应用多重PCR技术检测慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变.docx
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应用多重PCR技术检测慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变
应用多重PCR技术检测慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变
【摘要】 免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因突变是慢性淋巴细胞白血病(CLL)最重要的独立预后因素之一,为探讨CLL患者IgVH基因突变状态,应用多重PCR技术检测9例CLL患者的IgVH基因,纯化PCR扩增产物后直接测序,应用IMGT/V-QUEST工具分析,明确有无IgVH突变及突变位置。
结果表明:
9例CLL患者皆扩增出395-465bp区域(MIXI)或290-360bp区域(MIXII)单克隆条带,测序结果显示5例患者有突变,IgVH基因分别为IGHV3-11*03、IGHV3-9*01、IGHV3-23*01、IGHV4-59*01和IGHV4-34*02;4例无突变,IgVH基因为IGHV3-53*01、IGHV3-23*03、IGHV3-33*05和IGHV3-7*01。
结论:
PCR检测IgVH基因突变,简化了繁琐的实验过程,缩短了实验时间,解决传统PCR对IgVH基因突变检测的桎梏,值得在临床和科研中推广使用。
【关键词】多重PCR;IgVH;基因突变
DetectionofIgVHMutationStatusinPatientswithChronicLymphocyticLeukemiabyMultiplexPCR
AbstractIgVHmutationstatusisoneofthemostimportantindependentprognosticfactorofchroniclymphocyticleukemia(CLL).InordertoevaluateIgVHmutationstatusinpatientswithCLL,IgVHmutationwasdetectedbymultiplexPCRin9CLLpatientsandpurifiedPCRamplificationproductsweredirectlysequenced,IgHsomatichypermutationandmutationsitewereanalysedbyIMGT/V-QUEST.Theresultsshowedthat5patientshadmutatedIgVH,andIgVHswereIGHV3-11*03,IGHV3-9*01,IGHV3-23*01,IGHV4-59*01,IGHV4-34*02,respectively;whereas4othershadunmutatedIgVH,theseIgVHswereIGHV3-53*01,IGHV3-23*03,IGHV3-33*05andIGHV3-7*01.ItisconcludedthatmultiplexPCRisarapidandeasymethodtodetectIgVHmutationstatus,anditsolvesthelimitationsandpitfallsofroutinePCR,anditisworthbeingextensivelyusedbothinclinicandscientificresearches.
KeywordsMultiplexPCR;IgVH;genemutation
慢性淋巴细胞白血病(CLL)是西方国家最常见的一种恶性淋巴细胞增殖性疾病,约占全部成人白血病的30%,主要发生在老年人,男女比例为∶1。
我国发病率虽然低于西方国家,但随着人口的老龄化,发病率呈现逐年上升趋势。
CLL患者的临床病程和转归呈高度异质性,部分患者生存同年龄、性别匹配的正常人相同,而部分患者即使接受了早期的积极治疗仍很快死亡[1,2]。
因此,CLL预后因素的检测就显得尤为重要。
近来多个研究组[3-6]证实,免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因突变是最重要的独立预后因素之一。
本研究旨在应用多重RT-PCR技术研究CLL患者IgVH基因突变。
材料和方法
研究对象
随机选取我院血液科住院或门诊的CLL患者,共9例,其中男7例,女2例,中位年龄55(36-77)岁。
临床分期应用Binet分期,BinetA期2例、BinetB期5例、BinetC期2例。
所有患者进行外周血常规、骨髓细胞形态学和多参数流式细胞术细胞免疫分型检测,诊断与分期均根据《血液病诊断与疗效标准》[7]确定。
实验室检查:
外周血WBC数10×109/L,淋巴细胞比例≥50%,绝对值≥5×109/L,骨髓增生活跃或明显活跃,淋巴细胞数40%,以成熟淋巴细胞为主;免疫表型:
CD10-、CD19+、CD5+、CD23+、CD20+和FMC7-,并排除其他疾病。
收集患者的外周血或骨髓标本,用淋巴细胞分离液收集单个核细胞。
IgVH基因的多重PCR检测
RNA抽提及逆转录采取TRIZOL一步法抽提RNA,并予以逆转录。
逆转录反应体系:
RNA2μg,oligodT1μl(μg/l),5×Buffer8μl,dNTP(40mmol/L)2μl,AMV10U(1μl),RNasin40U(1μl),DTT(100mmol/L)1μl,加DEPC水至40μl,70℃,10分钟;冰上至少10分钟;42℃,1小时;95℃,5分钟;冰浴5分钟,-80℃保存。
PCR引物IgVH片段由3个框架区(framework,FR)和两个抗原互补决定区(complementarity-determiningregions,CDR)组成(图1)。
IgVH基因引物由InVivoScribe公司提供(InVivoScribe,USA),定购该公司编号为5-101-0010的IGHSomaticHypermutationAssayforGelDetection试剂盒,其中有两种混合引物:
MIXI和MIXII,前者扩增领头区(leader)和JH之间的基因,后者扩增FR1与JH间的基因。
以GAPDH为内参照,上游引物:
3‘-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-5‘,下游引物:
3‘-GAAGATGGTGATGGGATTTC-5‘,扩增片断为230bp。
PCR反应体系MIXI或MIXII45μl,TaqDNA聚合酶1U(μl),cDNA模板5μl,共50μl反应体系。
反应条件是:
94℃7分钟后,94℃45秒;60℃45秒;72℃90秒扩增35个循环后,72℃10分钟。
以相同条件扩增试剂盒中提供的阳性和阴性参照。
2%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察到7例慢淋患者扩增出395-465bp区域(MIXI)单克隆条带,2例标本扩增出290-360bp区域(MIXII)单克隆条带。
PCR产物序列分析未纯化PCR原液由上海生工纯化后直接测序。
测序结果应用IMGT/V-QUEST数据库分析(http:
//),明确有无IgVH突变及突变位置。
IgVH碱基突变率=错配碱基数÷可变区总碱基数,IgVH碱基突变率≥2%定为体细胞突变标准[4,5]。
结果
9份标本皆先用MIXI进行扩增,其中7个扩增出395-465bp区域的单克隆条带(标本号为1、2、4、5、7、8、9),3号和6号标本未扩增出特异性条带,再用MIXII扩增,扩增体系和反应条件同MIXI,结果扩增出290-360bp区域的单克隆条带(图2)。
测序结果应用IMGT/V-QUEST数据库分析(图3)。
5例患者有体细胞突变,3例处于BinetB期,2例处于BinetC期,IgVH基因分别为IGHV3-11*03、IGHV3-9*01、IGHV3-23*01、IGHV4-59*01和IGHV4-34*02;4例无突变,2例BinetA期,2例BinetB期,IgVH基因分别为IGHV3-53*01、IGHV3-23*03、IGHV3-33*05和IGHV3-7*01。
IgVH突变分析见表1。
Table.IgVHmutationstatusanalysisof9CLLpatients
讨论
CLL是淋巴细胞克隆性增殖为特征的高度异质性恶性血液系统疾病。
其预后的异质性使得CLL预后因素的检测就显得尤为重要,其中有无IgVH基因体细胞突变已被证实是目前为止与预后相关最为密切的因素。
CLL根据有无IgVH基因体细胞突变分成两种类型。
无IgVH基因突变型:
起源于生发中心前B细胞,为生发中心前期肿瘤,病情进展快、生存期短,临床分期多为晚期;IgVH基因突变型:
起源于记忆B细胞,为生发中心后期肿瘤,病程进展缓慢,生存期很长,临床分期多在早期[3,6]。
本组9例患者,4例无IgVH基因突变患者2例处于BinetA期,2例处于BinetB期;5例IgVH基因突变型患者3例处于BinetB期、2例Binet处于C期。
但9例患者至今皆只随访2年左右,病情尚无变化。
由于随访时间短,病例数少,IgVH突变情况无法与分期形成有效统计,这有待于我们在今后的研究中进一步增加病例数,延长随访时间,观察疾病进展情况以作出准确判断。
正常和恶性B细胞中最常见的VH家族是VH3(30%-50%)和VH4(20%-30%),其次是VH1(10%-20%)家族,占总数的75%-95%;在PrecursorB-ALL中VH6也多见[8]。
本研究中9例标本的IgVH基因有7例属于VH3,2例属于VH4,与报道相符。
但Tobin等[9]报道,IgVH基因突变型患者以VH3-21多见,无IgVH基因突变型患者以VH1-69多见。
但本组9例标本均未见以上两种IgVH基因类型。
每一个B细胞都有自己长度和序列特异的由可变区(V)、多变区(D)和结合区(J)片段重排形成的位于14q32、大约1250bpIgH基因。
IgH基因包括7个VH家族(现已发现52个有功能的VH片段,30个无功能的VH片段)、7个DH家族(现已发现27个有功能的DH片段)、6个JH家族(现已发现6个有功能的JH片段)。
不同V、D、J区的排列组合大约有2×106,而基因重组过程中的核苷酸的随机缺失和插入,使得排列组合的数目剧增,超过至1012。
淋巴细胞的Ig分子要经过生发中心的体细胞高度突变才能成为成熟的B细胞(因此生发中心或生发中心后期起源的成熟的B细胞恶性肿瘤中存在有体细胞突变),而这一过程同时扩大了Ig排列组合的数目[8,10]。
IgVH基因片段中FR序列相对保守,而CDR即使在同一VH家族中也高度不同,是生发中心期体细胞突变的高发区,尽管FR不易发生体细胞突变,但可发生核苷酸置换,尤其易发生在高度突变的B细胞。
现在在一些实验室开展的PCR技术检测IgVH基因是应用单个VH通用引物,与三个FR中的一个通常是FR3的序列互补,这种通用引物不能以相同效率扩增所有VH片段;而且由于体细胞突变并不是局限于CDR,也会发生在FR,如果FRs区域发生了基因突变,就会阻碍通用引物和FR的目的序列结合,导致克隆PCR产物检测失败。
由于IgH基因的多态性,CLLIgVH突变状态应用常规PCR方法检测所需引物众多,技术繁杂,标本需求量大,耗时久,费用高,在普通的实验室难以开展,且容易产生假阴性或假阳性结果。
因此虽然早在10多年前就提出IgVH体细胞突变与CLL预后有密切关系,但大部分实验室无常规开展此工作的条件。
本研究小组曾在1年前应用上述方法检测IgVH突变状态,在近30份标本中仅1份扩增出特异性片段,每份标本需进行36次PCR过程,由于其耗时低效而终止研究。
而本次研究采用多重PCR检测IgVH基因突变,简化了繁琐的实验过程,缩短了实验时间,而且由于InVivoScribe公司提供的试剂盒中提供阳性和阴性参照,减少了假阴性假阳性结果出现的几率,使实验结果更加可信。
多重PCR解决了传统PCR对IgVH基因突变检测的桎梏,值得在临床和在科研中推广。
现在国内外大量实验证实,IgVH基因突变与ZAP-70、CD38、细胞遗传学异常、sCD23、胸苷激酶、LPL等一系列CLL预后指标都有一定的相关性[6,11]。
我们将进一步进行IgVH基因突变与上述CLL指标的预后关系,以便共同评价预后,指导治疗。
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