大豆异黄酮大孔树脂吸附分离性能的研究设计.docx

大豆异黄酮大孔树脂吸附分离性能的研究设计.docx

《大豆异黄酮大孔树脂吸附分离性能的研究设计.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大豆异黄酮大孔树脂吸附分离性能的研究设计.docx（10页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

大豆异黄酮大孔树脂吸附分离性能的研究设计

豆粕中大豆异黄酮大孔树脂吸附分离性能的研究

大豆异黄酮（Soyisoflavone）是以大豆油渣为原料,经过提取分离,加工成含量达30%-95%的粉状大豆异黄酮。

近年来研究表明大豆异黄酮具有广泛的生理活性,除其自身作为异黄酮具有的抗氧化作用外,大豆异黄酮作为雌性激素治疗的替代品,可以改善妇女更年期综合症；其对与激素有关的肿瘤如乳腺癌和前列腺癌的抑制作用更为显著受到极大关注；此外,大豆异黄酮在治疗和预防心脑血管疾病方面也有明显作用。

大豆异黄酮已经广泛应用于食品、医药等行业。

大豆异黄酮是多酚类混合物,分为游离型的甙元（Aglycon）和结合型的糖甙（Glucosides）两类。

甙元包括染料木素（Genistein）、大豆黄素（Daidzein）和黄豆黄素（Glycitein）。

天然情况下它们主要以β-葡萄糖甙形式存在,即染料木甙（Genistin）、大豆黄甙（Daidzin）和黄素黄甙（Glystin）,部分异黄酮甙发生乙酰化、丙二酰化,但所有这些大豆异黄酮衍生物经酸水解或酶催化分解后都能转化为大豆异黄酮甙元。

大豆异黄酮所具有的良好的药理作用显示了它具有很大的开发价值,通过提取分离大豆异黄酮能充分合理利用大豆中的各种有效成分,提高其附加值,实现良好的经济效益和社会效益。

目前有关豆粕的提取工艺主要以乙醇为提取溶剂，由于乙醇系有机溶剂，消耗大、成本高、且生产过程存在易燃等安全隐患，为此我们根据豆粕异黄酮有一定的水溶性，试改用水做提取溶剂，以大豆异黄酮为目标，对其大豆异黄酮进行了正交提取工艺研究，并对最佳提取工艺得到的提取液进行了大孔吸附树脂吸附分离性能研究，以期为豆粕大豆异黄酮的开发利用提供依据。

1材料与仪器

　　1.1材料豆粕（采自陕西石羊公司），自然干燥，粉碎。

　　1.2试剂染料木素和大豆黄素对照品:

百灵威化学；大豆苷元标准品（中国药品生物制检定所1502-2001O1）。

大孔树脂ADS-21、ADS-7、D101，AB-8购自西安蓝小科技开发有限公司。

甲醇:

色谱纯试剂，其余试剂均为分析纯。

　　1.3仪器天津市泰斯特仪器有限公司FZ102植物粉碎机；德Sartorius赛多利斯ME235S-电子分析天平；上海亚荣生化仪器厂RE-52AA旋转蒸发仪；上海医疗器械五厂H·H·S21-6C电热恒温水浴锅；江苏昆山超声仪器公司KQ-50DB超声清洗器；郑州长城科工贸有限公司SHB-C循环水式多用真空泵；日本岛津LC-20A型高效液相色谱系统（包括SPD-20A检测器、LC-20A型高压恒流泵和LCSolution工作站）；色谱柱:

InertsilC18（4.6mm×250mm，5μm）；日本岛津UV-1700紫外可见分光光度计；日本岛津CS—930型薄层色谱扫描仪；日本岛津ZF—1型三用紫外分光仪；上海市实验仪器总厂101A—2型鼓风干燥箱；浙江黄岩求精真空泵厂2XZ-2旋片式真空泵；北京医用离心机厂LD5-10高速离心机；上海悦丰DE-10蒸馏水器；美国Bedford公司Milli-Q超纯水制备仪；TGL-16C型高速离心机；上海沪西分析仪器厂有限公司HL-2恒流泵；上海大龙医疗器械有限公司PotPette100-1000μl手动单道可调式移液器；索式提取器；层析柱（16mm×30cm）。

2方法

2.1大豆异黄酮的薄层检测

大豆异黄酮苷元的薄层检测

硅胶薄板制作

称取4g硅胶GF254置于研钵中，加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液12ml，研磨15min后铺于20×10cm的干净玻璃平板上，要求平整无气泡，然后晾干即可。

展开剂配制

取展开剂氯仿-无水甲醇10：

0.5的比例配制52.5ml（50：

2.5）作为展开剂。

薄板活化：

将制好的硅胶薄板在105℃下活化30min。

点样：

点样点距板子底端1.5cm左右，所有点样点位于同一直线上，尽可能向中间靠拢，每个点样点点样约20μl，点样点尽可能小。

饱和：

将板子不没入层析缸内的展层剂中，在展层剂的蒸气中饱和约0.5h。

层析：

将板子下端插入展层剂中进行展开，当展层剂前沿距板子上端约1.5cm时取出板子，自然晾干。

观察：

展开取出晾干后，在254nm荧光灯下观察，斑点呈浅黄色。

Rf。

2.2紫外分光光度法测定大豆异总黄酮[2]

[2]张玉梅，孙学斌，高旭年，等.紫外分光光度法测定大豆异总黄酮的含量[J].中国食品卫生杂志.2000，12（4）7-9

2.2.1标准品溶液的配制及标准曲线的制备精确称取大豆苷元标准品（中国药品生物制检定所1502-2001O1）2.0mg,置于25mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻线，摇匀，分别精密吸取标准品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8mL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻线，摇匀，以甲醇为空自，在254nm的波长处测定A值，以浓度为横坐标，A值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=0.138X-0.0056，R2=0.9994，线性范围（0.8-6.4ml/L）。

2.2.2含量测定精确量取供试品溶液0.01mL用无水甲醇稀释1000倍到10mL定容，用TU-9100紫外分光光度计在波长254nm处测定A值3次，取平均值测定结果，根据标准曲线计算样品含量。

2.3紫外分光光度法测定大豆异总黄酮

关于测定大豆异黄酮的含量有采用比色法、薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法等，比色法干扰多，专一性差，测定结果偏差较大;薄层色谱法存在分离效果差，定量不准确等不足;气相色谱法需要将样品进行衍生，操作繁琐，易受杂质干扰;高效液相色谱法能检测不同类型的异黄酮，但检测时间较长，设备运行费用较高，不适于在提取工艺探讨中大量多次地监测异黄酮.大豆异黄酮为黄酮醇类化合物，在紫外光区有较强吸收，因此可采用适当对照品，用紫外分光光度法检测大豆异黄酮含量[9]。

[9]杨晓文.大豆异黄酮测定力法的研究概况[J].中国油脂.2006,31

（1）:

60-62

2.3.1标准曲线的制作准确称取120℃干燥至恒重的染料木素5mg置于5OmL容量瓶中，用95%乙醇溶解，并定容个刻度，摇匀、分别用移液管准确吸取O.5mL,1.OmL,1.5mL,2.OmL,2.5mL标准溶液分别置于5OmL容量瓶中，并各加入95%乙醇1.Oml,再加蒸馏水稀释个刻度，摇匀、以1mL95%乙醇加水到5OmL作空白对照、在260nm处测吸光度，染料木素的浓度C以μg/mL为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。

回归方程A=0.1676X-0.0118，r=0.9982。

2.3.2样品的制备豆粕多功能食品粉碎机粉碎后，过30目筛，称取粉碎样品5.OOOOg,、将无水乙醇配成70%浓度后取40mL，索氏提取豆粕粉末，在70℃恒温水浴中提取2h,减压抽滤去残渣，回收溶剂至干，加95%乙醇溶解，定容至5OmL容量瓶中，作为储备液、准确吸取储备液2mL置5OmL容量瓶中，加95%乙醇1.OmL定容个刻度，摇匀、作平行样3份。

序号

吸光度

含量（μg/g）

平均含量（μg/g）

RSD（%）

1

0.6353

118.96

2

0.6373

119.28

118.59

1.0

3

0.6277

117.53

2.4高效液相色谱法测定大豆异黄酮的含量

仪器条件:

Waters液相色谱仪;C18色谱柱，150mmX4.6mm,5μm;流动相:

甲醇:

水:

磷酸=55:

45:

0.3;流速:

0.6mL/min;柱温:

25℃;检测波长:

260nm。

标准溶液:

用十万分之一电子天平准确称量5.Omg染料木素和5.Omg大豆黄素对照品，加入50mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，作为标准溶液。

样品预处理:

因大豆异黄酮甙元容易得到纯品，所以测定大豆异黄酮含量时都以甙元做对照品。

这样在进行HPLC分析之前，需对大豆异黄酮样品进行预处理。

准确称量5Omg待分析样品于50mL锥形瓶中，加入3OmL甲醇和5mL质量分数为25%的盐酸水溶液，在恒温水浴锅上80℃加热回流水解1h至大豆异黄酮甙完全水解为大豆异黄酮甙元后，把水解液用甲醇定容至5OmL容量瓶中，进液相色谱进行分析。

样品分析:

以标准溶液的出峰保留时间和峰面积与溶液浓度的对应工作曲线为依据，根据文献报道的相应组分的换算系数计算样品中总大豆异黄酮甙的含量。

2.5RP-HPLC测定大豆异黄酮的含量

阮洪生，秦学功，陈志宝，等.大孔吸附树脂富集豆粕中大豆异黄酮的工艺研究[J].黑龙江八一农垦大学学报2007，19（5）：

72-76

采用RP-HPLC测定豆粕中以大豆苷和染料木苷为主的异黄酮含量。

色谱条件为色谱柱:

KromasilC18柱（4.6mmX250mm,5μm）;柱温:

30℃;流动相:

甲醇-水（3:

7）;流速:

1.00mL.min-1;检测波长:

260nm;进样量:

10μL。

建立测定大豆苷与染料木苷的标准工作曲线。

2.3大孔树脂静态吸附实验

表1　吸附树脂的物理性能

型号

极性

比表面积/（m2/g）

孔径/nm

ADS-21

ADS-7

D101

AB-8

2.3.1树脂的处理和再生：

将树脂放入蒸馏水中，溶胀后浮选，用1moL/L的NaOH溶液浸泡4h，用蒸馏水洗至中性，然后用0.5moL/L的HCl溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至中性。

用95%乙醇浸泡24h，不断搅拌，用蒸馏水洗至无白色混浊，并且无醇味。

用蒸馏水浸泡待用。

树脂简单再生可用含量为95%的乙醇洗至无色，即可使用，经多次使用的树脂吸附杂质较多，颜色较深，可用酸碱处理再生后使用。

2.3.2豆粕样液制备

称取粉碎后豆粕100g，加600ml75%酒精于60℃热回流提取120min，用4层纱布粗滤得粗滤液，残渣再加入500ml75%酒精于60℃热回流提取90min，用4层纱布粗滤得粗滤液，残渣再加入500ml75%酒精于60℃热回流提取90min，用4层纱布粗滤得粗滤液，合并三次粗滤液，在用滤纸或离心过滤得豆粕提取液。

提取液经旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/5，再加入和浓缩液同体积的蒸馏水水，继续蒸馏至馏出液中乙醇含量为10%时停止。

调pH为4,使蛋白析出，离心l5min，倒出上清液，再将pH调到中性，得到豆粕大豆异黄酮溶液（mg/ml）。

2.3.3饱和吸附量的测定

准确称取经预处理的用滤纸吸干表面水分的树脂1.00g于100ml三角瓶中，精密加入mg/ml的豆粕大豆异黄酮溶液20.0ml，在25℃，120r/min的条件下振荡吸附18-24h。

测定吸附后溶液中大豆异黄酮的量，并按下式计算树脂的饱和吸附量。

饱和吸附量=（加入的大豆异黄酮-未吸附的大豆异黄酮）/树脂的量。

2.3.4树脂脱附率的测定

将上述经过24h静态吸附大豆异黄酮的树脂分离出来，吸干表面水分，然后加入75%的乙醇20.0ml，在25℃，120r/min的条件下振荡脱附2h。

测定脱附液中大豆异黄酮的量，按下式计算脱附率。

脱附率（%）=洗脱出的大豆异黄酮/（加入的大豆异黄酮-未吸附的大豆异黄酮）×100%。

不同树脂对大豆异黄酮的吸附量和解吸实验结果见表。

表　大孔树脂静态吸附及解吸性能

型号

吸附量/（mg/g）

解吸率/%

ADS-21

ADS-7

D101

AB-8

从表可看到4种树脂中树脂的吸附量最大，最小，在实际生产应用中，对树脂要求不仅要求吸附量大，而且要求解吸率要高，以保证有效成分的最大回收。

在这2种树脂中树脂不仅具有大的吸附量，而且具有较高的解吸率，因此认为树脂是富集纯化大豆异黄酮较为理想的吸附材料。

吸附树脂

ADS-22

ADS-7

ADS-16

ADS-8

ADS-F8

ADS-17

功能基的性质

酰胺

胺基

酰胺

非极性

胺基

羰基

比表面积（m2/g）

30

120

50

450

≤1

110

所得提取物的大豆异黄酮含量与树脂的选择性有关。

从图1可以看出，由含胺基、酰胺基的ADS-22,ADS-7,ADS-16,ADS-F8得到的提取物中，大豆异黄酮含量都较高;而由含羧基的ADS-17和非极性树脂ADS-8得到的提取物中，大豆异黄酮的含量都较低。

这说明大豆异黄酮提取物的含量是由树脂的功能基所决定的，含N基团的树脂对含酚轻基的大豆异黄酮的吸附选择性较高，所以用ADS-22,ADS-7,ADS-16,ADS-F8树脂可以得到较高含量的大豆异黄酮提取物。

其ADS-22的综合性能最好，故选此种树脂进行以下的试验。

2.3.5大孔吸附树脂解吸特性的考察

按2.3.3项的方法得到吸附饱和的树脂5份,分别精确加入20mL的15%、30%、45%、60%和75%的乙醇溶液进行解吸,计算不同浓度乙醇溶液对大豆异黄酮的解吸率。

选择洗脱剂不仅要求具有使大孔树脂溶胀，减弱被吸附物质与树脂之间的吸附力，而且要求可溶解被吸附物质，本实验选用洗脱剂为乙醇，考察不同乙醇溶液浓度对大豆异黄酮的解吸效果,结果见图1。

洗脱剂浓度

15%

30%

45%

60%

75%

解吸率%

将表做图

图　洗脱剂浓度对大豆异黄酮解吸的影响

　　由图可以看出，15%和30%的洗脱液解吸率较低，而60%的洗脱液基本上可以将大豆异黄酮完全从树脂上解吸下来，从纯化的纯度角度和节约试剂用量的角度考虑，应选用60%乙醇作为洗脱剂，没有必要使用75%的乙醇作为洗脱剂。

2.3.6pH对树脂吸附效果的影响

准确称取预处理好的用滤纸吸干表面水份的湿树脂5份，每份1.0g，装入50mL具塞锥形瓶中，分别加入用2mol/L的盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH值的溶液20mL，在摇床上振摇18-24h，测定吸附后溶液中大豆异黄酮的量。

pH值

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

吸附量

将表做图

由图可以看出,pH值在4.5-5.5之间,树脂对大豆异黄酮的吸附量是最大的,因为豆粕黄酮类化合物分子中含有酚羟基、羧基,呈弱酸性,酸性化合物在酸性溶液中易吸附;此外,酸性条件下有利于葡萄糖苷型异黄酮水解成苷元型,更容易被树脂所吸附。

酸性太强,树脂的吸附性能会受到影响,吸附率下降;碱性增强,会使异黄酮的亲水性增强,从而使吸附量下降。

2.4大孔树脂动态吸附实验

2.4.1动态吸附透过曲线的测定

吸附材料选取树脂，采用16mm×300mm的玻璃层析柱作为吸附柱，称取预处理好的树脂20g，湿法装柱，取豆粕样液（g/ml）300mL，用2mol/L的盐酸将黄酮供试液调pH值为进行上样，上样流速控制在2—3mL/min，每50mL接一管，测定流出液中大豆异黄酮浓度,绘制动态吸附透过曲线。

流出液体积ml

50

100

150

200

250

300

流出液浓度mg/ml

将表做图

由图可以看出,当上样液体积达到100mL时,原料液中大豆异黄酮开始透过树脂柱,当体积达到200mL时,树脂柱达到饱和吸附。

2.4.2动态脱附解吸曲线测定

称取预处理好的树脂20g，湿法装柱，用2mol/L的盐酸将大豆异黄酮供试液调pH值为进行上样，上样流速控制在2-3mL/min，上样量为300mL，上样结束后用200mL的蒸馏水进行洗涤，以除去水溶性杂质，然后用75%的乙醇进行洗脱，每50mL接一管，测量流出液中大豆异黄酮浓度，绘制动态脱附解吸线。

洗脱剂体积ml

20

40

60

80

100

120

流出液浓度mg/ml

将表做图

由图可以看出,用100mL75%的乙醇进行洗脱,可基本上将大豆异黄酮完全解吸下来,洗脱峰集中、对称,无明显拖尾现象,起到了很好的富集和回收的作用。

2.4.2洗脱产物中大豆异黄酮纯度的测定（由上述实验确定方案）

分别用45%、60%和75%的乙醇作为洗脱剂，按前面的做法装柱、上样、洗脱，得到洗脱产物。

精确吸取45%和75%的乙醇洗脱液各200mL，水浴蒸干后，60℃真空干燥3h，得固形物，称重。

按下式计算洗脱物中大豆异黄酮的纯度。

纯度（%）=大豆异黄酮含量/固形物重量×100%

洗脱溶剂

解吸率%

纯度%

45%乙醇

75%乙醇

从表可看出,产物大豆异黄酮45%乙醇解吸纯度较高,解吸率相对低一些。

用树脂纯化前原液中纯度为%,经树脂纯化后的解吸产物中纯度为%,提高了倍，表明树脂对起到了较好的富集、纯化作用。

3结果与分析

4结论