微生物室sop文件.docx
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微生物室sop文件
文件sop微生物室．
细菌室操作规程
鹤壁市中医院检验科
第一篇细菌室操作程序文件
1.细菌室人员岗位职责……………………………………………………..1
2.标本采集及保存要求………………………………………………………3
3.显微镜检查法操作规程……………………………………………………5
4.细菌室标本操作流程………………………………………………………6
5.细菌的形态检查操作规程…………………………………………………8
6.细菌生化反应鉴定及其它实验操作规程………………………………11
7.细菌的接种与培养方法操作规程………………………………………17
8.支原体培养、鉴定及药敏操作规程……………………………19
9.血液感染病原体检验操作规程…………………………………………20
10.中枢神经系统感染病原体检验操作规程………………………………22
11.下呼吸道感染病原体检验操作规程……………………………………24
12.尿路感染病原体检验操作规程…………………………………………26
13.消化道感染病原体检验操作规程………………………………………29
14.脓汁及病灶分泌物细菌学检验操作规程………………………………31
15.生殖系统标本的处理……………………………………………………33
16.抗菌药物敏感试验………………………………………………………34
第二篇医院微生物感染控制检测
监果效菌灭毒消17.
细菌室操作规程细菌室操作程序文件
测……………………………………………………….37
18.环境卫生学监测………………………………………………………….38
19.采样及检查原则…………………….………….………………………..39
20.各部位的消毒…………………………………………………………….43
细菌室人员岗位职责
1、上班后先搞好室内卫生、核查各个培养箱、冰箱的工作温度是否在设定的范围内，并做好记录。
检查各种仪器工作是否正常，做好记录。
2、接收样本：
核对各样本号与申请单联号是否一致，如不一致马上与病房联系以便作出相应的处理，如退单或重送样本等，并做好联系情况的记录。
核查各送检样本是否符合要求。
①痰液样本：
先看外观、再直接涂片镜检，以白细胞≥25个/低倍镜视野，而上皮细胞≤10个/低倍镜视野，为合格痰液。
②无菌体液样本：
检查各种无菌体液样本的盛放器皿是否符合要求。
③容易干燥的样本：
对一些容易干燥的样本如大便、咽拭子、脓液拭子、泌尿生殖道拭子等是否已经干燥。
对不符合要求的样本必需与临床联系，以便作出相应处理，方法如联号不符的样本，做好记录。
对符合的样本进行原始单的登记。
3、样本编号：
对符合的样本作出编号，普通细菌培养：
痰液、咽拭子、血液增菌培养、尿液、胸、腹水、脑脊液、胆汁、脓液、泌尿生殖道拭子、大便致病菌培养。
在各种培养基上及申请单上编号的同时均需明确标明接种日期。
4、样本接种：
①血液、骨髓、腹水、关节液等：
增菌培养瓶；
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②痰液、咽拭子：
血平板、麦康凯平板；
③尿液：
血平板、麦康凯平板；
④大便致病菌：
SS平板；
⑤脑脊液：
血平板、巧克力平板；
⑥分泌物的淋球菌培养接种：
淋球菌专用平板；
⑦支原体培养+药敏：
按说明书接种支原体专用培养基。
对以上接种样本的当前编号应记录于登记本上。
此外对痰、脓液、脑脊液等在接种的同时应对其沉渣进行革兰染色，如有细菌和或何种细菌为主立刻通知临床，并做好记录。
5、查对昨天移种平板申请单及原始登记本，确定标本移种是否正确。
观察血液增菌培养瓶，如发现有细菌生长，马上涂片革兰染色，将细菌的染色特性及形态报告给临床，并做好记录，同时进行移种。
6、观察平板，挑取可疑菌落涂片革兰染色，并做好细菌的鉴定与药敏实验工作。
7、检查各种培养基及试剂的库存量，做好需配制培养基或购买试剂的交班工作。
8、定期做好本室所用鉴定和药敏试条的质控，做好记录。
9、每天必须消毒平板、基础培养基等用于常规医院感染监测，另外根据具体情况即时准备好各种中和剂、无菌瓶等，对48小时的空气培养出报告，同时注意是否有致病菌、菌落数是否超标。
10、工作完成后注意对工作台面进行消毒、室内进行消毒。
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标本采集及保存要求
1、总则：
用于细菌培养的标本在收集时应注意严格无菌操作和及时送检，检测后标本应妥善保存。
2、临床标本的采集
2.1、下呼吸道分泌物（痰液）
令患者早上起床后用清水濑口，不要刷牙，立即从下部呼吸道咳出第一口痰，吐在无菌塑料痰盒中，及时送检。
2.2、尿液（中段尿）
护理人员协助采取中段尿约3ml入无菌塑料盒中，及时送检。
2.3、粪便
取有粘液、脓血部分的粪便置无菌塑料盒中及时送检。
2.4、眼、耳、鼻、喉拭子
将棉拭子沾取少许无菌生理盐水（如沾取的太多，可在无菌生理盐水瓶壁上挤去多余的水份），然后采取可疑部位的分泌物，倒悬于无菌塑料盒中，及时送检。
2.5、脓液
用沾有生理盐水的棉拭子沾取脓液，要尽量多取一些，然后将棉拭置于无菌塑料盒中，及时送检。
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2.6、血液
2.6.1、凡怀疑菌血症和败血病的患者，采血培养时，应尽量在未使用抗菌素前采血，如已使用抗菌素，应尽量选择抗菌素在体内浓度最低时采血，应在病人第二次使用抗菌素之前采集血培养标本。
当然在病人发热或寒颤时采集也可。
2.6.2、成人每次采血5～10m1，小儿采血3～5ml。
2.6.3、严格消毒病人采血部位和血培养瓶口，抽一定量血液后，无菌注入血培养瓶内，轻轻摇匀。
2.6.4、从抽血到接种入瓶，动作要快，防止血液凝固，同时要及时送检。
2.7、穿刺液
胸腹水、心包液、关节腔液、鞘膜积液，严格无菌抽取后，注入含肝素抗凝的无菌试管中，轻轻颠倒试管10余次，使肝素与穿刺液混匀达到抗凝的目的，或直接无菌注入血培养瓶内及时送检。
2.8、胆汁
由专科医生以无菌方法取引流液10m1注入无菌塑料盒内。
2.9、脑脊液
以无菌方法取脑脊液3～5ml，置无菌试管内，常温保存送检，如只做培养可直接无菌注入血培养瓶内，及时送检。
2.10、生殖器官标本
阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无菌塑料盒内送检。
如疑为淋病奈瑟菌感染，做培养检查时，采集的标本应床旁接种并及时放入孵箱培养。
2.11、烧伤标本
以无菌棉拭子直接采取多个部位创面的脓汁分泌物放入无菌塑料盒中。
2.12、支原体（解脲、人型）培养+药敏的标本采集
2.12.1、支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应尽快接种支原体运送培养基送检。
2.12.2、男性：
用细的无菌棉拭子沾取无菌盐水少许深入尿道口内2～4
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2.5cm。
3、临床标本的保存
细菌室标本原则上要求及时送检、及时处理，不得保存。
显微镜检查法操作规程
显微镜检查是细菌鉴定工作中的一重要手段，有助于细菌的初步鉴别，同时对下一步鉴定工作起着重要的指导作用。
有时通过形态学检查可得到初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。
显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。
1、不染色标本的检查：
不染色标本主要用于检查细菌的动力及运动状况。
1.1、压滴法：
用接种环取细菌悬液2环，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻片，于高倍镜下观察。
制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。
1.2、悬滴法：
取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各1块，将凹孔四周的平面上涂上一层凡士林，取一环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘粘紧。
镜下观察时先低倍后高倍，不可压碎盖玻片。
有动力的细菌可见细菌从一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。
螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野显微镜观察其形态、活动。
2、染色标本检查法：
通过对标本的制片及染色，能观察细菌的形态、大小、排列、染色特性以及荚膜、芽胞、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步5
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鉴定。
2.1、快速革兰染色法
2.1.1、操作见试剂说明书
2.1.2、结果：
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
2.1.3、注意事项：
染色关健在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度，菌龄为18～24小时为佳。
2.2、抗酸染色法
2.2.1、操作见试剂说明书
2.2.2、结果：
抗酸杆菌呈红色。
2.2.3、注意事项：
每一张玻片只能涂一份标本且不能在染色缸中染色，以免造成不同标本间的交互污染从而导致阴阳性结果混淆，至无红色液体流下。
3、墨汁负染镜检：
背景着色而菌体不着色的染色法，用以观察新型隐球菌的宽厚荚膜等。
菌室标本操作流程
1、标本的接受
1.1、标本接受的时间：
原则上全天任何时间均可。
1.2、标本的接受：
接受标本者要认真核对标本的数量、标本与检验单要求是否相符以及标本的质量等。
1.3、把接受的标本编号。
2、临床标本的接种
2.1、检验目的是细菌培养+药敏试验。
各临床标本的培养基选择如下：
2.1.1培养基的选择
培养基标本类型
血培养瓶血
中段尿血平板、麦康凯平板脑脊液血平板、巧克力平板穿刺液血平板、麦康凯平板6
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血平板、麦康凯平板胆汁呼吸道标本血平板、麦康凯平板SS平板粪便标本
血平板、麦康凯平板病灶分泌物2.1.2、生殖器标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板，操作如下：
淋球菌培养接种淋球菌平板；念珠菌培养接种沙保罗培养基；支原体培养则按《支原体培养的操作规程》操作；作普通细菌培养，则接种血平板和巧克力平板；衣原体抗原检测的按《衣原体抗原检测的操作规程》进行检验。
2.2、接种的方法：
标本做分区划线。
2.3、检验目的为找抗酸杆菌的按《找抗酸杆菌的操作规程》进行检验。
3、所接种的平板必须写上标本的编号和接种的日期，然后根据要求进行培养。
4、标本的培养条件、温度、时间
培养条件、温度、时间平板
24小时37—℃、血平板18—孵箱、3524小时℃、18—巧克力平板35孵箱、—37小时18—淋球菌平板24孵箱、35—37℃、36小时沙保罗平板24—31℃、—28孵箱、小时18—2437孵箱、35—其他的平板℃、5、根据生长在平板上的细菌菌落形态、菌落涂片、染色、镜检等来综合判断细菌形态和染色性质，按各属鉴定的作业指导书进行各菌属的常规鉴定及药敏试验。
6、结果的报告
确认细菌鉴定及药敏试验结果后，进行检验验单结果报告的存盘、打印。
7、对各类细菌培养标本除特殊要求外，我室一般操作完后按要求进行无害化处理。
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细菌的形态检查操作规程
1、不染色标本的检查
压滴法和悬滴法。
主要用于检查生活状态下的细菌的动力及运动状况。
将特制好的标本置于显微镜载物台中央，先以低倍镜观察，再用高倍镜观察。
结果：
有鞭毛的细菌呈穿梭似流星状运动（有明显的方向性）；无鞭毛的细菌呈布朗运动（只在原地颤动而无位置的改变）。
2、细菌染色标本的检查
染色的第一步是制作涂片。
菌落涂片时，先取生理盐水l滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。
涂片时必须注意应轻轻操作。
猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。
制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。
将固定后的涂片进行染色。
2.1、革兰染色
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本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。
染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和革兰阴性（红色）两类。
2.1.1、试剂
（1）结晶紫溶液
A液：
结晶紫2g
95％乙醇20ml
B液：
草酸铵0.8g
蒸馏水80ml
需在用前24h将A液、B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。
（2）碘液
碘lg
碘化钾2g
蒸馏水300ml
碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。
最后补足水量。
也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。
（3）脱色液：
95％乙醇。
（4）复染液
A．贮存液：
沙黄2.5g
95%乙醇100ml
B．应用液：
A液10ml
蒸馏水90ml
染色方法：
（1）．涂片经火焰固定，加结晶紫液染1min，清水冲去染液。
（2）．加碘液染1min，水洗。
（3）．加脱色液，不时摇动约10～30s，至无紫色脱落为止，水洗。
（4）．加复染液，染30s，水洗。
（5）．干后镜检。
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2.2、抗酸染色
抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。
染厚涂片时，须掌握复染色时间。
如果背景过深，影响镜检。
奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。
试剂
（1）、石炭酸复红溶液
碱性复红乙醇饱和溶液10ml
5％石炭酸溶液90ml
（2）、脱色剂
浓盐酸3ml
95%乙醇97ml
（3）、复染液（吕弗勒美蓝液）
美蓝乙醇饱和溶液30ml
10％氢氧化钾0.1m1
蒸馏水100ml
染色方法
（1）、涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾，持续约5min（若染色奴卡菌需要加长时间），水洗。
（2）、加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。
（3）、加复染液，染0.5～lmin，水洗。
（4）、干后镜检。
分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。
注：
奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2％硫酸水溶液。
2.3、墨汁荚膜染色
用于观察菌体有无荚膜结构，借此鉴定某些菌，如新型隐球菌。
传统的方法是用印度墨汁，但目前国内无售。
常规工作可以用墨汁或墨水代替，但应注意颗粒不能太粗，否则影响观察结果。
有人用5％黑色素水溶液做染料，效果较好。
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试剂
印度墨汁或5％黑色素水溶液。
染色方法
将标本与1滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本混合液变薄。
在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。
找到后，转换高倍镜确认。
细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程
1、氧化-发酵试验（O-F试验）
原理：
细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。
可以进行无氧降解的，称为发酵型（发酵型细菌在有氧无氧的条件下均能分解葡萄糖）。
不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。
方法：
将待检细菌同时穿刺接种两支Hugh-Leifson培养基，其中一支培养基滴加无菌石蜡（或其它矿物油），高度不少于lcm。
35℃，24小时或更长。
结果：
培养基变黄表示细菌分解葡萄糖产酸，两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均均产酸为发酵型。
若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。
应用：
主要用于肠杆菌科细菌与非发酵细菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者均为氧化型或产碱型。
也可用于葡萄球菌与微球菌问的鉴别。
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2、β-半乳糖苷酶（ONPG）试验
原理：
细菌产生半乳糖苷酶，分解邻-硝基酚β-D-半乳糖苷（无色）生成邻-硝基酚（黄色）。
结果：
菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20-30分钟内显色。
应用：
主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。
3、七叶苷水解试验
原理：
有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物。
结果：
培养基变黑为阳性，不变色为阴性。
应用：
主要用于D群链球菌与其它链球菌的鉴别。
前者为阳性，后者为阴性。
也可用于革兰阴性菌与厌氧菌的鉴别。
4．甲基红试验
原理：
某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH值降至4.5以下，加入甲基红呈现红色为阳性。
若细菌分解葡萄糖产生的酸少，或产生的酸进一步转化为其他产物，则培养基pH值仍在6.2以上，加入甲基红呈现黄色为阴性。
结果：
呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性。
黄色为阴性。
应用：
主要用于鉴别大肠杆菌与产气杆菌，前者阳性，后者阴性。
此外肠杆菌科中变形杆菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属和志贺菌属等阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。
5、VP试验
原理：
某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，氧化为二乙酰，与精氨酸中的胍基作用生成红色化合物。
结果：
在数分钟内出现红色为阳性，如无红色出现且于35℃4h后仍如故者即为阴性。
应用：
本试验与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。
6、吲哚（靛基质）试验
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原理：
细菌分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚（靛基质），加入对位二甲基苯甲醛生成红色玫瑰吲哚。
结果：
于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。
应用：
主要用于肠杆菌科的鉴定。
6、尿素分解试验
原理：
具有尿素酶（尿酶）的细菌，分解尿素产生大量的氨，培养基变碱。
结果：
培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变色为阴性。
应用：
主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定，奇异变形杆菌、普通变形杆菌为阳性，克雷伯菌属、枸椽酸菌属、雷氏普罗威登菌和摩根摩根菌为阳性。
7、苯丙氨酸脱氨酶试验
原理：
某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，加入FeCl生成绿色化合物。
3结果：
出现绿色为阳性，应立即观察结果，延长会引起退色。
应用：
主要用于肠杆菌科的鉴定，变形杆菌属、普罗威登斯菌和摩根摩根菌均为阳性。
肠杆菌科其它菌均为阴性。
8、氨基酸脱羧酶试验
原理：
具有氨基酸脱羧酶的细菌，分解氨基酸脱羧生成胺和CO使培养2基变碱，指示剂改变颜色。
结果：
对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性。
应用：
主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
9、氧化酶试验
原理：
氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。
具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二氨氧化。
生成有色醌类化合物。
结果：
细菌在与试剂接触10秒内呈紫色为阳性。
为保证结果准确性，应作阴、阳性对照。
应用：
主要用于肠杆菌科与假单胞菌的鉴别，前者为阴性。
后者为阳性。
10、过氧化氢酶试验（触酶试验）
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原理：
具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
试剂：
3％过氧化氢溶液
方法：
取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3％过氧化氢于不含血液的细菌培养基中，立即观察结果。
结果：
有大量气泡产生为阳性。
不产生气泡为阴性。
应用：
革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均阳性。
而链球菌均阴性。
1l、硝酸盐还原试验
原理：
包括两个过程：
一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚哨酸盐和氨。
再由氨转化为氨基酸和细菌内其它含氮化合物。
二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的受氢体，能使硝酸盐还原的细菌从哨酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其它还原性产物。
结果：
出现红色为阳性。
若加入试剂后无颜色变化反应，可能是①硝酸盐没有被还原，试验阴性。
②硝酸盐被还原为氨和氮等其它产物而导致假阴性，这时应加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。
若仍不产生红色，表明为试验为假阴性。
应用：
本试验在细菌鉴定中应用广泛。
12、氧化酶（改良法）试验
试剂：
四甲基对苯二胺（TMPD）6.0g
二甲基亚砜（DMSO）100.oml
溶解TMPD于DMSO中，置于避光玻塞瓶中，可在室温中保留几个星期。
方法：
被检菌株移种于7％羊血琼脂上，30℃需氧条件下孵育15～18h，刮取菌落涂布于无色滤纸片上，加l滴上述试剂，阳性者在2min内呈深蓝色。
若被测菌株移种在蛋白胨酵母浸出液琼脂上，至少孵育3天以上，才可检测，阳性反应5～10min出现。
13、CAMP试验
原理：
B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的β-溶血素溶解14
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红细胞活性，因此在两菌的交界处溶血力增加。
出现矢形（半月形）的溶血区。
结果：
在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性
应用：
在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性。
14、O/129抑菌试验
原理：
O/129（二氨基喋啶）对弧菌属、邻单胞菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌无抑制作用。
方法：
将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取O/129纸片（含药40ug）贴于平板上，35℃，18~24h，观察结果。
结果：
出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药
应用：
弧菌属、邻单胞菌属对O／129敏感，而气单胞菌属耐药
15、杆菌肽试验
原理：
A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其它链球菌绝大多数对其耐药。
16、奥普托欣试验
原理：
几乎所有的肺炎链球菌对Optochin敏感，而Optochin对其它链球菌则无抑制作用
17、．HS试验2原理：
有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱胺酸、半胱胺酸）产生硫化氢，硫化氢遇到铅或亚铁离子，则生成黑色的硫化铅或硫化铁。
结果：
培养基变黑为阳性，不变为阴性。
应用：
主要用于肠杆菌科属或种的鉴定。
18、触酶试验（过氧化氢酶试验）
试剂：
3%H0溶液，置棕色瓶内于4℃阴暗处保存。
22方法：
先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液1～2滴。
静置之，lmin内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性。
19、葡萄球菌凝固酶和凝聚因子试验
葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。
试管法凝固酶试验称为葡萄球菌凝固酶，玻片法为检测凝聚因子。
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