稀土金属元素标记行为考察.docx
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稀土金属元素标记行为考察
稀土金属元素标记行为考察
林虹君1冯流星2张爱红3韦超2王军2王昕3张养军1蔡耘1钱小红*1
1(蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,102206)
2(中国计量科学研究院,北京,100013)
3(防化学院,北京,102205)
摘 要稀土金属元素因其与双功能试剂螯合效率高、对肽段的反相色谱行为和质谱的离子化效率影响小、检测背景低以及过量金属离子在检测时不会产生干扰等优点,近年来已经在生物标记结合质谱定量分析研究领域引起了关注。
本研究选取稀土金属中单同位素元素铽(Tb)、钇(Y)、铥(Tm)、钬(Ho)和镥(Lu)5种元素,通过双功能试剂二乙三胺五乙酸双酸酐(DTPA双酸酐)对合成肽段及蛋白质酶切产物标记的过程进行了研究,包括对标记条件进行了优化以及对该质量标签的色谱行为和共洗脱、标记稳定性、离子交换、动态范围、质谱检测限等现象进行了考察,结果表明铥和钬两元素结合效率最高,分别达到了92.5%和89.9%;稳定性考察结果表明质量标签在4℃放置一周仍有95%被检测到,若将标记好的标签用于定量研究,则放置时间不能超过两周;多金属标记质量标签可以共洗脱;在两种金属浓度差不超过6倍时,由离子抑制带来的影响较小。
离子交换结果表明,只有很少部分发生了离子交换,对标记实验没有影响。
关键词稀土金属,质量标签,基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱
1引言
随着蛋白质组学研究的不断深入,蛋白质组学由定性表达谱向定量研究发展,而新的定量蛋白质组学方法的研究是生物标志物发现、验证和确认的重要支撑。
蛋白质组定量方法包括基于标记和非标记结合生物质谱的方法,而基于非标记的质谱定量方法是半定量方法,限制了其在定量研究中的应用,因此我们的研究工作仍然侧重于基于标记的质谱定量方法。
蛋白质标记方法主要有化学标记和生物标记,化学标记包括:
乙酰化标记、同位素标记[1]和ITRAQ标记[2,3]等;生物标记包括:
SILAC标记[4]等。
另外,酶促标记(如18O[5]标记)是常用的标记方法,但其稳定性和标记完全性还存在问题,因此寻求其它标记方法仍是定量研究的一个重要内容。
Meares研究组[6]在2004年以化学性质很相近的稀土金属元素为质量标签,提出了针对蛋白质巯基标记的新方法“元素标记亲和标签”(Element-codedaffinitytags,ECAT)。
刘等[7]在2006年将稀土金属通过双功能试剂与标准肽段结合,实现了基于质谱技术的蛋白质相对定量。
稀土金属元素用于蛋白质标记具有以下优点:
各金属元素物理化学性质非常相近,可以组成多种组合;与同位素试剂相比,稀土金属价格便宜[8];稀土金属元素之间分子量相差较大,可以有效避免同位素质谱峰重叠;与无机质谱结合对蛋白质进行定量分析,具有检测灵敏度高,定量动态范围大等特点[9]。
该方法的缺点是:
标记效率低,对于两种以上的不同金属的标记的可能性尚未研究。
本研究选用稀土金属铽(Tb)、钇(Y)[10]、铥(Tm)、钬(Ho)和镥(Lu)[11]作为质量标签,首先对标记条件进行优化,然后对标记效率、色谱行为、稳定性以及离子交换等指标分别进行了考察,结果表明将稀土金属标记方法用于蛋白质组相对定量时需要对稀土元素进行仔细选择和配对。
2 实验部分
2.1 仪器和试剂
基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(4800MALDITOF/TOFAnalyzer,美国ABSCIEX公司);真空离心干燥机(SC100ASpeedvacPlusMODULYOD-230,美国ThermoSavant公司);高效液相色谱仪(P230,大连依利特分析仪器有限公司);纯水系统(MilliQ,MerckMillipore公司)。
二乙三胺五乙酸双酸酐(diethylenetriamine-N,N,N',N'',N''',-pentaaceticaciddianhydride,DTPA双酸酐),四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA):
日本DOJINDO公司;三乙二胺碳酸盐(Triethylammoniumbicarbonate,TEAB):
美国Sigma公司;乙腈(HPLC级):
美国J.T.Baker公司;乙酸、醋酸铵均为分析纯:
北京化工厂;TbCl3、YCl3、TmCl3、HoCl3和LuCl3均为分析纯:
中国计量科学研究院。
2.2 实验方法
2.2.1 样品制备
TEAB:
0.05M,pH7.0;醋酸铵:
0.1M,pH6.0。
2.2.2 质谱分析
对样品分析时,取5μL处理好的样本溶液,与饱和的基质溶液(5mg/mLCHCA,溶于含0.1%TFA的50%乙腈中)按照1:
9的比例混合,取0.6μL点靶,在空气中挥发干燥,在基质辅助激光解析电离/飞行时间串联质谱仪上进行质谱分析。
数据采集条件:
正离子反射模式(MS-1KV),加速电压20KV,扫描范围m/z700~1600,谱图采集软件为4000series,累计采集1500~2000次。
根据同一肽段与金属元素标记后与标记前质谱峰峰高的比值来评估反应进行的完全程度,从而确定标记反应的最佳条件。
用标准多肽混合物进行质谱仪的外标校正。
3 结果与讨论
3.1标记元素的选择
选择金属元素时,首先考虑用单同位素金属作为标记元素,目的是为降低样品质谱图的复杂程度。
稀土金属元素中有8种是单同位素(见表1),按照两两配对,能够形成28种组合,其质量差从1到86Da不等,按照差值不小于4Da的原则,共有25种有效组合。
其次要考虑的是金属元素的螯合常数要足够大。
表2为选用的将金属元素和肽段连接起来的双功能试剂为DTPA双酸酐时的各金属与该试剂的螯合常数[12],如此大的螯合常数可以确保金属质量标签的稳定性。
三是不同金属元素的螯合常数相差不易过大。
差值过大则意味着两者在同一体系中时,容易发生金属离子的交换,因此所选元素的螯合常数相差以不超过1为宜。
据此条件,我们选择89Y、159Tb、165Ho、169Tm、和175Lu作为研究对象对质量标签的稳定性、色谱和质谱等行为进行了考察。
表1稀土元素中的单同位素元素
Table1monoisotopicelementsinlanthanideelements
Element
89Y
139La
140Ce
141Pr
159Tb
165Ho
169Tm
175Lu
89Y
50
51
52
70
76
80
86
139La
1
2
20
26
30
36
140Ce
1
19
25
29
35
141Pr
18
24
28
34
159Tb
6
10
16
165Ho
4
10
169Tm
6
175Lu
表28种单同位素元素与DTPA双酸酐的螯合常数
Table2TheconstantsofeightsingleisotopeelementschelatingwithDTPAdianhydride
元素名称
89Y
139La
140Ce
141Pr
159Tb
165Ho
169Tm
175Lu
螯合常数
22.05
19.48
20.50
21.07
22.71
22.78
22.72
22.44
3.2 标记条件优化
稀土金属标记方法是经由双功能试剂将稀土金属元素和目标肽段连接起来,通过对该质量标签标记肽段定量测定达到对蛋白质定量检测的目的。
由于双酸酐在水溶液中极易水解,所以其标记要严格遵循一定的反应顺序且要迅速完成。
首先选用标准肽段Kemptide进行标记条件优化。
具体步骤为:
首先将标准肽段Kemptide(0.14mg)和DTPA双酸酐(3.26mg)固体加入到TEAB溶液(320μL)中,剧烈涡振1min,离心样品至管底,室温放置0.5h。
真空离心干燥;然后用醋酸铵缓冲液重新溶解冻干的样品,再加入金属元素,于37℃水浴2h,为了提高金属元素的标记效率,加入金属离子的摩尔数为DTPA双酸酐的5倍。
将反应产物按1:
9与基质混合,取0.6μL点靶,进行MALDI-TOFMS分析。
如质谱图1所示,肽段与DTPA双酸酐结合后的谱图中未出现标准肽段LRRASLG的质谱峰(771.9106),而出现较强的肽段与DTPA双酸酐结合后的质谱峰(1147.4558),表明肽段与DTPA双酸酐结合效率达到了100%。
图1标准肽段(LRRASLG)与DTPA双酸酐结合质谱图
Fig.1TheMSspectraofstandardpeptide(LRRASLG)combinedwithDTPAdianhydride
在此基础上,考察双酸酐试剂与金属元素的标记效率。
由于双酸酐试剂与金属元素络和效率不仅与螯合常数有关,还与体系温度、反应时间、缓冲液pH以及金属过量倍数有关,因此,为了得到最佳螯合率,选择金属铥和钬对以上影响因素分别进行了考察。
如图2a所示,通过对反应温度25℃、37℃、60℃和80℃考察,结果表明在37℃时标记效率最高,达到71%;图2b中,通过对pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5进行考察,在pH6时螯合率最高,达到76%;图2c中,通过对反应时间0.5h、1h、2h、3h、5h和过夜进行考察,在反应时间2h时螯合率最高,达到86%;图2d中,通过对金属离子与DTPA双酸酐的摩尔比例为1倍、2倍、3倍、5倍和10倍进行考察,在两者比例为5倍时,螯合率最高,达到90%。
图2反应温度(a)、pH值(b)、反应时间(c)及金属离子与DTPA双酸酐摩尔比(d)对螯合效率的影响
Fig.2Theeffectoftemperature(a),pH(b),time(c)andmoleratioofmetaliontoDTPAdianhydride(d)onchelationrate
从图2可以看出,优化后的最佳条件为:
温度37℃、pH6、反应时间2h、金属离子浓度是肽段的5倍,此条件同样可适用于其它稀土金属元素。
在此条件得到的Y、Tb、Ho、Tm和Lu的质谱图见图3,其标记率见表3。
e
d
c
b
a
图3标准肽段(LRRASLG)与稀土金属Y(a)、Tb(b)、Ho(c)、Tm(d)和Lu(e)标记质谱图
Fig.3TheMSspectraofstandardpeptide(LRRASLG)chelatedwithrareearthmetalY(a)、Tb(b)、Ho(c)、Tm(d)andLu(e)
表35种单同位素元素与肽段LRRASLG标记率
Table3Theratioof5singleisotopeelementscombiningwithLRRASLG
金属元素名称
LRRASLG-DTPA(m/z,1+)
LRRASLG-DTPA-M(m/z,1+)
标记率(%)
Y
1147.7452
1233.6375
75.6
Tb
1147.4331
1303.3065
72.8
Ho
1147.6415
1309.5472
89.9
Tm
1147.5618
1313.5570
92.5
Lu
1147.5431
1319.4457
68.9
图3表明,不同金属元素与同一肽段的结合率不同,其中Y和Tb的标记率较为相近,Ho和Tm的标记率较为相近(见表3)。
因此,在接下来试验中,将Y和Tb作为一组用于双金属标签标记,Ho和Tm作为一组用于双金属标签标记,只有Lu标记率较低,且杂峰较多,不宜与其它元素配对,因此,将主要对Y、Tb、Ho和Tm四种元素进行研究。
3.3金属标记物的稳定性考察
金属标签的稳定性对于其在实际样品中的应用至关重要,因此该质量标签要具备一定的稳定性。
Tb和Y的稳定性已在刘[7]研究中考察,下面仅对Tm和Ho进行研究。
将标记好的样品放于4℃一周后(见图4a和图4e)进行质谱检测,仍有95%(峰强度)的标记产物被检测到。
在放置两周、三周和四周后再分别检测,发现质谱峰强度逐渐下降,金属离子标记的目标峰比例逐渐下降,肽段的质谱峰和第一步反应产物的质谱峰逐渐增强。
下图是铥元素和钬元素在4℃放置一周、两周、三周和四周的质谱图的分析结果。
h
g
f
e
d
a
b
c
图4稀土金属铥(Tm)标记产物放置一周(a)、两周(b)、三周(c)、四周(d)
和钬(Ho)标记产物放置一周(e)、两周(f)、三周(g)和四周(h)的质谱图的质谱图
Fig.4TheMSspectraofThulium(Tm)labeledafteroneweek(a),twoweeks(b),threeweeks(c),fourweeks(d)
andHolmium(Ho)labeledafteroneweek(e),twoweeks(f),threeweeks(g)andfourweeks(h)
从图4可以看出,将标记有金属的质量标签在4℃放置一段时间后,由于温度的降低,质量标签会有部分降解,且随着放置时间的进一步延长,尤其超过两周,质量标签的分解逐渐增强,标签的峰强度逐渐降低,生成的中间产物的峰强度逐渐增强。
因此,若将标记好的标签用于定量研究,则放置时间不能超过两周。
3.4金属交换现象的考察
当质量标签含有两种或更多不同金属元素的标签时,除考虑各个络合物的稳定性之外,还要考虑各金属元素之间的交换标记问题。
由于不同金属元素与DTPA双酸酐的结合常数不完全相同,当该常数相差较大的两种金属的络合物在同一体系中时,螯合常数大的金属离子可能将螯合常数小的金属离子从其络合物中置换出来,影响标记。
c
d
b
a
图6稀土金属钬和铥、钇和铽交换实验质谱图:
将钬元素加入到铥标签(a)、将铥元素加入到钬标签中(b)、
将钇元素加入到铽标签中(c)、将铽元素加入到钇标签中(d)
Fig.6TheMSspectraofrareearthmetalHolmiumandThulium,TerbiumandYttriumaftercrosslabeled:
addHotoTmlabels(a),addTmtoHolabels(b),addYttriumtoTerbiumlabels(c),addTerbiumtoYttriumlabels(d)
为此,分别将金属钬的盐酸盐加入到标记好的铥-肽溶液中(图6a),将金属铥的盐酸盐加入到钬-肽溶液中(图6b),两者都放置24h后,Ho和Tm的交换结果表明,只有很少(小于3%)的金属发生了置换(图6a中标签1309.1326置换1313.1331,图6b中标签1313.1327置换1309.1311)。
同样,将金属Y的盐酸盐加入到标记好的Tb-肽溶液中(图6c),将金属Tb的盐酸盐加入到Y-肽溶液中(图6d),置换24h,Tb和Y的交换结果表明,只有很少(小于3%)的金属发生了置换(图6c中为标签1233.4326置换1303.4175,图6d中为标签1303.4835置换1233.4670)。
以上结果表明结合常数是选择金属元素的一个重要指标,既要保证该常数足够大(有足够稳定性),又要保证相互之间相差不能太大(避免交换标记)。
3.5金属标记物的色谱行为考察
刘[7]已对Y和Tb的共洗脱进行过考察,发现两金属对同一肽段标记的质量标签是共洗脱。
本文考察了金属Tb、Ho、Tm和Lu与肌红蛋白(myoglobin,MYO)酶切肽段的洗脱行为,首先对肌红蛋白酶切肽段进行标记,然后将标记有不同稀土金属的肽段1、2、3和4经LC-MS分析,如图7所示。
图7不同金属离子标记的肌红蛋白酶切肽段LC-MS的共洗脱质谱图
Fig.7TheanalysisofthelabeledpeptidemixtureofMYObyLC-MS
图7表明,标记有金属Tb、Ho、Tm和Lu的同一肽段为共洗脱,洗脱时间除Lu为22.14min外,其余均为21.90min,从洗脱时间结果再次说明,稀土元素Lu不适合与其它元素配对用于标记。
实验结果表明基于稀土元素标记可以用于蛋白质组定量分析。
将标记有不同稀土金属离子的肽段混合物通过LC-MS分析鉴定,实验结果显示标记有不同稀土金属离子的同一肽段在液相分离中能够被共洗脱。
3.6检测限
为了考察稀土元素标记后肽段的检测限,本实验将铥和钬标记样品分别稀释为不同的浓度梯度(见表4),然后进行MALDI源质谱分析,结果如图9和图10所示。
表4铥和钬稀释后的浓度梯度
Table4ThegradientconcentrationofTmandHoafterdeliquation
金属元素标签
铥
钬
浓度梯度
(pmol/μL)
a
432
398
b
43.2
39.8
c
21.6
19.9
d
4.32
3.98
e
2.16
1.99
f
1.08
1.00
图9稀土金属铥(Tm)标记产物在不同浓度时的质谱图
Fig.9TheMSspectraofrareearthmetalThulium(Tm)labeledatdifferentconcentration
图10稀土金属钬(Ho)标记产物在不同浓度时的质谱图
Fig.10TheMSspectraofrareearthmetalHolmium(Ho)labeledatdifferentconcentration
将铥和钬两元素质量标签的浓度分别从432pmol/μL和398pmol/μL稀释到1.08pmol/μL和1.00pmol/μL(见表4),从对应的质谱图可以看出,在稀释不同倍数后,质谱峰强度逐渐减弱,当浓度分别达到1.08pmol/μL和1.00pmol/μL时,目标峰变得很弱,而此时噪音峰强度已明显增强。
因此可以得出MALDI源质谱对稀土金属标签的检测限可达近1pmol/μL。
3.7动态范围
不同金属元素与肽段标记后在质谱中的响应程度不同,同时该响应程度随样品浓度变化会有差别。
而且当两种不同金属标记的样本在同一体系中时,相互之间会有离子抑制效应。
诸多因素共同作用,使得多元素标记时,理论比例与实测比例有较大差别。
为了考察稀土金属的离子抑制效应,将两种元素分别标记的肌红蛋白的酶切肽段溶液按不同比例(摩尔比)混合,进行质谱分析。
刘[7]已对稀土金属元素Tb和Y的动态范围做过研究,本文仅对Ho和Tm进行考察。
首先将Ho和Tm与MYO酶切肽段进行标记,然后将标记好的肽段按照比例(Tb/Y)分别为1:
10、1:
6、1:
3、1:
1、3:
1、6:
1、10:
1(摩尔比)进行混合,进行MALDI-TOFMS分析,测定两金属标签的实际比例。
实验结果见表5。
表5肌红蛋白酶切肽段ALELFR与Tb/Y、Ho/Tm离子抑制效应
Table5TheionsuppressioneffectofpeptideALELFRfrommyoglobinchelatingwithrareearthmetalsTb/Y,Ho/Tm
理论比例
1:
10
1:
6
1:
3
1:
1
3:
1
6:
1
10:
1
测得比例
Tb/Y
0.20
0.39
0.50
1.65
4.55
8.18
19.46
Ho/Tm
0.13
0.22
0.41
1.16
3.46
6.79
13.68
结果表明,随着两金属浓度差的变化,两对金属的实测比例与理论加入比例差异会增大,而且当两者比例相差越大,由此带来的差异也越大。
由于一般在定量蛋白质组学研究中,当差异比值大于2时,即认为是显著差异,所以,该结论并不影响差异较大的蛋白质组的比较分析。
3.8 ε-氨基封闭
金属元素与标准肽段LRRASLG标记,不存在侧链氨基的干扰问题,但对于蛋白质酶切肽段,因含有ε-氨基,而DTPA双酸酐与氨基的反应没有选择性,即会与ε-氨基反应,又由于位阻等因素的影响,该反应进行不完全,因此会使定量结果误差显著增大。
所以,在进行金属离子螯合之前,必须将ε-氨基进行封闭[13]。
胍基化反应封闭赖氨酸的ε-氨基的优点一是反应完全;二是由于高精氨酸的胍基(pKa=12.48)比赖氨酸的氨基(pKa=10.48)有更强的碱性,所以更容易结合质子带上正电荷,能提高以K结尾肽段在MALDI源质谱分析中的信号强度,因此,选择胍基化反应封闭赖氨酸的ε-氨基。
其反应条件为:
pH11.0;胍基化试剂浓度:
100mM;反应温度:
37℃;反应时间:
4h。
实验结果见图11。
图11马心肌红蛋白酶切肽段胍基化修饰前(a)、后(b)质谱图
Fig.11TheMSspectraofpeptidesfromMYGbeforeguanidination(a)andafterguanidination(b),respectively
由图11可知,在此条件下,含有赖氨酸的肽段完全被封闭。
另外,马心肌红蛋白酶切肽段在胍基化修饰前,只有1606.7694和1884.9136丰度较强(见图11a),而胍基化修饰后,无论高丰度峰个数和峰整体强度都有明显提高(见图11b)。
因不含ε-氨基而没有胍基化修饰的1606.7694峰强度没有发生明显变化。
另外,还选择α-乳白蛋白和β-乳白蛋白酶切肽段进行胍基化修饰,结果列于表6中。
表6α-乳白蛋白和β-乳白蛋白酶切肽段胍基化修饰结果
Table6Peptidesofα-lactalbuminandβ-lactalbuminmodifiedbyguanidine
α-乳白蛋白
β-乳白蛋白
肽段序列
胍基化前
肽段质量
胍基化后
肽段质量
胍基化率
肽段序列
胍基化前
肽段质量
胍基化后
肽段质量
胍基化率
VIISAPSADAPMFVMGVNHEK
2213.1093
2255.8267
100.00%
GITWKEETLMEYLENPK
2081.0259
2123.6978
100.00%
GAAQNIIPASTGAAK
1369.7434
1411.5839
95.33%
TGQAPGFTYTDANKNK
1712.8238
1796.8598
100.00%
VIPELNGK
869.5091
911.3527
100.00%
CAQCHTVEKGGK
1018.4444
1060.3987
100.00%
TVDGPSGK
760.3835
802.3223
100.00%
EDLIAYLKK
964.5349
1006.4217
100.00%