生物技术实验报告.docx

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生物技术实验报告

生物技术实验报告

篇一：

生物技术实验报告

　　组别：

第六组

　　组员：

苏琳伟、陈治、陈家和、陈硅

　　报告人：

陈硅

　　学号：

10349069

　　词汇&释义：

　　Parafilm封口膜

　　Chloroform氯仿（三氯甲烷）

　　Isopropanol异丙醇

　　DEPC焦碳酸二乙酯

　　TRIZOLamono-phasicsolutionofphenolandguanidineisothiocyanate

　　Phenol苯酚

　　isthiocyanate异硫氰酸胍

　　MCSmultiplecloningsite（polycloningsite）

　　注：

MSC是DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。

能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

　　实验任务：

　　1.从猪肌肉纤维中提取RNA;

　　2.2对RNA上EGFP基因密码子片段进行RT-PCR扩增;

　　3.将经RT-PCR技术扩增的cDNA与插入载体质粒，并将其转化入大肠杆菌进行克隆；

　　4.从大肠杆菌中提取含目的基因的载体质粒。

　　实验目的:

1.掌握提取纯化总RNA的原理和技术；

　　2.掌握RT-PCR原理和技术；

　　3.掌握TA克隆原理和技术。

　　实验原理：

　　A．总RNA提取和纯化

　　RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。

但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。

因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。

　　Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，是一种由苯酚和异硫氰酸胍组成的单相溶液它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

　　无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品最大使用量（1mlTrizol），动物组织（50mg），植物组织（100mg），丝状真菌（100mg），动物细胞（5×106～1×107），

　　酵母（1×107）。

　　TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。

例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7kb和15kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5kb（28S）和~2kb（18S），低分子量RNA介于0.1和0.3kb之间（tRNA,5S）。

当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8。

　　Rnase污染的10大来源

　　1：

手指头2：

枪头3：

水/缓冲液4：

实验台面5：

内源Rnase6：

RNA样品7：

质粒抽提8：

RNA保存9：

阳离子（Ca,Mg）10：

后续实验所用的酶

　　RNA提取须杜绝外源酶的污染，实验时应注意

　　一．严格戴好口罩，手套。

　　二．实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。

　　三．实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。

　　RNA纯化流程图

　　（附：

上清不含DNA的原因：

　　1.因为细胞中存在DNA酶，在提取之前细胞破碎的时候没有加DNA酶抑制剂，DNA已经被分解了。

　　2.上层水相，PH5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。

而当pH接近中性时，DNA就会溶解在水相，（导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量）

　　RNA纯化要求

　　1纯化后不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用物质

　　2排除有机溶剂和金属离子的污染

　　3蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度

　　4排除DNA分子的污染

　　B．

　　RT-PCR

　　一、知识背景：

　　1、基因表达：

DNARNAProtein

　　单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存

　　活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。

因此单拷贝基因的mRNA表达水平对

　　于其功能水平的调控是非常重要的。

　　2、PCR技术（olymerasechainreaction）：

即聚合酶链式反应。

　　在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工

　　合成的引物序列决定。

反应分三步：

　　a、变性：

通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；

　　b、退火：

将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

　　c、延伸：

在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘3’方向延伸。

　　以上三步为一个循环，如此反复。

　　3、逆转录酶和RT-PCR

　　逆转录酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下

　　三种活性：

　　1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：

以RNA为模板合成cDNA第一条链；

　　2、Rnase水解活性：

水解RNANA杂合体中的RNA；

　　3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：

以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.

　　二、RT-PCR的准备：

　　1、引物的设计及其原则：

　　1）引物的特异性决定PCR反应特异性。

因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。

　　在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及

　　可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。

尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白

　　表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。

　　2）引物设计原则的把握：

引物设计原则包括

　　a、引物长度:

一般为15～30bp，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超

　　过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。

　　b、碱基分布：

四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单

　　一碱基。

GC含量（Tm值）：

40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。

　　c、3‘端要求：

3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成

任何二级结构的可能。

　　末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能

　　避免连续出现两个以上的T。

　　d、引物自身二级结构：

引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。

　　e、引物之间的二级结构：

两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。

f、同源序列：

引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。

　　g、5’端无严格限制：

5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。

还可

　　以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。

　　根据实验目的选择适当的引物。

常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。

　　二步法RT-PCR反应流程图示

　　一部法RT-PCR反应流程图示

　　C．TA克隆

　　a质粒的基本特性

　　1．质粒的复制

　　通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。

在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。

在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点。

图3-1是其复制其始示意图。

　　在复制时，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并与DNA形成杂交体；而后RNaseH切割前RNAⅡ，使之成为成熟的RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。

形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二级结构，同时Rop增强RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。

削弱RNAⅠ和RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有pMB1或（ColE1）复制子的拷贝数。

　　图带pMB1（或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。

篇二：

生物技术实验报告要求

　　实验报告作业设计要求

　　1.根据运作流程绘制：

一幅能够年产100万株以上试管苗的组织培养各室详细布局平面图（分层多幅图或分解图）；一幅（版）设计符合生产规范（运作流程）、合理美观、实用又能持续发展的现代化植物育苗工厂平面布局图。

　　2.在第一幅图的下方列出组培所需的仪器、设备的名称，培养基主要物品。

　　3.根据规模大小设计具有可持续发展理念的，工作方便，减少污染，节省能源，安全，且具科学和美学有机结合效果的观赏性花园式工厂。

　　4.要标明题目、图示、坐标方向、班级、学号。

　　5.不强求按比例，也可用电脑绘制，有三维电脑绘制水平的更好。

　　6.实验报告一律用福建农林大学实验报告纸。

（一）植物组织培养实验室各室布局（生产车间）运作流程：

　　1.洗涤室药品室化学室（配药、灭菌室缓冲区（包括过道、无菌接种室无菌培养室（设计人工光照室、自然光源节能培养室、暗室等）；

　　附带办公室，资料室，细胞学实验室，卫生区等。

　　2.列出组培所需的仪器、设备的名称。

初步计算各种仪器设

　　备台数总功率、各设施统计用电总量，以供基建部门设计参考。

（二）现代化植物育苗工厂设计：

　　1.主体部分（工厂化育苗运作流程）：

　　原种采集圃（品种园）（楼）保

　　试管

　　中间试验区销售展示厅（场、棚）。

　　2.配套布局部分：

　　①办公室、资料室、大门（包括门卫值班室）；

　　②仓库（分类：

实验室用品、农资生产材料、肥料、农药等）；

　　③游客习作区（科教区、休息亭）；

　　④食堂、宿舍、卫生区；

　　⑤绿化（包括厂内外、道路的园林设计）；

　　⑥其它（文体、娱乐区等）

篇三：

生物技术实验报告.

　　显微镜的使用及观察动物基本组织

　　一，实验目的：

　　1，显微镜工作原理

　　2，生物量级及系统过程

　　3，动物基本组织

　　4，显微镜的使用，基本组织观察

　　二，实验原理：

　　显微镜的光学系统主要包括物镜,目镜，反光镜和聚光器四个部分。

标本经过物镜与管镜放大后，形成放大倒立的实像。

实像经目镜再次放大后，形成放大的虚像。

　　三，动物与器材：

　　实验器材：

13张组织标本

　　实验设备：

显微镜

　　四，方法与步骤：

　　1，实验分组

　　2，实验原理讲解

　　3，实验报告要求

　　4，显微镜操作/观察

　　⑴安放显微镜

　　⑵检查

　　⑶对光

　　⑷调焦

　　⑸低倍镜观察

　　⑹高倍镜观察

　　5，观察气管的假复层纤毛柱状上皮组织

　　五，实验结果：

　　六，实验结论：

　　假复层纤毛柱状上皮由柱状细胞、棱形细胞和锥体形细胞组成。

柱

　　状细胞可达游离面，细胞核的位置较高，细胞向基底部伸入时，胞体逐

　　渐变细；锥体形细胞紧靠基膜，细胞核位置较低；梭形细胞位于柱状和

　　锥体形细胞之间，细胞核位于中部，基底部附着于基膜。

在柱状细胞的

　　游离面附有能摆动的纤毛。

假复层纤毛柱状上皮主要分布在呼吸道内表

　　面。

在假复层纤毛柱状上皮细胞之间有分泌粘液的杯状细胞，分泌的粘

　　液能粘着并清除灰尘和细菌等异物，借助于纤毛有节律性的摆动，将含

　　有灰尘、细菌的粘液排除至喉部。

此外，粘液还有湿润干燥空气的作用。

　　七，问题解答：

　　1，如何制作假复层柱状纤毛上皮细胞切片？

　　⑴猪气管横切片

　　⑵Bouin氏夜固定

　　⑶石蜡包埋

　　⑷苏木素—伊红染色

　　2，普通光学显微镜由那几个系统构成？

　　机械系统，光学系统，光源系统

　　3，为什么称为假复层？

　　假复层纤毛柱状上皮的细胞高矮不等，细胞核的位置参差不齐，每个

　　细胞的基底部都附于基膜上，却又不是所有细胞都伸到腔面，这样细

　　胞核高低不一，才造成了“复层”的假象，所以称假复层。

　　八，参考文献

　　1，食管壁内支气管囊肿的临床分析-临床肺科杂志-XX年第9期

　　2，《动物生物学实验指导》黄诗笺主编高等教育出版社