应用多重PCR技术检测慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变.docx

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应用多重PCR技术检测慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变

应用多重PCR技术检测慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变

【摘要】　　免疫球蛋白重链可变区（IgVH）基因突变是慢性淋巴细胞白血病（CLL）最重要的独立预后因素之一，为探讨CLL患者IgVH基因突变状态，应用多重PCR技术检测9例CLL患者的IgVH基因，纯化PCR扩增产物后直接测序，应用IMGT/V-QUEST工具分析，明确有无IgVH突变及突变位置。

结果表明：

9例CLL患者皆扩增出395-465bp区域（MIXI）或290-360bp区域（MIXII）单克隆条带，测序结果显示5例患者有突变，IgVH基因分别为IGHV3-11*03、IGHV3-9*01、IGHV3-23*01、IGHV4-59*01和IGHV4-34*02；4例无突变，IgVH基因为IGHV3-53*01、IGHV3-23*03、IGHV3-33*05和IGHV3-7*01。

结论：

PCR检测IgVH基因突变，简化了繁琐的实验过程，缩短了实验时间，解决传统PCR对IgVH基因突变检测的桎梏，值得在临床和科研中推广使用。

【关键词】多重PCR；IgVH；基因突变

　　DetectionofIgVHMutationStatusinPatientswithChronicLymphocyticLeukemiabyMultiplexPCR

　　AbstractIgVHmutationstatusisoneofthemostimportantindependentprognosticfactorofchroniclymphocyticleukemia（CLL）.InordertoevaluateIgVHmutationstatusinpatientswithCLL,IgVHmutationwasdetectedbymultiplexPCRin9CLLpatientsandpurifiedPCRamplificationproductsweredirectlysequenced,IgHsomatichypermutationandmutationsitewereanalysedbyIMGT/V-QUEST.Theresultsshowedthat5patientshadmutatedIgVH,andIgVHswereIGHV3-11*03,IGHV3-9*01,IGHV3-23*01,IGHV4-59*01,IGHV4-34*02,respectively;whereas4othershadunmutatedIgVH,theseIgVHswereIGHV3-53*01,IGHV3-23*03,IGHV3-33*05andIGHV3-7*01.ItisconcludedthatmultiplexPCRisarapidandeasymethodtodetectIgVHmutationstatus,anditsolvesthelimitationsandpitfallsofroutinePCR,anditisworthbeingextensivelyusedbothinclinicandscientificresearches.

　　KeywordsMultiplexPCR;IgVH;genemutation

　　慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方国家最常见的一种恶性淋巴细胞增殖性疾病，约占全部成人白血病的30%，主要发生在老年人，男女比例为∶1。

我国发病率虽然低于西方国家，但随着人口的老龄化，发病率呈现逐年上升趋势。

CLL患者的临床病程和转归呈高度异质性，部分患者生存同年龄、性别匹配的正常人相同，而部分患者即使接受了早期的积极治疗仍很快死亡［1,2］。

因此，CLL预后因素的检测就显得尤为重要。

近来多个研究组［3-6］证实，免疫球蛋白重链可变区（IgVH）基因突变是最重要的独立预后因素之一。

本研究旨在应用多重RT-PCR技术研究CLL患者IgVH基因突变。

　　材料和方法

　　研究对象

　　随机选取我院血液科住院或门诊的CLL患者，共9例，其中男7例，女2例，中位年龄55（36-77）岁。

临床分期应用Binet分期，BinetA期2例、BinetB期5例、BinetC期2例。

所有患者进行外周血常规、骨髓细胞形态学和多参数流式细胞术细胞免疫分型检测，诊断与分期均根据《血液病诊断与疗效标准》［7］确定。

实验室检查:

外周血WBC数10×109/L，淋巴细胞比例≥50%，绝对值≥5×109/L，骨髓增生活跃或明显活跃，淋巴细胞数40%，以成熟淋巴细胞为主；免疫表型：

CD10-、CD19+、CD5+、CD23+、CD20+和FMC7-，并排除其他疾病。

收集患者的外周血或骨髓标本，用淋巴细胞分离液收集单个核细胞。

　　IgVH基因的多重PCR检测

　　RNA抽提及逆转录采取TRIZOL一步法抽提RNA，并予以逆转录。

逆转录反应体系：

RNA2μg，oligodT1μl（μg/l），5×Buffer8μl，dNTP（40mmol/L）2μl，AMV10U（1μl），RNasin40U（1μl），DTT（100mmol/L）1μl，加DEPC水至40μl，70℃,10分钟；冰上至少10分钟；42℃，1小时；95℃，5分钟；冰浴5分钟，-80℃保存。

　　PCR引物IgVH片段由3个框架区（framework,FR）和两个抗原互补决定区（complementarity-determiningregions,CDR）组成（图1）。

IgVH基因引物由InVivoScribe公司提供（InVivoScribe,USA），定购该公司编号为5-101－0010的IGHSomaticHypermutationAssayforGelDetection试剂盒，其中有两种混合引物：

MIXI和MIXII，前者扩增领头区（leader）和JH之间的基因，后者扩增FR1与JH间的基因。

以GAPDH为内参照，上游引物：

3‘-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-5‘，下游引物：

3‘-GAAGATGGTGATGGGATTTC-5‘，扩增片断为230bp。

　　PCR反应体系MIXI或MIXII45μl，TaqDNA聚合酶1U（μl），cDNA模板5μl，共50μl反应体系。

反应条件是：

94℃7分钟后，94℃45秒；60℃45秒；72℃90秒扩增35个循环后，72℃10分钟。

以相同条件扩增试剂盒中提供的阳性和阴性参照。

2%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察到7例慢淋患者扩增出395-465bp区域（MIXI）单克隆条带，2例标本扩增出290-360bp区域（MIXII）单克隆条带。

　　PCR产物序列分析未纯化PCR原液由上海生工纯化后直接测序。

测序结果应用IMGT/V-QUEST数据库分析（http:

//），明确有无IgVH突变及突变位置。

IgVH碱基突变率=错配碱基数÷可变区总碱基数，IgVH碱基突变率≥2%定为体细胞突变标准［4,5］。

　　结果

　　9份标本皆先用MIXI进行扩增，其中7个扩增出395-465bp区域的单克隆条带（标本号为1、2、4、5、7、8、9），3号和6号标本未扩增出特异性条带，再用MIXII扩增，扩增体系和反应条件同MIXI，结果扩增出290-360bp区域的单克隆条带（图2）。

测序结果应用IMGT/V-QUEST数据库分析（图3）。

5例患者有体细胞突变，3例处于BinetB期，2例处于BinetC期，IgVH基因分别为IGHV3-11*03、IGHV3-9*01、IGHV3-23*01、IGHV4-59*01和IGHV4-34*02；4例无突变，2例BinetA期，2例BinetB期，IgVH基因分别为IGHV3-53*01、IGHV3-23*03、IGHV3-33*05和IGHV3-7*01。

IgVH突变分析见表1。

Table.IgVHmutationstatusanalysisof9CLLpatients

　　讨论

　　CLL是淋巴细胞克隆性增殖为特征的高度异质性恶性血液系统疾病。

其预后的异质性使得CLL预后因素的检测就显得尤为重要，其中有无IgVH基因体细胞突变已被证实是目前为止与预后相关最为密切的因素。

CLL根据有无IgVH基因体细胞突变分成两种类型。

无IgVH基因突变型：

起源于生发中心前B细胞，为生发中心前期肿瘤，病情进展快、生存期短，临床分期多为晚期；IgVH基因突变型：

起源于记忆B细胞，为生发中心后期肿瘤，病程进展缓慢，生存期很长，临床分期多在早期［3,6］。

本组9例患者，4例无IgVH基因突变患者2例处于BinetA期，2例处于BinetB期；5例IgVH基因突变型患者3例处于BinetB期、2例Binet处于C期。

但9例患者至今皆只随访2年左右，病情尚无变化。

由于随访时间短，病例数少，IgVH突变情况无法与分期形成有效统计，这有待于我们在今后的研究中进一步增加病例数，延长随访时间，观察疾病进展情况以作出准确判断。

正常和恶性B细胞中最常见的VH家族是VH3（30%-50%）和VH4（20%-30%），其次是VH1（10%-20%）家族，占总数的75%-95%；在PrecursorB-ALL中VH6也多见［8］。

本研究中9例标本的IgVH基因有7例属于VH3，2例属于VH4，与报道相符。

但Tobin等［9］报道，IgVH基因突变型患者以VH3-21多见，无IgVH基因突变型患者以VH1-69多见。

但本组9例标本均未见以上两种IgVH基因类型。

每一个B细胞都有自己长度和序列特异的由可变区（V）、多变区（D）和结合区（J）片段重排形成的位于14q32、大约1250bpIgH基因。

IgH基因包括7个VH家族（现已发现52个有功能的VH片段，30个无功能的VH片段）、7个DH家族（现已发现27个有功能的DH片段）、6个JH家族（现已发现6个有功能的JH片段）。

不同V、D、J区的排列组合大约有2×106，而基因重组过程中的核苷酸的随机缺失和插入，使得排列组合的数目剧增，超过至1012。

淋巴细胞的Ig分子要经过生发中心的体细胞高度突变才能成为成熟的B细胞（因此生发中心或生发中心后期起源的成熟的B细胞恶性肿瘤中存在有体细胞突变），而这一过程同时扩大了Ig排列组合的数目［8,10］。

IgVH基因片段中FR序列相对保守，而CDR即使在同一VH家族中也高度不同，是生发中心期体细胞突变的高发区，尽管FR不易发生体细胞突变，但可发生核苷酸置换，尤其易发生在高度突变的B细胞。

现在在一些实验室开展的PCR技术检测IgVH基因是应用单个VH通用引物，与三个FR中的一个通常是FR3的序列互补，这种通用引物不能以相同效率扩增所有VH片段；而且由于体细胞突变并不是局限于CDR，也会发生在FR，如果FRs区域发生了基因突变，就会阻碍通用引物和FR的目的序列结合，导致克隆PCR产物检测失败。

由于IgH基因的多态性，CLLIgVH突变状态应用常规PCR方法检测所需引物众多，技术繁杂，标本需求量大，耗时久，费用高，在普通的实验室难以开展，且容易产生假阴性或假阳性结果。

因此虽然早在10多年前就提出IgVH体细胞突变与CLL预后有密切关系，但大部分实验室无常规开展此工作的条件。

本研究小组曾在1年前应用上述方法检测IgVH突变状态，在近30份标本中仅1份扩增出特异性片段，每份标本需进行36次PCR过程，由于其耗时低效而终止研究。

而本次研究采用多重PCR检测IgVH基因突变，简化了繁琐的实验过程，缩短了实验时间，而且由于InVivoScribe公司提供的试剂盒中提供阳性和阴性参照，减少了假阴性假阳性结果出现的几率，使实验结果更加可信。

多重PCR解决了传统PCR对IgVH基因突变检测的桎梏,值得在临床和在科研中推广。

现在国内外大量实验证实，IgVH基因突变与ZAP-70、CD38、细胞遗传学异常、sCD23、胸苷激酶、LPL等一系列CLL预后指标都有一定的相关性［6,11］。

我们将进一步进行IgVH基因突变与上述CLL指标的预后关系，以便共同评价预后，指导治疗。

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