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酶工程复习资料

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第1章

酶催化作用的特点：

专一性强，催化效率高，作用条件温和。

影响酶催化作用因素：

底物浓度，酶浓度，温度，PH，激活剂浓度，抑制剂浓度。

米氏方程：

V为反应速度，S为底物浓度。

1．当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=[S]

2．上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。

3．因此,米氏常数的单位为mol/L。

Km的意义：

1、不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。

2、Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。

3、Km值表示酶与底物之间的亲和程度：

Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。

按照分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可分为蛋白类酶和核酸类酶。

根据酶催化的反应类型，把蛋白类酶分为6大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。

核酸类酶（R酶）的分类

R酶的分类原则：

1）根据酶作用底物不同，分为分子内催化R酶和分子间催化R酶两类。

2）根据酶所催化的反应类型不同，分为自我剪切酶和自我剪接酶。

3）根据所作用的底物分子的不同，可以分为RNA剪切酶、DNA剪切酶、多糖剪接酶、多肽剪切酶、氨基酸酯剪切酶、多功能R酶。

酶活力：

指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。

酶活力测定的方法：

化学测定法、光学测定法、气体测定法

酶活力测定步骤：

酶活力测定包括两个阶段，先是酶与底物反应一段时间，然后测定反应液中底物和产物的变化量。

1）选择适宜底物，配制底物溶液

2）根据动力学性质，确定反应温度、PH、底物浓度等反应条件

3）酶与底物混合反应

4）取出反应液，测定产物生成量

终止酶反应的方法：

1）反应时间到，立即取出反应液，加热使酶失活。

2）加入酶变星剂，如三氯醋酸等

3）加酸或碱，改变最适PH值，使反应终止。

4）取出反应液置于低温冰箱，使温度迅速降低10度以下而终止反应。

酶活力单位：

在特定条件下，每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量。

IU（常用）1IU=1umol／min

酶的比活力：

指在特定条件下，单位质量蛋白质或RNA所含的酶活力单位数

酶比活力=酶活力U／mg蛋白=总活力U/总蛋白mg

比活力大小：

可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。

比活力愈大，表示酶的纯度愈高。

固定化酶的活力测定（比较）

固定化酶：

与水不溶性载体结合、在一定空间范围内起催化作用的酶。

其性质与游离酶不同，故活力测定方法不同：

1）震荡测定法

称取一定量固定化酶，在容器中加入一定量底物溶液，一边震荡一边反应，经过一定时间，取出反应液测定酶活。

2）酶柱测定法

将固定化酶装进恒温反应柱中，在一定条件下，让底物溶液以一定速度流过酶柱，收集反应液，测定反应液中底物消耗量或产物生成量，计算酶活。

3）连续测定法

利用分光光度法等测定方法对固定化酶进行连续测定,从而测定固定化酶的酶活力.这种方法对利用固定化酶进行连续生产和自动控制有重大意义.

4）固定化酶比活力测定

在固定化酶中一般采用每克干固定化酶所具有的酶活力单位数.测定方法一般先测定湿固定化酶比活力,然后再计算固定化酶比活力.

5）酶结合效率与酶活力回收率的测定

酶结合效率又称酶固定化率,指酶与载体结合的百分率.

6）相对酶活力

即具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值.

酶的生产方法：

提取分离法、生物合成法、化学合成法。

第2章

酶的发酵生产根据微生物培养方式不同分为：

固体培养发酵、液体深层发酵、固定化微生物细胞发酵、固定化微生物原生质体发酵。

1）固体培养发酵

我国传统各种酒曲、酱油曲等都是采用这种方式获得淀粉酶、蛋白酶等进行淀粉和蛋白质水解。

该方法操作简便，设备简单，但劳动强度大，生产周期长。

2）液体深层发酵

不仅适合微生物细胞发酵，也可用于动植物细胞发酵。

该方法机械强度高、酶产率高、质量稳定，是目前酶发酵生产的主要方式。

3）固定化微生物细胞发酵

细胞固定在载体上，进行发酵。

该方式细胞密度大，产酶能力强；稳定性好；利于连续化，自动化操作，产品利于分离。

4）固定化微生物原生质体发酵

该方法，去除了细胞壁屏障，利于胞内酶分泌到胞外，为胞内物质工业化开辟了途径；固定化原生质体有载体保护，稳定性较好，可连续生产。

用于酶的生产的微生物的特点：

酶的产量高；容易培养和管理；产酶稳定性好；利于酶的分离纯化；安全可靠，无毒性。

微生物发酵产酶的工艺流程：

p43

发酵工艺条件：

一、细胞活化与扩大培养

保藏的菌种在发酵之前，必须接种与新鲜固体培养基上，进行培养，恢复细胞活力，称为细胞活化。

扩大培养的目的是获得大量优质细胞。

一般培养到对数期或孢子成熟期才能用于发酵。

二、培养基的配制

不同时期细胞以及同种细胞用于不同物质时对培养基要求不同，因此要根据需要配制。

１）碳源：

是构成酶的主要元素及提供细胞能量。

目前，大多数产酶微生物采用淀粉或其水解物，如糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖等。

例如，黑曲霉具有淀粉酶系，可以淀粉为碳源；酵母不能利用淀粉，只能采用蔗糖或葡萄糖为碳源。

２）氮源

不同细胞对氮源要求不同，一般来说，动物细胞要求有机氮源；植物细胞主要无机氮源；微生物细胞，异养型细胞要求有机氮源，自养型细胞可以采用无机氮源。

３）无机盐

为酶提供无机元素和调节细胞渗透压等作用。

有些作为酶的激活剂如，钾、镁、锌、铁、锰。

三、pH值的调节

一般细菌和放线菌的生长最适PH值在中性或碱性范围（PH6.5-8.0），霉菌和酵母的最适生长PH值偏酸性（PH4-6），植物细胞生长的最适PH值为5-6。

在发酵产酶过程中，必须对培养基的PH值进行适当的控制和调节。

调节PH的方法可以通过改变培养基组分、缓冲液，或通过流加适宜的酸、碱溶液方法，来调节PH值。

四、温度的调节控制

五、溶解氧的调节控制

调节溶解氧的方法：

1）调节通气量：

增大通气量可提高溶氧速率。

2）调节氧分压：

提高氧分压，可增加氧溶解度，提高溶氧速率。

3）调节汽液接触时间：

延长汽液接触时间，可提高溶氧速率。

4）调节汽液接触面积：

增加汽液接触面积，可提高溶氧速率。

5）改变培养液的性质：

通过改变培养液组分或浓度，有效降低培养液黏度；添加消泡剂，可减少泡末，以提高溶氧速率。

六、提高酶产量的措施

在酶的发酵生产过程中，要使酶产量提高，首先要选育优良产酶细胞，保证正常发酵工艺条件。

诱导物一般可分为三类，酶的作用底物、酶的催化反应产物和作用底物类似物。

固定化细胞发酵产酶的特点：

1、提高产酶率

2、可以反复使用或连续使用较长时间。

3、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失。

4、发酵稳定性好。

5、缩短发酵周期，提高设备利用率。

6、产品容易分离纯化。

7、适用于胞外产物的生产。

第3章

动植物细胞培养：

通过特定技术获得优良的动、植物细胞，然后在人工控制条件的反应器中进行细胞培养，以获得所需产物的过程。

P65看一遍书

动植物细胞培养和微生物培养的比较

比较项目

微生物

哺乳动物细胞

植物细胞

大小

1－10μm

10－100μm

20－300μm

生长速率

快，倍增时间为0.3-6小时

慢，倍增时间为15－100小时

慢，倍增时间为24－74小时

营养要求

简单

非常复杂

较复杂

光照要求

无

无

大多数要求

悬浮生长

可以

多数细胞需贴壁生长

可以，但易成团，无单个细胞

对剪切力

不敏感

敏感

敏感

植物细胞、动物细胞、微生物细胞间的特性差异：

（1）体积方面：

植物细胞比微生物大103~105倍；

（2）生长速率、代谢速率方面：

植物细胞比微生物低，生长周期比较长；

（3）营养要求方面：

植物细胞比微生物要求简单；

（4）植物细胞的生长需要光照；

（5）植物细胞对剪切力敏感；

（6）目的产物不一样：

植物细胞的目的产物主要是色素、药物、香精、酶等；

植物细胞培养的特点：

1、提高产率

2、缩短周期

3、易于管理，减轻劳动强度

4、提高产品质量

5、缺点：

对剪切力敏感、生长周期长、需要光照

植物细胞培养的一般工艺过程：

外植体的选择和处理、植物细胞的获取、细胞悬浮培养、分离纯化、产物。

动物细胞的特性：

1、没有细胞壁，适应环境能力差，十分脆弱；

2、动物细胞体积比微生物大几千倍，比植物细胞稍小；

3、具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性等；

4、动物细胞营养要求较高；

动物细胞培养的特点：

1、动物细胞培养主要用于功能蛋白质的生产；

2、生长慢，细胞培增时间长；（15~100h）

3.易受微生物污染，培养时需要抗生素；

4.体积大，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；培养过程需氧量少，且不耐受强力通风与搅拌；

5.细胞相互粘连以集群形式存在；

6.培养基成分复杂，需要添加血清等成分，生产成本高；

7.原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。

动物细胞培养的方式：

贴壁培养、悬浮培养、固定化细胞培养

第4章

细胞破碎的方法主要包括机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶促破碎法。

分类

细胞破碎方法

细胞破碎原理

机械破碎法

捣碎法

研磨法

匀浆法

通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎

物理破碎法

温度差破碎法

压力差破碎法

超声波破碎法

通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎

化学破碎法

添加有机溶剂

添加表面活性剂

通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞破碎

酶促破碎法

自溶法

外加酶制剂法

通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，从而达到细胞破碎

酶的提取（酶的抽提）：

指在一定条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分地溶解到溶剂或溶液中的过程。

酶的主要提取方法

提取方法

使用的溶剂或溶液

提取对象

盐溶液提取

0.02-0.5mol/L的盐溶液

用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶

酸溶液提取

Ph2-6的水溶液

用于提取在稀酸溶液中溶解度大且稳定性较好的酶

碱溶液提取

PH8-12的水溶液

用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶

有机溶液提取

可与水混溶的有机溶剂

用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶

影响酶提取的主要因素：

温度、PH、提取液的体积。

沉淀分离：

是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。

沉淀分离

沉淀分离方法

分离原理

盐析沉淀法

不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀

等电点沉淀法

两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出

有机溶剂沉淀法

酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，

复合沉淀法

在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来

选择性变性沉淀法

选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶

过滤的分类及其特性

类别

截留颗粒大小

截留的主要物质

过滤介质

粗滤

>2μm

酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等

滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等

微滤

0.2～2μm

细菌、灰尘等

微滤膜、微孔陶瓷

超滤

20Å～0.2μm

病毒、生物大分子

超滤膜

反渗透

<20Å

生物小分子、盐、离子

反渗透膜

凝胶层析：

指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。

凝胶层析：

以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离。

（分离依据）

常用的凝胶：

葡聚糖凝胶、琼脂凝胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶

第5章

酶分子修饰：

通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程

为什么要进行酶分子修饰？

答：

酶分子优点：

催化效率高；专一性强；作用条件温和

缺点：

稳定性差；活性不高；有抗原性；

酶分子的修饰方法:

1、金属离子置换修饰；2、大分子结合修饰；3、侧链基团修饰

4、肽链有限水解修饰；5、核苷酸链有限水解修饰；6、氨基酸置换修饰；7、核苷酸置换修饰；8、酶分子的物理修饰

金属离子置换修饰的过程：

酶的分离纯化；除去原有的金属离子；加入置换离子

金属离子置换修饰的作用：

（1）阐明金属离子对酶催化作用的影响；

（2）提高酶的催化效率；（3）增强酶的稳定性；（4）改变酶的动力学特性。

大分子结合修饰：

采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法。

修饰剂：

聚乙二醇（PEG）；右旋糖酐；蔗糖聚合物；葡聚糖；环状糊精；肝素；羧甲基纤维素；聚氨基酸等。

大分子修饰的作用：

（1）通过修饰提高酶的活力；

（2）通过修饰增强酶的稳定性；（3）通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性

侧链基团修饰：

采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。

酶分子修饰的应用：

1、在酶学研究方面的应用（酶的活性中心研究、酶的空间结构研究、酶的作用机制研究）

2、在医药方面的应用（降低或者消除酶抗原性、增强医药用酶的稳定性）

3、在工业方面的应用（提高工业用酶的催化效率、增强工业用酶的稳定性、改变酶的动力学特性）

4、在抗体酶研究开发方面的应用

5、在核酸类酶人工改造方面的应用

6、在有机介质酶催化反应中的应用

第7章

酶的非水相催化：

酶在非水介质中的催化作用。

酶的非水相催化的主要内容：

一、有机介质中的酶催化

是指酶含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。

适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。

酶在有机介质中能够基本保持完整结构和活性中心的空间构象。

二、气相介质中的酶催化

是指酶在气相介质中进行的催化反应。

适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。

目前，研究不多。

三、超临界流体介质中的酶催化

是指酶在超临界流体中进行的催化反应。

超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。

用于酶催化反应的超临界流体要对酶结构无破坏作用。

四、离子液介质中的酶催化

是指酶在离子液中进行催化作用。

离子液是由有机阳离子与阴离子构成的在室温下呈液态的低熔点盐类，挥发性低，稳定性好。

有机介质反应体系：

1、微水介质体系

是有机溶剂和微量水组成的反应体系。

微量水主要是酶分子结合水，它对维持酶分子的空间构象和催化活性很重要。

由于酶分子不能溶于疏水有机溶剂，所以酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机介质中，在悬浮状态下进行催化。

通常所说的有机介质反映体系主要是指微水介质体系。

2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系

是指水与极性较大的有机溶剂互相混溶组成的反应体系。

体系中水和有机溶剂含量均较大。

由于极性较大有机溶剂对酶活性影响大，所以进行催化反应的酶较少。

3、与水不溶性有机溶剂组成的体系

体系是由水和疏水性较强的有机溶剂组成的多相体系。

催化反应一般在两相界面进行。

4、胶束体系（正胶团）

胶束（正胶束）：

是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成水包油的微小液滴。

表面活性剂极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。

反应在胶束两相界面进行。

5、反胶束体系（反胶团）

在大量与水不相溶的有机溶剂中，含少量水溶液，加入表面活性剂后形成油包水的小液滴。

表面活性剂极性端朝内，水溶液包在胶束内部。

反应时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物在反胶束外部，催化反应在胶束两相界面进行。

与生物膜相似，适用于生物膜表面或与膜结合的酶结构、催化特性和动力学性质相似。

水对有机介质中酶催化的影响：

1、水对酶分子空间构象的影响

在无水条件下，酶的空间构象将发生破坏，酶将失活。

故酶分子需要一层水化层，以维持空间构象。

必需水：

紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水。

2、水对酶催化反应速度的影响

有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。

如，马肝醇脱氢酶在水含量较低的情况下，酶的催化反应速度随水含量增加而升高。

3、水活度

水活度：

指体系中水的逸度与纯水逸度之比。

通常可以用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。

在有机介质中含有的水主要有两类：

一类是与酶分子紧密结合的结合水；另一类是溶解在有机溶剂中的游离水。

实验证明，在有机体系中，酶催化活性随结合水量增加而提高。

有机溶剂对有机介质中酶催化的影响（怎样影响？

）

1、有机溶剂对酶结构与功能的影响；

在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。

有些酶在有机溶剂作用下，空间结构会受到破坏，从而使酶的催化活性失活。

例如，碱性磷酸酶冻干粉悬浮于乙腈中20h。

60%以上酶不可逆失活；悬浮在丙酮中36h，75%以上酶不可逆失活。

2、有机溶剂对酶活性影响；

极性强的有机溶剂会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性，甚至引起酶的变性失活。

研究表明，有机溶剂极性越强，越容易夺取酶分子结合水，对酶活力的影响越大。

例如，正己烷能够夺取酶分子0.5%的结合水，甲醇可以夺取酶分子结合水的60%。

3、有机溶剂对底物和产物分配的影响。

有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。

酶在有机介质中进行催化反应，酶的作用底物首先必须进入必需水层，然后才能进入酶活性中心进行催化反应，反应后生成的产物也首先分布在必需水层中，然后才从必需水层转移到有机溶剂中。

产物必须移出必须水层，酶催化反应才能继续进行下去。

酶在有机介质中的催化特性：

底物专一性；对映体选择性；区域选择性；键选择性；热稳定性；PH特性。

第9章（重点）

酶反应器：

用于酶催化反应的容器及其附属设备。

酶反应器依据其结构可分为搅拌罐式反应器、鼓泡式反应器、填充床式反应器、流化床式反应器、膜反应器、喷射式反应器等。

反应器类型

适用的操作方式

适用的酶

特点

搅拌罐式反应器

分批式,

流加分批式

连续式,

游离酶

固定化酶

反应比较完全，反应条件容易调节控制。

填充床式反应器

连续式

固定化酶

密度大，可以提高酶催化反应的速度。

在工业生产中普遍使用。

流化床反应器

分批式

流加分批式

连续式

固定化酶

流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH值的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。

鼓泡式反应器

分批式

流加分批式

连续式

游离酶

固定化酶

鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高,适合于有气体参与的反应。

膜反应器

连续式

游离酶

固定化酶

清洗比较困难，适合于贵重酶的反应

喷射式反应器

连续式

游离酶

通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，适用于某些耐高温酶的反应

酶反应器多种多样，在选择酶反应器的时候，主要从酶的应用形式、酶的反应动力学性质，底物和产物的理化性质等方面考虑。

同时选择结构简单、操作简便、易于维护、成本较低的特点。

游离酶催化反应最常用的反应器是搅拌罐式反应器。

酶反应器的设计：

1、确定酶反应器的类型；2、确定反应器的制造材料；3、进行热量衡算；4、进行物料衡算。

酶反应器操作的注意事项：

1、保持酶反应器的操作稳定性；2、防止酶的变性失活；3、防止微生物的污染

第10章（大题）

一、酶在医药方面的应用

1、用酶进行疾病的诊断

酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。

例如：

利用胆碱酯酶或胆固醇氧化酶测定血液中胆固醇的含量，从而诊断心血管疾病和高血压等。

酶标免疫测定：

先把酶与某种抗体或抗原结合，制成酶标记的抗体或抗原．然后利用酶标抗体（或酶标抗原）与待测定的抗原（或抗体）结合，再借助于酶的催化特性进行定量测定，测出酶—抗体—抗原结合物中的酶的含量，就可计算出欲测定的抗体或抗原的含量。

通过抗体或抗原的量就可诊断某种疾病。

2、用酶进行疾病的预防和治疗

例如：

蛋白酶可作为消化剂，用于治疗消化不良和食欲不振。

使用时往往与淀粉酶，脂肪酶等制成复合制剂，以增加疗效。

作为消化剂使用时，蛋白酶一般制成片剂，以口服方式给药。

溶菌酶作用于细菌的细胞壁，可使病原菌，腐败性细菌等溶解死灭，对抗生素有耐药性的细菌同样起溶菌作用，具有显著疗效而对人体的副作用很小，是一种较为理想的药用酶，溶菌酶与抗生素联合使用，可显著提高抗生素的疗效。

3、用酶制造各种药物

例如：

用青霉素酰化酶合成各种新型的β—内酰胺抗生素，包括青霉素和头孢霉素；

二、酶在食品方面的应用

三、酶在轻工、化工方面的应用

四、酶在环境保护方面的应用

五、酶在生物技术方面的应用