级《微生物与微生物工程实验》实验报告.docx

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级《微生物与微生物工程实验》实验报告

生命科学学院

《微生物与微生物工程实验》

实验报告

学生姓名：

宋文康

学号：

201274020123

年级专业：

2012级生物技术

小组成员：

曹海锋孙向龙马红兵李鹏辉

指导教师：

达文燕孔维宝

完成时间：

2014年12月4日

实验报告撰写说明

1、各班根据实际实验内容，确定淀粉酶或蛋白酶的种类。

2、实验方法和实验结果要分开写，切忌混写，即方法部分中不要出现实验结果的内容，结果部分不要介绍方法。

3、实验方法部分内容要尽量详细介绍。

4、2.2.6部分要根据各班实际实验设计内容详细说明培养基的组成及培养条件。

5、实验结果部分内容根据实际实验结果撰写；图和表都必须要有标题，根据内容顺序按表1、表2…或图1、图2…按顺序列出；图的标题在图下方，横纵坐标轴需要时都要有标题和单位；表的标题在表上方，须绘制成三线表。

如下所示：

图*：

&&&&&&&&&&&

表*：

&&&&&&&&&&&

表

头

部

分

6、分析与论部分内容可结合本实验实际结果和课程所学理论知识展开讨论；结论部分只做文字性总结，不出现图表。

7、第5、6部分必须认真思考撰写，内容不可缺。

8、第7部分内容要小组成员讨论决定，结果直接决定成绩的高低，请认真对待。

9、内容定稿后请更新目录：

菜单栏/引用/更新目录/只更新页码。

10、正文文本字体为宋体，数字、英文等为TimesNewRoman，小四号，1.25倍行距，目录和1-3级标题的字体格式尽量不要调整。

11、本范本仅供参考，框架和标题内容不完备、不合理之处同学可自行修整。

12、实验一和实验二的实验报告内容请参照其他实验课程常规格式和课堂要求撰写，不做特殊要求。

目录

1实验背景、目的和意义1

2材料与方法1

2.1材料与试剂1

2.2实验方法2

2.3分析方法7

3结果与分析8

3.1实验结果8

3.2分析与讨论13

4主要结论14

5实验中存在的问题及对策分析14

6对实验改革的意见和建议15

7参考文献15

8小组成员名单、分工及贡献率16

产淀粉酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化

学生姓名宋文康

（西北师范大学生命科学学院2012级生物技术）

1实验背景、目的和意义

自然界中蕴藏着种类丰富的的微生物资源。

土壤是微生物生存的大本营，是微生物最为重要的资源库。

从自然界中筛选具有特定功能的优良菌种是微生物工作者的一项重要任务，也是一件极其细致和艰辛的工作。

获得具有优良形状及潜在产业化生产能力的功能微生物通常需要达到“亿万挑一”的地步。

淀粉酶在工业酶制剂生产中占有十分重要的地位，广泛应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业，居市场份额第一。

但是，我国的α一淀粉酶制剂的品种和生产菌株都很单一，α一淀粉酶酶活也较国外同行业低。

淀粉酶的生产主要依靠微生物发酵。

生产菌种选育近年来尽管转导转化和基因克隆等分子生物学技术已经广泛应用，但是这些方法成本较高，目前投入商业化生产的α一淀粉酶生产菌株几乎都是通过从自然界中分离得到的野生型菌株。

因此不断从自然界中分离淀粉酶产生菌，并探索其最佳发酵条件有重要意义。

本实验从自然界中分离产淀粉酶的菌株，通过纯化测定水解圈的大小初步确定酶活力的强弱，然后进行液体培养用还原糖法测定酶活力较强的菌株，最后改变碳源，氮源，淀粉含量，PH，菌体浓度等确定最佳培养条件。

获得最佳的产酶条件，以期进一步改良，适应于工业生产需求。

2材料与方法

2.1材料与试剂

2.1.1实验材料

6个盛9ml无菌水的试管，盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶,制霉菌素母液（抑制真菌）。

高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、无菌涂布器、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿（9对）、无菌刻度吸管、酒精灯、试管架1个、接种环1个、接种针1个、接种钩1个、滴管等。

2.1.2试剂药品

1、淀粉培养基:

可溶性淀粉2%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉2%。

（按配制100ml培养基计算）

2、固体培养基：

淀粉6g，酵母膏13g，氯化钠5g，添加1．O％的吐温于1000mL蒸馏水中；最佳培养条件为：

初始pH值为7．5；培养温度为37℃，培养时间36h。

3、原碘液称取碘11g，碘化钾22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500ml，储于棕色瓶中。

4、稀碘液吸取原碘液2ml，加碘化钾20g并用水定容至500ml，储于棕色瓶中。

5、可溶性淀粉液称取可溶性淀粉2g，用温水调成浆状，在搅动下缓缓倾入70ml沸水中，然后以30ml水分几次冲洗装淀粉的烧杯，加热至完全透明，定容至100ml。

6、磷酸缓冲液称取磷酸氢二钠45.23g，柠橄酸8.07g，用水溶解并定容至1000ml，配好后用PH试纸校正至PH=6.0.

7、液体发酵培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基加2％可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaC15g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中，pH调至7．2，121

灭菌15min。

8、3%过氧化氢溶液。

2.1.3仪器设备

冰箱、高压灭菌锅、摇床、721分光光度计、恒温水浴锅、电加热器、酒精灯、试管、接种环、锥形瓶、量筒、移液管、洗耳球、玻璃棒、烧杯、PH试纸。

2.2实验方法

2.2.1含菌土样的采集

在西苑餐厅背面选取一个采样点，产去表层5cm，取5-15cm处。

用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。

配制固体培养基

配制200ml淀粉培养基，配好后装在锥形瓶中用封口膜封住，连同实验所需其他仪器放入灭菌锅中灭菌。

灭菌完成后配制土壤稀释液

称取土样lg，放入盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将锥形瓶加塞、包扎、摇匀（无菌室里），利用恒温水浴装置80℃左右水浴，水浴锅温度恒定后维持20min（制悬液时就应先开始加热），制成10-1g/ml的土壤悬液。

用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。

2.2.2培养基的设计、配制、分装和灭菌

淀粉培养基:

可溶性淀粉2%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉2%。

（按配制100ml培养基计算）

液体发酵培养基：

采用牛肉膏蛋白胨培养基加2％可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaC15g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中，pH调至7．2，121

灭菌15min。

2.2.3产酶菌种的纯种分离方法

1、涂布

待培养基温度降至50℃左右时进行倒平板。

将上述每种培养基的五个平板底面分别用记号笔写上10-2、10-3、10-4、10-5和10-6五种稀度，然后用无菌吸管分别由10-2、10-3、10-4、10-5和10-6五管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在淀粉平板培养基表面中央位置。

用无菌涂布器涂布。

右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。

室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。

2、培养

平板倒置于37℃培养箱中培养随时观察细菌生长情况。

3、产淀粉酶菌的筛选、鉴定

①第二天早上，发现10-2，10-5等平板已有大量菌落，在菌落周围滴加碘液观察水解圈，对有水解圈且水解圈大的菌落进行斜面转接，同时用画线法将该菌落接种在另一干净平板上。

②将接好的斜面和平板放在恒温培养箱中培养。

③待下午时所转接细菌已长出菌落，再进行三点法培养（在接种针上粘上该细菌，在干净灭菌的平板上分三个地方点三点）。

④同时配好液体培养基，灭菌，将该细菌接种到液体培养基中，每个接3瓶。

⑤将接种好的固体和液体培养基放在培养箱中培养。

2.2.4产酶菌种的革兰氏染色观察

1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。

涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。

2、涂片：

液体培养基：

左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

固体培养基：

先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。

3、晾干：

让涂片在空气中自然干燥。

4、固定：

让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。

5、染色：

将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。

6、水洗：

用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。

简单染色结束可观察细胞形态。

7、媒染：

滴加1滴碘液，染1min，水洗。

8、脱色：

吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。

9、复染：

滴加蕃红复染3-5min，水洗。

至此，革兰氏染色结束。

10、在油镜下观察。

2.2.5菌种的常规生理生化鉴定

（1）甲基红试验

挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用液体培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）1-5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1-2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。

迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。

甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.4~6.0，其pK值为5.0。

故在pH5.0以下，随酸度而增强红色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。

（2）V-P试验

试剂：

6％α-奈酚酒精溶液为甲液，40％氢氧化钾为乙液。

同上法接种培养细菌，于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4毫升，摇振混合。

试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应，如无反应，应放在36±1℃下培养4h再进行观察。

（长时间无反应，可置室温过夜），次日不变者为阴性。

（3）过氧化氢酶接触试验

挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。

2.2.6菌种的液体培养及产酶条件优化

（1）菌种生长曲线的测定方法

1、菌种的活化

将保藏的菌种洗脱接种到一个装有50ml液体培养基的锥形瓶里，放在摇床上在160r/min,37

条件下培养24h。

2、生长曲线的测定

将培养好的菌种分别接种在3个装150ml培养基的锥形瓶中，每个里面接4ml。

接种完成后按设定的0，2，4，6，8，10，12，14，16，20，22，24，28，30，34，38，40，44h测定菌种浓度，同时在160r/min,37

的摇床上培养。

测定时按时间在严格无菌条件下从每个培养液中取4ml，装入离心管中，在4000r/min的离心机上离心5min，从每个离心管里吸取2ml上清液测酶活力，剩余菌体稀释30倍在分光光度计下测菌体浓度；

（2）碳源（或氮源）种类及浓度的影响

1、配制分别含葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉四种碳源2%的LB培养基，灭菌。

2、配制LB培养基，其中加入2%淀粉1%葡萄糖共计400mL，装在4个锥形瓶中，在锥形瓶中分别加入0.5%牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2SO4、KNO3、灭菌。

接种细菌，然后将液体培养基置于摇床上在160r/min,37℃条件下培养24h。

3、从每个培养液中取2ml，装入离心管中，在4000r/min的离心机上离心5min，从每个离心管里吸取1ml上清液测酶活力，剩余菌体稀释15-20倍在分光光度计下测菌体浓度。

（3）混合碳源（或氮源）的影响

1、配制LB培养基，共计400mL装在4个锥形瓶中，其中分别加入2%葡萄糖、2%淀粉、2%葡萄糖+1%淀粉、2%葡萄糖+2%淀粉四种不同碳源，灭菌。

2、接种细菌，然后将液体培养基置于摇床上在160r/min,37℃条件下培养24h。

3、从每个培养液中取2ml，装入离心管中，在4000r/min的离心机上离心5min，从每个离心管里吸取1ml上清液测酶活力，剩余菌体稀释15-20倍在分光光度计下测菌体浓度。

（4）pH值的影响

1、预先配制500ml液体培养基，分装在5个锥形瓶中，灭菌。

2、用1MNaOH和1MHCl对培养基进行调配，用pH试纸测定培养基pH，分别将pH调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,接种细菌，然后将液体培养基置于摇床上在160r/min,37℃条件下培养24h。

3、从每个培养液中取2ml，装入离心管中，在4000r/min的离心机上离心5min，从每个离心管里吸取1ml上清液测酶活力，剩余菌体稀释15-20倍在分光光度计下测菌体浓度。

（5）接种量的影响

1、预先配制500ml液体培养基，分装在5个锥形瓶中，灭菌。

2、分别接入1%、2%、3%、4%、5%，的菌体

3、接种细菌，然后将液体培养基置于摇床上在160r/min,37℃条件下培养24h。

4、从每个培养液中取2ml，装入离心管中，在4000r/min的离心机上离心5min，从每个离心管里吸取1ml上清液测酶活力，剩余菌体稀释15-20倍在分光光度计下测菌体浓度。

（6）培养条件

1、配制LB培养基，共计400mL装在4个锥形瓶中，其中分别加入0%淀粉、0.5%淀粉、1%淀粉、2%淀粉四种不同碳源，灭菌。

2、接种细菌，然后将液体培养基置于摇床上在160r/min,37℃条件下培养24h。

3、从每个培养液中取2ml，装入离心管中，在4000r/min的离心机上离心5min，从每个离心管里吸取1ml上清液测酶活力，剩余菌体稀释15-20倍在分光光度计下测菌体浓度。

2.2.7紫外线对菌种生长的影响

紫外线照射能杀灭细菌，将细菌悬液均匀涂布在固体培养基上，在中央贴黑纸片遮光，放于紫外灯下培养24h，观察细胞生长情况。

2.2.8菌种的保藏

（1）低温斜面保藏法

取灭菌后的蛋白胨斜面，用接种针取细菌用划线接种在斜面上，严格无菌操作，做好标记和接种时间，将接种好的斜面置于4℃冰箱中保藏，这样的保藏适用于短期的菌种保藏。

（2）液体甘油保藏法

甘油保藏通常需要在无菌操作台上进行，严格进行无菌操作，将甘油倒于长满菌落的斜面上，用接种针刮取菌落，再将甘油连同菌体一起倒入离心管中密封保存。

注意不要把培养基刮下来，注意宁缺毋滥，用无菌甘油洗下菌落放在冰箱中保藏，这样保藏的菌种可保藏数月到数年。

2.3分析方法

2.3.1菌体浓度的测定方法

1、菌种的活化

将保藏的菌种洗脱接种到一个装有50ml液体培养基的锥形瓶里，放在摇床上在160r/min,37

条件下培养24h。

2、菌体浓度的测定

按设定的点分别从培养液中取菌液4ml，放在4000r/min的离心机上离心5min，去上清液，首先加1ml蒸馏水将菌体稀释，然后取0.2ml的稀释菌液再稀释20倍，倒入比色皿中在721分光光度计测吸光值。

根据标准曲线对比得出菌体浓度。

2.3.2酶活力的测定方法及定义

（1）酶活力的测定方法

在测菌体浓度时离心后所得的上清液取1ml，稀释两倍，加1%的淀粉溶液2ml，在40度的水浴锅中反应10min，取出后立即加入现配好的斐林试剂2ml，然后放于沸水中煮沸10min，取出后在5000r/min的离心机上离心5min，取上清液在721分光光度计上测吸光值，与标准曲线对比测得酶活力。

（2）酶活力的定义

酶活力（enzymeactivity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。

酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。

测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。

酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。

在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。

3结果与分析

3.1实验结果

3.1.1菌种的纯种分离及产酶性能结果

图1：

纯种菌落图2：

划线培养菌落

菌体产酶性能首先随菌体浓度增加而增加，当菌体浓度达到最大时产酶性能也达到最大，之后菌体浓度开始下降，产酶性能也下降。

3.1.2菌种的染色观察结果

图3：

产淀粉酶菌株（1000倍）

3.1.3菌种的染色观察结果

图4：

产淀粉酶菌落（400倍）

3.1.4菌种的生理生化鉴定结果

（1）甲基红、V-P对比试验

在液体培养瓶中加入15滴KOH和等量的α—奈酚充分摇匀后溶液变为红色。

同样在

液体培养瓶中加入5滴甲基红摇匀后也变为红色，并取一滴试液处理后在显微镜的油镜下观察，细菌呈红色，为杆状，说明该产淀粉酶细菌为革兰氏阳性枯草芽孢杆菌。

图

图5：

甲基红、V-P对比实验

（2）过氧化氢酶接触试验

于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。

革兰氏阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。

3.1.5菌种的液体培养及产酶条件优化结果

（1）菌种的生长及产酶曲线

由生长曲线知，在测定的范围内，细菌第3h就进入对数生长期，一直到第29h菌体还是对数生长。

由于R2=0.8135可知测定曲线不是很可信。

图6：

菌体生长曲线

由于R2=0.1286，所以实验结果有很大问题，在此讨论结果毫无意义。

图7：

酶活曲线

（2）碳源（或氮源）种类及浓度的影响

表1碳源种类对酶活和菌体生长影响

选项

葡萄糖

蔗糖

麦芽糖

淀粉

菌体浓度

0.275

0.26

0.234

0.256

酶活力

-0.122

0.272

-0.193

0.175

图8：

碳源对酶活力的影响图9：

碳源对菌体浓度的影响

（3）混合碳源（或氮源）的影响

图10：

混合碳源对菌体浓度的影响

图11：

混合碳源对酶活的影响

（4）pH值的影响

图12:

PH对菌体浓度的影响

图13：

PH对酶活力的影响

（5）接种量的影响

图14：

接种量对菌体浓度的影响

图15：

接种量对酶活的影响

3.1.6紫外线对菌种生长的影响

菌种在紫外线下遮光培养，发现被黑纸片遮住的地方菌落生长完好，而没有遮光的地方细菌基本被杀灭。

图16：

紫外线下遮光培养的细菌

3.2分析与讨论

3.2.1菌种的形态和生理生化特性

经鉴定，该实验的细菌为枯草芽孢杆菌，单个细菌在显微镜下为棒状，用革兰氏染色后为紫色，甲基红试验菌液为红色，在显微镜下观察染色的细菌呈红色，说明细菌为革兰氏阳性菌。

该细菌的菌落成圆形，菌落表面及周围光滑。

在不同PH条件下培养时测得PH=7.0时细菌生长最快，而测得的酶活力在PH=8.0时最高，查阅文献知淀粉酶的最适PH=6.8，可见在此点处时测量出了问题。

在混合碳源的测试中发现2%葡萄糖+1%淀粉时细菌生长最快。

在测接种量对细菌生长影响的实验中得出3%的接种量是细菌生长最快，但此时测得酶活力最低。

3.2.2菌种的固体培养生长及产酶性能

菌种在固体培养基上繁殖能力旺盛，接种好菌种后在适宜的条件下培养12小时左右就可看到直径为1cm左右的菌落，用碘液滴定，可以明显看到菌落周围的水解圈，说明细菌的产酶能力强。

3.2.3菌种的液体培养生长及产酶性能

图6和图7为菌种在液体培养基上的生长曲线和酶活曲线。

由图可以看出细菌在适宜条件下培养很快进入对数生长期，对数生长期持续时间长。

查阅文献知随着细菌的生长产酶不断增多，到稳定期时酶活力达到最大，之后酶活力迅速下降。

而所测实验中细菌的生长曲线不完整，酶活力测定数值完全不可信。

说明不仅测定时间太短，测定酶活时操作也有问题。

据了解普遍的问题是酶液稀释度太大，每个小组测定时并没有精确把握酶在水浴锅中的反应时间，所以致使此处的测定失败。

由于整个酶活是一条曲线，每个人的测定又有一定的时间误差，所以建议将每个点的酶液保存后最后由一个小组完成，以保证实验变量的统一。

3.2.4菌种的保藏技术

对于性能优良的菌种或为了以后做验证实验，需要对菌种保藏。

菌种在保存时一定要注意灭菌，防止杂菌进入，否则会影响细菌的优良性或以后的验证实验。

4主要结论

4.1在测定的范围内可知在3~29小时之间细菌都在对数生长。

查阅文献知酶活力首先是根据细菌的生长而逐渐增强，当细菌生长达稳定期时达到最大，以后迅速下降。

4.2在革兰氏染色中观察到细菌为革兰氏阳性菌。

4.3细菌生长的最优化条件为PH=7.0，用葡萄糖做碳源，3%的接种量。

5实验中存在的问题及对策分析

存在的问题：

5.1第一，测定不准确。

多次取样导致前后培养液体积有很大变化，所以前后菌体的浓度并不具有可比性。

5.2第二，增加污染风险。

多次在同一个培养液里取样，增加了污染几率，一旦污染就会前功尽弃。

改进的方法：

5.3生长曲线的测定

①查阅文献知菌体的生长曲线一般在40h左右，设定每2h取一次样。

配置1000ml液体培养基，分装入20个锥形瓶中（每个瓶上标号），每个50ml，灭菌后每个里面接种4ml菌体，放在35

，160r/min的摇床上培养。

②根据设定的点，每2h取一瓶培养基，吸取4ml菌液，离心，去上清液，将菌体稀释15倍在分光光度计下测吸光值，最终得到一条完整的菌体生长曲线。

5.4酶活力的测定

①配置2%的可溶性淀粉溶液，加入1ml酶液中，在40

的恒温水浴锅中反应30min，加2ml斐林试剂，在沸水中煮10min，可看到有显著砖红色沉淀。

②然后离心取上清液在分光光度计下测吸光值，得到酶活力曲线。

6对实验改革的意见和建议

6.1对于教学来说，实验室应该提供充足的实验器材和试剂，在不损坏和非技术性浪费的条件下，应该不吝啬于实验试剂和器材的使用。

只有多次大胆尝试，也许才会得到更优化的结果。

6.2对于学生来说，老师应该严格要求每个学生在实验前提交一份详细的实验计划书，然后按组让同学们综合做一个最优方案。

6.3对于老师来说，实验过程中应该鼓励更多的同学参与实验。

6.4实验结束后老师应该组织一个讨论会，讨论本次实验的所学所感，相互学习。

7参考文献

引用格式范例如下：

教材专著：

[1]吴谋成.生物柴油[M].北京：

化学工业出版社，2008:

1-5.

期刊论文：

[2]熊万明,傅尧,来大明,等.酸性离子交换树脂催化酯化改质生物油的研究[J].高等学校化学学报,2009,30（9）:

1754-1758.

论文参考文献：

[1]周德庆主编.微生物学实验教程[M].北京：

高等教育出版社，2006.3.、

[2]袁丽红主编.微生物学实验[M].北京：

化学工业出版社，2010.2

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