高效液相色谱仪验证.docx
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高效液相色谱仪验证
中心化验室型
高效液相色谱仪验证
（一）验证方案
（二）验证报告
药业有限公司
中心化验室型
高效液相色谱仪验证方案
（SOP-YZ-?
?
?
）
方案制定人：
制定日期：
方案审查人：
审查日期：
方案审核人：
审核日期：
方案批准人：
批准日期：
药业有限公司
目录
1、概述
2、验证目的
3、验证实施小组成员及有关责任
4、验证文件
5、合格标准
6、验证方法和步骤
7、验证结果分析和综合评价
8、最终评价
9、验证周期
10、验证记录
1、概述
高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。
由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
其中LC-2010和Agilent1100型为单泵型，LC-20AB型为双泵型高效液相色谱仪。
2、验证目的
检查并确认高效液相色谱仪运行性能符合要求。
3、验证实施小组成员及有关责任
验证实施小组组长?
?
?
负责协调及异常情况的处理；操作员?
?
?
?
?
?
负责验证的具体操作工作；QA?
?
?
负责监督实施本方案。
4、主要验证文件
高效液相色谱法（SOP-ZL-?
?
?
）、
中华人民共和国国家计量检定规程液相色谱仪（JJG705-2002）、
UV-VIS检测器SPD-20A/SPD-20AV说明书、
溶液传输单元LC-20AB说明书、
中华人民共和国药典2005年版二部、
LC-2010A/2010C操作说明书安装手册和维修手册。
5、合格标准
验证部件
验证项目
合格标准
输液泵
流量设定值误差SS
0.5ml/min:
＜5%；1.0ml/min:
＜3%；2.0ml/min:
＜2%
流量稳定性误差SR
0.5ml/min:
＜3%；1.0ml/min:
＜2%；2.0ml/min:
＜2%
柱温箱
柱箱温度设定值误差ΔTS
＜±2℃
柱箱控温稳定性TC
≤1℃
自动进样器
进样量准确度误差
≤±2%
检测器
基线噪声
≤2×10－5AU
最小检测浓度
≤1×10－7g/mL（萘的甲醇溶液）
基线漂移
≤5×10－4AU/h
整机性能
定性测量重复性误差
RSD≤0.5%
定量测量重复性误差
RSD≤1.0%
6、验证方法和步骤
6.1验证方法
整个验证过程分为单个部件的验证和整机验证。
验证时一般先验证泵、柱温箱、自动进样器的性能，接着是检测器的性能，最后是整机的性能验证。
6.2验证步骤
6.2.1输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定
将仪器的输液系统，进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，流量设为1.0mL/min，按说明书启动仪器，待压力平稳后保持10分钟，按表1设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集，称重。
按式
（1）、式
（2）计算SS和SR。
表1
流量设定值（mL/min）
0.5
1.0
2.0
测量次数
3
3
3
流动相收集时间（min）
10
5
5
SS＝（Fm－FS）/FS×100%……
（1）
SR＝（Fmax－Fmin）/F×100%……
（2）
式中：
SS——流量设定值误差（％）；
SR——流量稳定性误差（％）；
Fm＝（W2－W1）/ρT·t，流量实测值（mL/min）；
W2——容量瓶＋流动相的重量（g）；
W1——容量瓶的重量（g）；
FS——流量设定值（mL/min）；
ρT——实验温度下流动相的密度（g/cm3）；
t——收集流动相的时间（min）；
Fmax——同一组测量中流量最大值（mL/min）；
Fmin——同一组测量中流量最小值（mL/min）；
F——同一组测量值的算术平均值（mL/min）。
输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定记录见附录一
6.2.2柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS和控温稳定性TC的检定
将数字温度计探头固定在柱温箱内，选择35℃和45℃进行检定。
按仪器说明书操作，通电升温，待温度稳定后，记下温度计读数并开始计时，以后每隔10min记录一次读数，共计7次，求出平均值。
平均值与设定值之差为ΔTS，7次读数中最大值与最小值之差为控温稳定性TC。
柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS和控温稳定性TC的检定原始记录见附录二。
6.2.3自动进样器进样量准确度误差的检定
取1.5ml进样瓶装入1ml水，用天平精密称定其重量，然后置于自动进样器上让其进样10次，每次50μl。
进样完成后再精密称定其重量，由重量差计算进样量准确度。
自动进样器进样量准确度误差的检定原始记录见附录三。
6.2.4检测器的检定
6.2.4.1检测器基线噪声和基线漂移的测定
取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长设定为254nm,开机预热，待仪器稳定后（约60min）记录基线60min，从30min内基线上读出噪音值；从60min基线上读出基线漂移值。
6.2.4.2检测器最小检测浓度的测定
取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长设定为254nm,开机预热，待仪器稳定后取1×10-7g/ml的萘/甲醇溶液进样20μl，记录色谱图，由色谱峰峰高和基线噪声峰峰高计算最小检测浓度CL。
公式如下：
CL=（2×Nd×C）/H
式中CL——最小检测浓度，g/ml；
Nd——基线噪声峰峰高，mm；
C——标准溶液浓度，g/ml；
H——标准溶液峰峰高，mm。
检测器的检定原始记录见附录四。
6.2.5整机性能的检定
取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长设定为254nm（当选用萘时）或272nm（当选用咖啡因时）,柱温设定为40℃。
开机预热待仪器稳定后取0.1mg/ml的萘/甲醇溶液或0.02mg/ml的咖啡因甲醇溶液进样10μl，连续进样6次，记录其峰面积和保留时间，以保留时间计算其定性测量重复性误差，以峰面积计算其定量测定重复性误差。
整机性能的检定原始记录见附录五。
7、验证结果分析和综合评价
验证部件
验证项目
合格标准
验证结果
结论
输液泵
流量设定值误差SS
0.5ml/min:
＜5%
1.0ml/min:
＜3%
2.0ml/min:
＜2%
流量稳定性误差SR
0.5ml/min:
＜3%；1.0ml/min:
＜2%；2.0ml/min:
＜2%
柱温箱
柱箱温度设定值误差ΔTS
＜±2℃
柱箱控温稳定性TC
≤1℃
自动进样器
进样量准确度误差
≤±2%
检测器
基线噪声
≤2×10－5AU
最小检测浓度
≤1×10－7g/mL（萘的甲醇溶液）
基线漂移
≤5×10－4AU/h
整机性能
定性测量重复性误差
RSD≤0.5%
定量测量重复性误差
RSD≤1.0%
验证小组签名
人员
日期
部门
8、最终批准
批准人：
批准日期：
年月日
9、验证周期
10、验证记录
（1）输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定记录
（2）柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS和控温稳定性TC的检定原始记录
（3）自动进样器进样量准确度误差的检定原始记录
（4）检测器的检定原始记录
（5）整机性能的检定原始记录
附录一
泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定原始记录
液相色谱仪型号：
泵型号：
流动相：
色谱柱:
检定日期：
检定人：
复核人：
FS
0.5ml/min
1.0ml/min
2.0ml/min
第一次
第二次
第三次
第一次
第二次
第三次
第一次
第二次
第三次
W1
W2
t
T
ρT
Fm＝（W2－W1）/ρT·t
SS＝（Fm－FS）/FS×100%
平均SS
F=（Fm1+Fm2+Fm3）/3
Fmax
Fmin
SR＝（Fmax－Fmin）/F×100%
此项检定结论：
附录二
柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS和控温稳定性TC的检定原始记录
液相色谱仪型号：
柱温箱型号：
数字温度仪型号：
T设定
35℃
45℃
时间
读数
时间
读数
稳定时
第1次
第2次
第3次
第4次
第5次
第6次
第7次
T平均
T最大
T最小
ΔTS=T平均-T设定
TC=T最大-T最小
此项检定结论：
检定人：
复核人：
检定日期：
附录三
自动进样器进样量准确度误差的检定原始记录
液相色谱仪型号：
自动进样器型号：
；
进样前进样瓶加水的总重：
W1=g；
进样后进样瓶加水的总重：
W2=g；
检定温度：
℃，水的密度ρg/ml；
进样量准确度误差=[（W1-W2）-（50×10×10-3×ρ）]/（50×10×10-3×ρ）×100%
此项检定结论：
检定人：
复核人：
检定日期：
附录四
检测器的检定原始记录
液相色谱仪型号：
检测器型号：
流动相：
流速：
色谱柱：
萘甲醇标准溶液浓度C：
配制人：
配制日期：
基线噪声:
Nd=
基线漂移:
H=
最小检测浓度的计算CL=（2×Nd×C）/H
此项检定结论：
检定人：
复核人：
检定日期：
附录五
整机性能的检定原始记录
仪器型号：
流动相：
色谱柱：
检测波长：
标准溶液类型：
浓度：
配制人：
配制时间：
定性测定（保留时间）
定量测定（峰面积）
第一次
第二次
第三次
第四次
第五次
第六次
平均值
测量误差的RSD
备注：
RSD采用EXCEL函数表格计算
此项检定结论：
检定人：
复核人：
检定日期：
中心化验室型
高效液相色谱仪验证报告
（SOP-YZ-4003）
方案制定人：
制定日期：
方案审查人：
审查日期：
方案审核人：
审核日期：
方案批准人：
批准日期：
药业有限公司
目录
1、概述
2、验证目的
3、验证实施小组成员及有关责任
4、验证文件
5、合格标准
6、验证方法和步骤
7、验证结果分析和综合评价
8、最终评价
9、验证周期
10、验证记录
1、概述
高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。
由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
其中LC-2010和Agilent1100型为单泵型，LC-20AB型为双泵型高效液相色谱仪。
2、验证目的
检查并确认高效液相色谱仪运行性能符合要求。
3、验证实施小组成员及有关责任
验证实施小组组长?
?
?
负责协调及异常情况的处理；操作员?
?
?
?
?
负责验证的具体操作工作；QA?
?
?
负责监督实施本方案。
4、主要验证文件
高效液相色谱法（SOP-ZL-?
?
?
）、
中华人民共和国国家计量检定规程液相色谱仪（JJG705-2002）、
UV-VIS检测器SPD-20A/SPD-20AV说明书、
溶液传输单元LC-20AB说明书、
中华人民共和国药典2005年版二部、
LC-2010A/2010C操作说明书安装手册和维修手册。
5、合格标准
验证部件
验证项目
合格标准
输液泵
流量设定值误差SS
0.5ml/min:
＜5%；1.0ml/min:
＜3%；2.0ml/min:
＜2%
流量稳定性误差SR
0.5ml/min:
＜3%；1.0ml/min:
＜2%；2.0ml/min:
＜2%
柱温箱
柱箱温度设定值误差ΔTS
＜±2℃
柱箱控温稳定性TC
≤1℃
自动进样器
进样量准确度误差
≤±2%
检测器
基线噪声
≤2×10－5AU
最小检测浓度
≤1×10－7g/mL（萘的甲醇溶液）
基线漂移
≤5×10－4AU/h
整机性能
定性测量重复性误差
RSD≤0.5%
定量测量重复性误差
RSD≤1.0%
6、验证方法和步骤
6.1验证方法
整个验证过程分为单个部件的验证和整机验证。
验证时一般先验证泵、柱温箱、自动进样器的性能，接着是检测器的性能，最后是整机的性能验证。
6.2验证步骤
6.2.1输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定
将仪器的输液系统，进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，流量设为1.0mL/min，按说明书启动仪器，待压力平稳后保持10分钟，按表1设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集，称重。
按式
（1）、式
（2）计算SS和SR。
表1
流量设定值（mL/min）
0.5
1.0
2.0
测量次数
3
3
3
流动相收集时间（min）
10
5
5
SS＝（Fm－FS）/FS×100%……
（1）
SR＝（Fmax－Fmin）/F×100%……
（2）
式中：
SS——流量设定值误差（％）；
SR——流量稳定性误差（％）；
Fm＝（W2－W1）/ρT·t，流量实测值（mL/min）；
W2——容量瓶＋流动相的重量（g）；
W1——容量瓶的重量（g）；
FS——流量设定值（mL/min）；
ρT——实验温度下流动相的密度（g/cm3）；
t——收集流动相的时间（min）；
Fmax——同一组测量中流量最大值（mL/min）；
Fmin——同一组测量中流量最小值（mL/min）；
F——同一组测量值的算术平均值（mL/min）。
输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定记录见附录一
结果：
泵流量设定值误差SS：
流量稳定性误差SR：
6.2.2柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS和控温稳定性TC的检定
将数字温度计探头固定在柱温箱内，选择35℃和45℃进行检定。
按仪器说明书操作，通电升温，待温度稳定后，记下温度计读数并开始计时，以后每隔10min记录一次读数，共计7次，求出平均值。
平均值与设定值之差为ΔTS，7次读数中最大值与最小值之差为控温稳定性TC。
柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS和控温稳定性TC的检定原始记录见附录二。
结果：
柱箱温度设定值误差ΔT：
控温稳定性TC：
6.2.3自动进样器进样量准确度误差的检定
取1.5ml进样瓶装入1ml水，用天平精密称定其重量，然后置于自动进样器上让其进样10次，每次50μl。
进样完成后再精密称定其重量，由重量差计算进样量准确度。
自动进样器进样量准确度误差的检定原始记录见附录三。
结果：
进样量准确度误差：
6.2.4检测器的检定
6.2.4.1检测器基线噪声和基线漂移的测定
取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长设定为254nm,开机预热，待仪器稳定后（约60min）记录基线60min，从30min内基线上读出噪音值；从60min基线上读出基线漂移值。
6.2.4.2检测器最小检测浓度的测定
取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长设定为254nm,开机预热，待仪器稳定后取1×10-7g/ml的萘/甲醇溶液进样20μl，记录色谱图，由色谱峰峰高和基线噪声峰峰高计算最小检测浓度CL。
公式如下：
CL=（2×Nd×C）/H
式中CL——最小检测浓度，g/ml；
Nd——基线噪声峰峰高，mm；
C——标准溶液浓度，g/ml；
H——标准溶液峰峰高，mm。
检测器的检定原始记录见附录四。
结果：
噪音值：
基线漂移值：
最小检测浓度CL：
6.2.5整机性能的检定
取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长设定为254nm（当选用萘时）或272nm（当选用咖啡因时）,柱温设定为40℃。
开机预热待仪器稳定后取0.1mg/ml的萘/甲醇溶液或0.02mg/ml的咖啡因甲醇溶液进样10μl，连续进样6次，记录其峰面积和保留时间，以保留时间计算其定性测量重复性误差，以峰面积计算其定量测定重复性误差。
整机性能的检定原始记录见附录五。
结果：
定性测量重复性误差：
定量测定重复性误差：
7、验证结果分析和综合评价
验证部件
验证项目
合格标准
验证结果
输液泵
流量设定值误差SS
0.5ml/min:
＜5%；1.0ml/min:
＜3%；2.0ml/min:
＜2%
流量稳定性误差SR
0.5ml/min:
＜3%；1.0ml/min:
＜2%；2.0ml/min:
＜2%
柱温箱
柱箱温度设定值误差ΔTS
＜±2℃
柱箱控温稳定性TC
≤1℃
自动进样器
进样量准确度误差
≤±2%
检测器
基线噪声
≤2×10－5AU
最小检测浓度
≤1×10－7g/mL（萘的甲醇溶液）
基线漂移
≤5×10－4AU/h
整机性能
定性测量重复性误差
RSD≤0.5%
定量测量重复性误差
RSD≤1.0%
验证小组签名
人员
日期
部门
8、最终批准
批准人：
批准日期：
年月日
9、验证周期
10、验证记录
（1）输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定记录
（2）柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS和控温稳定性TC的检定原始记录
（3）自动进样器进样量准确度误差的检定原始记录
（4）检测器的检定原始记录
（5）整机性能的检定原始记录
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