炎疫苗.docx
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新一代的流行性乙型脑炎疫苗
新一代的流行性乙型脑炎疫苗
新一代流行性乙型脑炎疫苗
张卓光
（成都生物制品研究所成都610023）
摘要流行性乙型脑炎是疫苗可预防疾病，近年开发新的Vero细胞乙型脑炎疫苗是一个热点。
本文介绍了五种以Vero细胞为基质的乙脑疫苗，它们的研制情况及特点。
关键词流行性乙型脑炎Vero细胞疫苗
流行性乙型脑炎病毒，简称乙脑病毒。
属于黄病毒科，黄病毒属，1935年在日本分离。
乙脑病毒颗粒为球形、有包膜，直径45nm左右，其中核心30nm[1]。
含有一条正链RNA编码一个多聚蛋白，它们分别裂解加工成结构蛋白C、PrM、M、E和非结构蛋白NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5。
E蛋白是乙脑病毒的重要抗原，含有与病毒毒力密切相关的决定性氨基酸，能诱导产生中和抗体[2]。
它侵犯人中枢神经系统，所致流行性乙型脑炎（简称乙脑）是一种急性传染病，以蚊为传播媒介,主要在夏秋季流行。
全球每年有约50，000例报告，主要分布于亚洲。
20世纪90年代以来，乙脑流行区域有所扩大，一些原来为非乙脑流行的国家或地区也发生乙脑流行。
如1990年美属塞班岛（位于西太平洋马里亚纳群岛）[3]，同年7～11月在印度的西北部[4]，澳大利亚最北部的托雷斯海峡（TorresStrait）的巴度（Badu）岛都首次报告发生乙脑[5]。
乙脑不仅病死率高（30%），而且后遗症严重，约50%的幸存者有神经系统的后遗症。
近年国内的广东、广西等地都有局部的暴发流行，现在对乙脑的防治措施主要是防蚊和接种疫苗。
疫苗的纯毒试验，用RT-PCR，分析核苷酸序列与公布的SA14-14-2株比较，只有5311核苷酸不同。
疫苗是胸腺嘧啶（T），而公布的SA14-14-2株是胞嘧啶（C）。
此疫苗的优点是：
（1）Vero细胞培养乙脑病毒，可用无血清培养基并达到较高的滴度（7.0～8.0LgPFU/ml）；
（2）可反复收毒，易于大规模生产；（3）无血清培养基培养乙脑病毒，增加了疫苗的安全性，并可用简易、经济的纯化方法。
在小鼠模型中，JE-PIV较JE-VaX在相同剂量下，都能保护小鼠，JE-PIV有更强的免疫原性。
JE-PIV安全、有效、经济，将在志愿者中进行I期临床观察[12]。
4、乙脑北京-1株Vero细胞灭活纯化疫苗
日本Chemo-seroTherapeuticResearch研究所的KeishinSugawara等，以乙脑北京-1株，Vero细胞为基质开发出灭活纯化疫苗。
细胞库：
Vero细胞122代购自ATCC，126代建立主细胞库，129代建立工作细胞库。
然后对细胞库进行生物安全检查合格。
病毒库：
使用无血清培养基培养北京-1株，种毒5天后收毒。
在第2代建立主种子批（MVB），第4代建立工作种子批（WVB），第9代建立扩大种子批（EVB）。
无菌试验，外源因子检测合格，核苷酸序列分析各种子批都一致。
为了便于大规模的工业生产该疫苗，开发了一条易于放大的工艺流程。
采用培养罐、微载体技术培养Vero细胞，5L、50L、500L培养罐逐级放大，种毒后用无血清培养基培养病毒，第3天病毒滴度达高峰（9.0LgPFU/ml左右），第4天E蛋白酶标抗体（E-ELISA）检测达高峰，第4天收毒。
去除细胞及碎片，超滤浓缩，福尔马林灭活，蔗糖密度梯度离心，柱层析，再加附加剂制成Vero细胞灭活纯化疫苗。
Vero细胞DNA含量223.0±41.39（pg/mg）,ELISA检测Vero细胞的蛋白质（HCP）含量159.7±19.60（ng/mg）。
把Vero细胞和鼠脑乙脑灭活纯化疫苗的物理化学和免疫原特性做一比较，见表1。
表1Vero细胞和鼠脑乙脑灭活纯化疫苗的物理化学和免疫原特性比较
疫苗
名称
电镜观察病毒直径
蔗糖密度梯度离心
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE）
蛋白质印迹
（Westernblot）
免疫双向扩散
效力（病毒中和滴度Log10）
免疫血清中和病毒谱
Vero细胞
46.7±0.19nm
病毒都浓缩
在43%蔗糖处
结果相似
都观察到
6条带
都观察到
E抗原呈
双带
抗原和
免疫原性没有差异
2.85【2.25】
2.87【2.31】
两者
相似
鼠脑
46.7±0.43nm
2.74【2.25】
2.33【2.31】
【】：
参考疫苗
从表1可知，乙脑北京-1株在Vero细胞和鼠脑上制备的疫苗，物理化学特性和免疫原性相似[6]。
对Vero细胞和鼠脑乙脑北京-1株灭活纯化疫苗的安全和效果，进行了动物和I期临床观察。
在小鼠、狗、兔中一剂量的异常毒性观察，未显示有毒性；致畸性试验，结果阴性。
两组志愿者各30名血清乙脑抗体阴性（对乙脑北京-1株中和抗体滴度<101），分别接种Vero细胞和鼠脑乙脑北京-1株灭活纯化疫苗。
两组局部药物反应，头痛和不舒服轻微，Vero细胞组反应率6.7%，鼠脑组20.0%。
两组接种3针后，血清阳转率都是100%，几何抗体平均滴度（GMT）Vero细胞组是102.35，鼠脑组是102.03[13]。
5、黄热乙脑嵌合病毒（ChimeriVax-JE）Vero细胞减毒活疫苗
黄热病毒（YF）17D株，制备黄热病减毒活疫苗有60年的安全和有效的使用历史。
用乙脑SA14-14-2株的结构蛋白PrM和E的基因去替换黄热病毒17D株cDNA的相应位置，而核心蛋白（C）、非结构蛋白基因与病毒复制有关的部分，则保留黄热病毒17D株的基因序列，构成黄热乙脑嵌合病毒（ChimericYF/JE-S）。
在体外转录为RNA后，转染Vero细胞，培养后出现细胞病变或蚀斑经检定证实为感染性嵌合体病毒后，则可继续传代保存[14]。
黄热乙脑嵌合病毒（prM-E）在脊椎动物和蚊来源细胞上较乙脑SA14-14-2株繁殖良好，在Vero细胞培养五天，滴度达到>8LgPFU/ml，E蛋白仍保留乙脑病毒的抗原性和生物学特性。
在FRhL细胞上的prM-E基因序列与乙脑SA14-14-2株一致，与乙脑强毒株SA14和Nakayama在包膜上有6个氨基酸不同（E107、E138、E176、E279、E315、E439）。
106PFU脑内注射小白鼠无神经毒性，而黄热病毒17D株在小白鼠神经毒力较黄热乙脑嵌合病毒大。
黄热乙脑嵌合病毒在细胞传18代，鼠脑中传6代后，与减毒和毒力有关的氨基酸位点都存在，保持不变，显示黄热乙脑嵌合病毒的基因稳定性。
在小鼠皮下接种≥103PFU的黄热乙脑嵌合病毒一针，就能保护乙脑强毒株的腹腔攻毒。
在猴脑内接种6.6LgPFU的黄热乙脑嵌合病毒，只引起短暂的病毒血症，没有脑炎病征，引起高滴度的乙脑抗体，能抵御乙脑强毒株的脑内攻毒。
对攻毒30天后猴的神经组织进行病理检查，没有或仅有轻微的脑炎病理改变；用WHO规定的黄热病毒17D株的猴神经毒性试验，检测黄热乙脑嵌合病毒符合WHO规程标准[15-17]。
美国Acambis公司的ThomasP.Monath等，用黄热乙脑嵌合病毒，在Vero细胞上培养的3、4和5代分别作为主种子批、工作种子批和疫苗。
收获Vero细胞培养嵌合病毒的上清液作为疫苗原液，用核酸酶处理以消化Vero细胞的核苷酸，使用500-kDa膜，正切流微过滤和透析过滤纯化疫苗原液，加入乳糖和人血白蛋白做保护剂，制成黄热乙脑嵌合病毒Vero细胞减毒活疫苗。
Vero细胞DNA<0.1ng/人份（0.5ml）,Vero细胞库、嵌合病毒种子库、疫苗经检测无外源因子[18-19]。
黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗对小鼠脑内无致病力，以2.0、3.0、4.0、5.0LgPFU的剂量，猴皮下接种。
所有猴都出现低病毒血症（平均滴度高峰，1.7～2.1LgPFU/ml，平均持续时间，1.8～2.3天），6～10天开始出现中和抗体，到第30天各剂量组的中和抗体反应相似，对同源毒株中和抗体滴度较异源毒株高。
在第54天，用5.2LgPFU病毒量的强毒株攻毒，免疫猴都没有引起病毒血症、脑炎病征和轻微的残留脑部损害。
而对照组，则出现病毒血症、临床脑炎病征和严重的组织病理损害。
攻毒后，免疫猴的血清和脑脊髓液中的中和抗体显著升高（≥4倍）。
黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗对猴的神经毒力较黄热病17D株减毒活疫苗小，而两者有相似的免疫原性和保护效果[17]。
黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗Ⅰ期临床观察：
一个36例随机、双盲与黄热病毒17D株减毒活疫苗的对比观察，副反应轻微，采用4和5LgPFU两个剂量组。
在试验者体内只有短期、低水平的病毒血症，中和抗体阳转率都是100%，中和抗体水平高剂量组较低剂量组高，黄热病17D株减毒活疫苗对黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗没有免疫干扰作用，两者安全性和免疫原性相似[18]。
黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗Ⅱ期临床观察：
99例双盲试验，黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗和黄热病17D株减毒活疫苗，都显示良好的耐受性，接种组间副反应没有差异，都出现短暂和低滴度的病毒血症。
87例中82例（94%）接种黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗（1.8～5.8LgPFU）都出现中和抗体。
30天后，接种第二针，没有加强免疫的作用，先前黄热病17D株减毒活疫苗的免疫不干扰黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗的免疫。
9个月后，对黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗免疫者，用乙脑北京-1株鼠脑纯化灭活疫苗诱发了免疫回忆。
嵌合病毒技术，还可用于开发登革和西尼罗病毒等其它病毒疫苗[19]。
黄热乙脑嵌合病毒减毒活疫苗仍存在两个问题：
1）接种后的一段潜伏期，有个别38℃以上高热病例，观察人员认为可能与黄热病毒17D株本身毒力较高有关。
2）抗体应答对嵌合体病毒株很好，但对其它乙脑野毒株有的较好，有的很低，抗体谱不广。
综上所述，新一代乙脑疫苗的研制情况归纳如表2。
表2新一代乙脑疫苗的比较
序号
毒株名称
制备的细胞基质
用于疫苗的毒株代次
滴度
（LogPFU/ml）
收毒时间（天）
纯化的方法
目前的进展
1
P3
Vero
10代以内
>7.0
不祥
鱼精蛋白处理，离心
试生产证书
2
SA14-14-2
Vero
不祥
7.2
3、6
鱼精蛋白处理，凝胶过滤
动物试验
3
SA14-14-2
PDK-8※
Vero
6
7～8
3、5、7、9
鱼精蛋白处理，离心
完成动物实验
4
北京-1
Vero
5、10
9.0左右
4、5
离心，层析
Ⅰ期
5
黄热乙脑嵌合病毒
Vero
5
>8.0
5
核酸酶处理，透析过滤
Ⅰ、Ⅱ期
※：
SA14-14-2PDK-8，乙脑SA14-14-2株在原代狗肾细胞（PDK）传8代的病毒。
虽然目前已有乙脑SA14-14-2株原代地鼠肾细胞减毒活疫苗和北京-1株鼠脑灭活纯化疫苗在广泛应用，但几种新的疫苗都在开发中。
随着各种疫苗广泛的应用，人们认识的逐步深入，最后总有一种乙脑疫苗由于其安全、有效、经济，而成为预防流行性乙型脑炎的有力武器。
编审者：
李忠云
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