常见化学发光免疫分析技术比较课件doc.docx

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常见化学发光免疫分析技术比较课件doc

常见化学发光免疫分析技术比较

1、化学发光免疫分析

化学发光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassa，yCLIA），

英音：

[,kemi,lju:

mi'nes?

ns][,imju:

n?

u?

'sei]

是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应

相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素

和药物等的检测分析技术。

是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析

和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。

CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫

反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维

生素和药物等的检测分析技术。

是继放免分析、酶免分析、荧光免疫

分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技

术。

1.1、化学发光免疫分析原理

化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光

分析系统。

化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和

氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到

稳定的基态时,同时发射出光子（hv）,利用发光信号测量仪器测量光

量子产额。

免疫反应系统是将发光物质（在反应剂激发下生成激发态

中间体）直接标记在抗原（化学发光免疫分析）或抗体（免疫化学发光

分析）上,或酶作用于发光底物。

1.2、化学发光免疫分析类型

化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:

（1）化学发光标记免疫分析法;

（2）酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析

法

1.2.1化学发光标记免疫分析

化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析（CLIA）,是用化

学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。

常用于标记的化学发

光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester（AE）,是有效的发光标记

物，其通过起动发光试剂（NaOH-H2O2）作用而发光,强烈的直接发

光在一秒钟内完成,为快速的闪烁发光。

吖啶酯作为标记物用于免疫

分析,其化学反应简单、快速、无须催化剂;检测小分子抗原采用竞

争法,大分子抗原则采用夹心法,非特异性结合少,本底低;与大分

子的结合不会减小所产生的光量,从而增加灵敏度。

1.2.2化学发光酶免疫分析

从标记免疫分析角度,化学发光酶免疫分析（chemiluminescent

enzymeimmunoassay，CLEIA）,应属酶免疫分析,只是酶反应的底物

是发光剂,操作步骤与酶免分析完全相同:

以酶标记生物活性物质

（如酶标记的抗原或抗体）进行免疫反应,免疫反应复合物上的酶再

作用于发光底物,在信号试剂作用下发光,用发光信号测定仪进行发

光测定。

目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶

（ALP）,它们有各自的发光底物。

12.2.1HRP标记的CLEIA

常用的底物为鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼,luminol）,或其衍生

物如异鲁米诺（4-氨基邻苯二甲酰肼）,是一类重要的发光试剂。

其结

构如图4所示。

鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行,在过氧化物

2-）,单线态氧（1O2）,羟自由基（OH·）,

酶及活性氧[过氧化阴离子（O

过氧化氢（H2O2）]存在下,生成激发态中间体,当其回到基态时发光,

其波长为425nm。

早期用鲁米诺直接标记抗原（或抗体）,但标记后发光强度降低

而使灵敏度受到影响。

近来用过氧化物酶标记抗体,进行免疫反应后

利用鲁米诺作为发光底物,在过氧化物酶和起动发光试剂（N

aOH-H2O2）作用下,鲁米诺发光,发光强度依赖于酶免疫反应物中酶

的浓度。

KodakAmerliteTM半自动分析系统就是利用这一体系专门

设计的。

1.2.2.2增强发光酶免疫分析（enhancedluminescenceenzyme

immunoassay,ELEIA）

在发光系统中加入增强发光剂,如对2碘苯酚等,以增强发光信

号,并在较长时间内保持稳定,便于重复测量,从而提高分析灵敏度

和准确性。

在全自动分析仪上,还可通过计算机严密控制,进行自动

操作,如加试剂,混合,温育,洗涤,加发光试剂,发光计数,数据处

理,绘制标准曲线,直至完成病人血清样品的分析并打印出结果。

Am

erliteTM发光增强酶免分析系统用荧光素、噻唑等增强剂,其发光时

间可持续长达20min,试剂盒有甲状腺功能检测的促甲状腺素、三碘

甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素,与性

激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎

蛋白、雌二醇、睾酮,以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛

等。

1.2.2.3ALP标记的CLEIA

所用发光底物为环1,2-二氧乙烷衍生物,,用于化学发光酶免分析

底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的金刚烷基,其分子中发

光基团为芳香基团和酶作用的基团,在酶及起动发光试剂作用下引

起化学发光。

最常使用的底物AMPPD3-[2-spiroadamatane]-4-methoxy

-4-[3-phosphoryloxy]-phenyl-1,2-dioxetane）Dioxetane中文名为:

3-（2-

螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3-磷氧酰）-苯基-1,2-二氧环乙烷。

在碱性磷

酸酶（ALP）作用下,磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基,得到一个

中等稳定的中间体AMPD（半寿期为2-30min）,此中间体经分子内电

子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸

甲酯阴离子,当其回到基态时产生470nm的光,可持续几十分钟（如

图5）。

AMPPD为磷酸酯酶的直接化学发光底物,可用来检测碱性磷

酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。

可检测到碱性磷

酸酯酶的浓度为10-15mol/L。

美国DPC公司的Immulite全自动酶放大发光免疫分析仪,以碱

性磷酸酶为标记物,以金刚烷作发光底物,测定灵敏度相当于10-

21mol/mL的酶,采用聚苯乙烯珠作载体,其检测水平已能达到10-

12g/mL。

AMPPD是一种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底

物，其特点：

反应速度快，在很短时间内提供正确可靠的结果。

在它

的分子结构中有两个重要部分，一个是联接苯环和金刚烷的二氧四节

环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸根基团，它维持着整个分

子结构的稳定。

在通常情况下，这种化合物很稳定。

但是当有碱性磷

酸酶存在时，DioxetanePhosphate作为酶的底物会在酶的催化一脱去

磷酸根基团，形成一个不稳定的中间体。

这个中间体随即自行分解（二

氧四节环断裂），同时发射光子。

该试剂采用微粒子化学发光技术，采用最新磁性微粒，用以包被

抗体。

用碱性磷酸酶（ALP）标记抗原（抗体）。

经过普通抗原抗体

反应，碱性磷酸酶结合在微粒子上，碱性磷酸酶的结合量同病人血清

中的待测物质成比例。

经过洗涤（反应管两边有磁场，磁性微粒包被

的抗原抗体结合物被吸附在管子两边，其余游离部分被抽吸掉），最

后加入发光底物DioxetanePhosphate，5分钟后，仪器通过光电倍增

管检测反应的发光强度。

AMPPD是碱性磷酸酶的化学发光底物，在适宜的缓冲液中，随

着酶的催化水解作用，AMPPD分解成AMP-D，后者发出强度很高

的光信号，其发光的速度取决于碱磷酶的浓度。

当碱磷酶偶合到杂交

的探针时，便可以通过此系统检测到杂交分子的存在量。

2微粒体发光免疫分析

微粒体发光免疫分析（microparticleluminescenceenzyme

immunoassay,MLEIA）,该免疫分析技术有两种方法：

一种是小分子抗