最新端粒复制.docx

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最新端粒复制

端粒复制

端粒的复制

一、双链DNA复制末端的丢失

对于所遇的生物而言DNA的复制永远是遗传的关键步骤。

而对于双链DNA而言，其复制方法是半保留复制。

即复制所形成的新的DNA分子中，保留了原来亲本的DNA双链分子中的一条单链。

并且合成是有方向的只可以从5’到3’的方向合成。

所以在合成中就形成了先导链和滞后链，而滞后链的合成中会形成岗崎片段，而这些岗崎片段的合成都需要一种特别的RNA聚合酶的作用下先合成一小段RNA“引物”，由此提供一个3’—OH’端。

只有这样，DNA聚合酶才能够在“引物”的帮助下延伸复制。

当链复制延伸反应启动后，这些RNA“引物”将会被除去，而中间的断层却因为其5’端方向的DNA片段的末端有3’—OH’端，使DNA聚合酶可以补齐断层。

但是末端的DNA引物的5’端方向没有DNA片段提供3’—OH’端，这样就使得在新链的最末端留下了一段无法填补的空缺。

这样没复制一次DNA的末端就会愈来愈短，甚至产生遗传信息的丢失（见图一）。

这就是最早人们所发现的DNA末端复制难题，也是人们开始研究末端复制的开端。

但是实际上，生物在繁衍的过程中并不没有出现这种遗传信息不断丢失的问题，所以人们开始研究生物体是如何来回避这个问题的。

1.原核生物的DNA末端复制的方法

首先原核生物的遗传信息量相对真核生物来说要小的多，而且其遗传信息的载体仅仅是一个DNA环状分子。

这种DNA的构型就决定了原核生物根本不存在DNA末端复制问题。

而且综合DNA末端丢失的原因和图一，可以很容易的想象出当模板链是环状时，为什么原核生物的DNA复制不会出现末端丢失。

2.病毒DNA（或RNA）的末端复制的方法

病毒是一种非细胞形态的生命体，并且其遗传物质可以是双链的DNA，单链的DNA还可以是单链或者是双链的RNA这四类，所以其复制终止的方式也多种多样

。

对具有环状DNA分子的病毒而言,其复制终止的方式与原核生物基本相同。

原核病毒,如T4和T7噬菌体等的DNA也是线性分子,其DNA两端各有一段重复的数百个核甘酸,称为末端冗余。

这意味着两个子代分子中的单链末端可以互补,多余的部分可以被DNA酶除去。

因此,它们采用病毒基因组末端互相融合形成多连体的方法,利用相邻病毒DNA新链的3’—OH’端为引物复制自身,从而达到完全复制的目的。

动物病毒多数也是线性分子,在长期的进化过程中,它们选择的末端复制策略与上述几类原核生物又不尽相同。

细小病毒在其单股DNA末端有一正向和反向的重复序列,这一回文片段能在末端形成鬓夹形结构,使得合成新链折回补齐5’端空缺。

腺病毒则利用一种特殊的蛋白质与5’端共价连接。

这种特殊蛋白质被称作末端蛋白质,简写为TP。

TP以其丝氨酸轻基通过磷酸二醋键与5’端的胞嗜陡共价连接。

参与腺病毒DNA复制起始的是末端蛋白质的前体物,简写为pTP。

pTP不但作为蛋白质引物解决了腺病毒DNA的复制起始问题,而且这种引发方式避免了线形DNA在复制结束时所面临的5’末端隐缩问题。

除腺病毒外,枯草杆菌噬菌体Ф29和脊髓灰质炎病毒（一种RNA病毒）,也采用这种借助蛋白质介入的方法。

痘病毒和疤疹病毒则和T4,T7噬菌

体一样,都是以多连体的形式达到完全复制的。

3.真核生物的DNA末端复制的方法

在真核生物中，端粒的丢失在每次复制中是不可以避免的，因此在真核生物中，就有了一套自己的体系去处理这个问题，那就是在端粒酶的作用下进行端粒的复制。

下面我们将更详细的去解释这个问题。

二．真核生物DNA端粒的复制工作研究的发展过程

20世纪30年代，遗传学家McClintock和Muller分别在玉米和果蝇中发现损伤断裂后的染色体末端之间极易发生连接，从而形成各种类型的染色体畸变，如末端融合形成环状体或形成双着丝点染色体．但染色体的天然末端似乎从来不与染色体断裂产生的那种末端连接，天然末端之间也不结合，就像有一顶“帽子”那样维持着染色体末端的稳定．于是Muller提出位于染色体两端的片段在细胞里具有重要的作用，并命名它为端粒（Telomere）

，这是由希腊语“末端”（Telos）及“部分”（Meros）组成的．

20世纪70年代，Blackburn利用四膜虫（Tetrahymena）进一步揭示了端粒的初步结构，发现它是由几个核苷酸（富含G）组成的DNA重复片断，重复的次数由几十到数千不等．1972年，Watson发现了这样一个问题，即DNA多聚酶是不能够复制线性染色质的全部的，由于在末端缺少5′端的引物，DNA多聚酶将不能完成最后的复制工作，而留下一个单链的间隙．如果这一间隙不能被填充的话，染色体DNA将失去这一DNA片断，这样的话，每经过一次复制、分裂，染色体就将丢失一部分的端粒结构，直至影响到与端粒相邻的一些重要基因．因此科学家们考虑是否存在着一种不同于DNA多聚酶的酶来完成这一工作．

1984年，Greider和Blackburn发现将一段单链的末端寡聚核苷酸加至四膜虫的提取物中后，端粒的长度延长了，这说明确实有这样一种酶存在，将它命名为“端粒酶”（Telomerase）

．进一步的研究揭示了端粒与端粒酶在细胞的生长及肿瘤预防和防治中有非常重要的意义．下图图二为四膜虫DNA端粒合称示意图。

三．.端粒及端粒酶

1.端粒的概念

端粒是真核细胞染色体线形DNA分子末端具特殊结构的序列。

它是一段十分简单、多次重复的DNA序列和端粒结合蛋白组成。

序列的主要特征是富含G和T,如人和其他脊椎动物的端粒重复单位为AGGGTT;四膜虫的重复单位为GGGGTT和GGGGTTTT等,它们多次重复长度可达几百到几千碱基对。

端粒DNA的序列具有一定的取向特征,即在双链DNA末端,富含G的一股链总是由5’向3’末端延伸,并比互补的富含C链长12至􀀂16个核苷酸

。

真核生物染色体末端的端粒结构,由于富含G,且在3’末端形成一段单链突出序列,因此在正常生理条件下,可通过G—G间非标准配对,在突出的3’端形成分子内G—四联体（四股螺旋结构）,也可以由两个DNA分子或染色体彼此连接成一个局部的分子间四联体

（图3）。

图3􀀁G􀀂四联体螺旋结构

（a）分子内四联体螺旋􀀁（b）双分子间四联体螺旋􀀁

（c）两个DNA分子或染色体末端连接起来而形成局部四螺旋结构。

2.端粒酶的概念

端粒酶是一种能将真核生物染色体末端DNA端粒DNA加以延伸的酶．它是一种核酸蛋白质复合物．目前认为端粒酶是由端粒酶RNA组分（telomeraseRNA，TR），端粒酶相关蛋白和端粒酶催化亚基（telomerasereversetranscriptase，TERT）三部分组成的蛋白质复合物（6，7）．

端粒酶结构中的核酸部分为RNA，又分为模板区与非模板区．模板区决定所合成端粒的特异性，非模板区具有酶与底物的结合位点．模板区的长度一般为端粒重复序列长度的1~1.5倍．不同物种端粒酶RNA部分的核苷酸组成存在差异．如最早研究的四膜虫端粒酶RNA为159nt的小RNA，其中46，47和48位的核苷酸被修饰过，而这一位置有CAACCCCAA结构，可与四膜虫端粒的重复序列TTGGGG互补．又如Euplotes（游仆虫）端粒酶RNA有191个核苷酸，模板区为5′CAAAACCCCAAA，小鼠端粒酶RNA有430个核苷酸，模板区为5′CCUAACCCUGAG，大鼠端粒酶RNA模板区为5′UCUAACCCUAUU，中国仓鼠端粒酶RNA模板区为5′UCUAACCCUGAA．

1995年，Feng等

克隆了人类端粒酶RNA基因（hTR基因，位于3p6.3），在长约450个碱基的人端粒酶RNA序列中，有一段长11个核苷酸的区域（5′-CUAACCCUAAC-3′）与人端粒序列（TTAGGG）n互补，发生在该模板区域的hTR突变将导致端粒酶功能的改变．

对已研究的不同物种的端粒酶进行比较发现，它们之间的RNA链同源性较低，将脊椎动物的TR二级结构与四膜虫的比较发现，它们的二级结构非常相似，有4处发卡结构形成4个小的和一个大的环形单链区，端粒DNA的模板RNA即位于此区内．端粒的延长即通过该区与端粒DNA结合后进一步完成

．

1995年，Greider等在四膜虫中分离出两种端粒酶蛋白亚单位p80和p95，并且克隆出它们的基因．1997年在人、小鼠、大鼠中也克隆了四膜虫p80的同源物，在人与小鼠中称为TP1，在大鼠中称为TLP1．TP1和TLP1有一与p80同源的结构域，位于氨基末端，这正是与TR特异性结合的部位．对TP1和TLP1的mRNA的表达并不限于有端粒酶活性的组织和细胞系，各组织间的水平差异与端粒酶活性无关．因此，端粒酶活性的表达并不是由这一部分决定的

．

端粒酶的TERT组分最先在游仆虫中被鉴定出，随后在包括人、老鼠、裂殖酵母、芽殖酵母等有机体内都检测到了端粒酶催化亚基活性的存在并克隆出了它们的TERT基因．端粒酶的催化亚基从游仆虫到酵母到人结构都非常保守，它们都含有端粒酶特有基元T和7个保守的反转录酶基元．端粒酶催化亚基中氨基酸的保守性对端粒酶发挥其正常的功能起重要作用．

1999年研究清楚了人类hTERT（Humantelomerasereversetranscriptase）的基因结构

．它超过37kD，并且由16个外显子组成，制造127kD的hTERT和一个新的断裂变异体．转录起始点在hTERT的cDNA首位核苷酸上游19bp处．启动子区域不包含TATA和CAAT盒，结构是富含GC的CpG岛，并包括由ATG起始密码上游的1100bp，其核心启动子有181bp，包括一个c-myc结合点，E-盒（CACGTG）和一个转录子Sp1．体外转化研究证实hTERT在转录水平调控是一个直接的途径．与P123（游仆虫）、Est2P（芽殖酵母）和Tri1P（裂殖酵母）端粒酶的催化亚基进行序列分析和比较，hTERT在保守区域和它们具有广泛的序列一致性（46%~49%）．所有这些端粒酶催化亚基都具有逆转录酶的共同结构即7个蛋白质域

以及端粒酶催化亚基独特的保守区域，称为T模体，位于多肽的中间和7个保守的逆转录模板（RT）的上游，去除T模体（560FFYVTE565）或单个氨基酸变异（如F561A）会显著降低端粒酶活性以及与TR的结合能力

．另外，在延长的N末端区，还发现了另一个端粒酶特异性结构T2模体，对T2模体的单个氨基酸残基进行选择性变异，同样也会导致端粒酶活性丧失

．

最近发现存在hTERT-mRNA的不同剪接体

．HTERTa剪接体在逆转录酶区域A内丢失12个氨基酸，hTERTdeta剪接体在逆转录酶区域B上游丢失182个碱基，造成下游的移码突变．另外一剪接体编码变异羧基．重组实验表明只有完整的hTERT转录产物才表达端粒酶活性．在人组织器官发育过程中，这些剪接体可能替代全长hTERT，改变端粒酶活性．不同的hTERT蛋白也有可能组成一系列端粒酶全酶，在细胞分化不同阶段发挥不同的生理功能．在大多数情况下，hTERT的表达是端粒酶活性表达的限速步骤．

四．端粒的复制

通过对四膜虫DNA端粒合成的研究发现,当DNA端粒复制时,端粒酶催化逆向转录作用,以酶中的RNA为模板,端粒的单链3’—OH为引物,不断进行反转录合成,延伸3’—OH端单链。

在合成一个拷贝的重复序列后,新合成的TG链回折并借非标准碱基配

对（G—G）形成发夹结构,从而调整了端粒酶的位置,使逆转录能继续下去。

当3’—OH单链延伸到一定长度,3’—OH端作180#回转,这时3’—OH单链又作为DNA聚合酶的引物,再以DNA中富含G、T链为模板,合成互补的富含C、A的DNA片段,以填补在DNA末端复制时,因RNA引物被水解后留下的空隙

。

最后在新合成的DNA5端切去12􀀂16个核苷酸,形成完整的DNA末端结构（图四）

图四、端粒合称的一种模式

此处还附有端粒复制的视频连接

Telomere_Replication.f4v

六．端粒结合蛋白与调节端粒长度的机制

在端粒DNA的重复序列上结合着多种蛋白质,它们具有保护端粒的结构,影响端粒附近的基因表达以及参与调节端粒的长度等功能。

通过研究发现人和某些酵母细胞都含有参与调节端粒长度的端粒结合蛋白。

在人细胞中,有一种特殊的端粒结合蛋白TRF1

（telomericrepeatbindingfactor1）参与调节端粒的长度。

它是一种60kD的双链端粒DNA结合蛋白,在细胞分裂间期结合的端粒DNA上,而在分裂中期结合在染色体的末端。

在含有端粒酶活性的细胞中,TRF1过度表达使端粒的长度缩短。

抑制TRF1的表达,使端粒DNA上结合的TRF1的数目下降能延长端粒的长度。

TRF1不能控制端粒酶的表达,而是通过抑制端粒酶的活性调节端粒的长度,故TRF1是端粒酶延长端粒的负调控子。

人的纤维肉瘤细胞HT1080含有端粒酶活性,而且端粒的长度稳定。

Lange等用这种细胞构建了TRF1的表达系统,通过诱导使HT1080细胞长时间的过度表达TRF1,在其端粒上结合有更多的TRF1,结果引起该细胞的端粒长度逐渐缩短。

如果诱导负显性突变的TRF1,抑制内源性TRF1与端粒序列结合,就能延长端粒的长度。

在芽殖酵母（Saccharomycescerevisiae）中有一种端粒结合蛋白Raplp,其端粒的长度与端粒结合的这种蛋白质分子数目的多少有关。

Raplp突变或改变其表达的水平均能引起端粒长度的变化。

这种蛋白质也是端粒酶活性的负调控子。

在裂殖酵母（Schizoblastosporionpombe）中的端粒结合蛋白Tazlp抑制端粒酶的活性并且能调节端粒的长度,tazl+基因的缺失或破坏都能使端粒序列延长。

由上述看出,三种端粒结合蛋白TRF1、Raplp及Tazlp都能调节端粒酶的活性与端粒的长度。

通过免疫萤光标记研究证明,与端粒结合的TRF1是沿TTAGGG重复序列依次排列的。

人们通过分析总结这些实验结果,提出了端粒长度调节的蛋白质计数模型——即双链端粒重复序列结合蛋白质数目调节端粒长度的反馈抑制机制。

TRF1等调节端粒长度的端粒结合蛋白沿着端粒DNA链重复排列,当端粒上结合的TRF1达到一个临界数目时,就产生抑制端粒酶活性的信号并终止延长端粒的过程;如果因染色体DNA不完全复制,核酸外切酶降解或者发生重组,引起端粒的长度缩短,与端粒结合的TRF1也相应减少。

当结合的蛋白质数目少于端粒结合蛋白质的临界数目时,就重新激活端粒酶的活性,使端粒再次延长到特定长度。

当端粒DNA结合的蛋白质数目又重新达到临界数目时,再次抑制端粒酶的活性。

如此循环下去,从而使癌细胞等具有端粒酶活性的细胞维持稳定的端粒长度。

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