WESTERNBLOT试验方法和步骤.docx

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WESTERNBLOT试验方法和步骤

.WESTERNBLOT试验方法和步骤

试剂配方

裂解液A

试剂浓度1000mlDDW含量Tris-Cl（pH7.5）50mM6.057g

EDTA2mM0.744g

NaCl150mM8.766g

裂解液B

试剂浓度1000mlDDW含量Tris-Cl（pH7.5）50mM6.057g

glycerol（甘油）10%v/v100ml

magnesiumacetate（醋酸镁）5mM1.07g

EDTA0.2mM0.0744g

抑制剂（临用前加）

抑制剂原液浓度A或B中的终浓度A和B中加入体积（ul/ml）

Leupeptin1mg/ml10μg/ml10μl

Pepstatin1mg/ml10μg/ml10μl

Aprotinin1mg/ml1μg/ml1μl

DTT0.1M（15.4mg/ml）0.5mM5μl

NaF10M（0.42g/ml）100mM10μl

钒酸钠0.2M（0.08g/ml）2.0mM10μl

PMSF（巨毒）0.1M（17.4mg/ml异丙醇）1.0mM10μl

NaN35%0.02%4μl

应添加苯甲脒1mM暂未加

分离胶缓冲液：

1.5MTris-HCl（pH8.8）

Tris18.17g

DDW80ml

用HCl调pH至8.8后加水定容100ml

浓缩胶缓冲液：

0.5MTris-HCl（pH6.8）

Tris3.03g

DDW30ml

用HCl调pH至6.8后加水定容50ml

5×电泳缓冲液（分子克隆影印版A1.17）

Tris7.57g

甘氨酸46.92g

SDS2.5g

DDW500ml

5×转膜缓冲液（分子克隆影印版A8.52）

Tris14.52g

甘氨酸7.32g

SDS0.94g（可不加）

DDW400ml

临用前取80ml，加DDW320ml,甲醇100ml，混匀即可。

2×Loadingbuffer（SDS-PAGE加样缓冲液）:

（分子克隆影印版A1.20）

0.5MTris-HCl（pH6.8）2ml

10%SDS4ml

甘油2ml

二巯基乙醇156μl

1%溴酚蓝2ml

-20℃避光保存

考马斯亮蓝染液

考马斯亮蓝R-2501.25g

甲醇250ml

冰乙酸50ml

蒸馏水200ml

脱色液Ⅰ

甲醇200ml

冰乙酸50ml

蒸馏水200ml

脱色液Ⅱ

甲醇50ml

冰乙酸75ml

蒸馏水875ml

丽春红染液：

丽春红1g

乙酸2ml

DDW200ml

0.2MTBSpH7.4

Tris-base4.85g

DDW150ml

1NHCl约4ml调pH值至7.4后定容于200ml临用前稀释十倍

一、匀浆

1、配裂解液A和B.

2、取适量A、B液,加入酶抑制剂.

3、取所需组织块于溶液A中,浸泡五分钟,用剪刀剪成碎块.

4、将组织块转移入二倍体积的溶液B中,电动匀浆9,000转3分钟,浸泡30-60分钟.

5、超声震荡三分钟,

6、低温离心9,000r/分,15分钟.

7、取上清液-20℃保存,待用。

注：

以上所有操作均需在冰上进行。

二、电泳

1、制胶：

（1）分离胶：

组装灌胶模具及电泳槽配分离胶，加入各溶液后振摇，使其充分混匀。

小心用吸管将凝胶加入灌胶模具内，至距梳齿下缘约1－1.5cm，并避免产生气泡，然后在分离胶上面加入一层约5mm厚的水层以隔绝与空气的接触，直立置于室温下20-60min，直至凝胶聚合。

在凝胶聚合后，会在分离胶和水层之间出现一个清晰的折光线。

分离胶终浓度：

10%总体积：

6ml

30%acr/bis2ml

分离胶缓冲液（pH8.8）1.6ml

10%SDS60μl

DDW2.32ml

10%过硫酸铵20μl（冬天40μl）

TEMED4μl

（2）浓缩胶：

吸尽分离胶上的水，将梳子置于分离胶上，配浓缩胶。

同样加入各溶液后振摇，使其充分混匀。

小心用吸管将凝胶将浓缩胶缓慢加入分离胶表面，注意不能产生气泡；室温下静置1小时以上，使凝胶充分聚合。

浓缩胶总体积：

1.875ml

30%acr/bis250μl

浓缩胶缓冲液（pH6.8）475μl

10%SDS18.75μl

DDW1.138ml

10%过硫酸铵8μl（冬天16μl）

TEMED2μl

（3）小心拔除梳子，不要将加样孔撕裂。

（4）也可选择梯度胶，即：

分离胶由下到上分为12%和10%二层。

终浓度：

12%总体积：

2ml

30%acr/bis1.2ml

分离胶缓冲液（pH8.8）0.8ml

10%SDS30μl

DDW960μl

10%过硫酸铵15μl（冬天30μl）

TEMED1.6μl

2、上样：

取上述匀浆样品,加入同体积的2×Loadingbuffer,上样于加样孔中。

恒压：

浓缩胶80V，分离胶100V，电泳至溴酚蓝到分离胶底部。

3、染色：

取其中所需条带,考马斯亮兰染色过夜.脱色夜Ⅰ、Ⅱ各脱色1-2个小时,观察电泳条带.

注：

过硫酸铵量应随着温度下降而增加。

凝胶从玻板上分离后，就立刻固定于转膜缓冲液中。

Gelneedtobefixintransferbuffersoonjustafteritiscutfromglas

三、转膜withoutSDS

1、取需转膜的胶带,按胶的大小，裁所需的六层滤纸和NC膜。

将滤纸和膜垂直放于转膜缓冲液中，以虹吸作用使其湿润（以减少气泡）后，从负极到正极依次按照海绵→三层滤纸→胶→硝酸纤维素膜（NC膜）→三层滤纸→海绵的顺序放置,300V，276mA转35－50分钟（一般转45min，温度降低转膜时间延长，主要看marker是否转上。

）

注:

除尽各层间的气泡。

2、观察Marker的颜色，若所需蛋白质条带附近的Marker已转到膜上，则停止转膜，否则延长时间。

一般大分子量蛋白质所需时间较长，小分子量（80KD）以下，可缩短转膜时间。

3、丽春红染色十分钟后蒸馏水洗膜，观察蛋白质条带。

注：

转膜和电泳缓冲液最多只能用三次。

四、印迹

1、封闭：

（1）将结合有蛋白质的NC膜放入牛奶中，封30min。

封闭液:

Milk（5%）1.5g

0.02MTBS30ml

Tween20（0.5%）150μl

（2）4%BSA封闭五分钟。

注：

预试验背景较强时可适当延长封闭时间。

3、加一抗

将NC膜放入塑料袋中，加入用抗体稀释液稀释好的一抗，热封口器封口，4℃过夜或者37℃孵育2小时。

4、洗膜10分钟×3次

洗液:

0.02MTBS100ml

Tween20500μl

5、二抗

将NC膜放入塑料袋中，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（洗液稀释，抗体稀释度预先确定），用热封口器封口，37℃孵育1小时。

此步也可分了二步，即：

先加入无酶标的二抗，37℃孵育1小时，洗膜后，再加入酶标的二抗和SABC。

注：

稀释液中不能NaN3

6、DAB显色含洗膜10分钟×3次，后加入DAB显色。

DAB：

1mlDDW中加入TBS、H2O2、DAB各50μl。

注：

一抗推荐稀释度：

1：

500→1：

2000；二抗：

1：

2500

7、ECL显色

二溶液等体积混匀（各500μl），滴于NC膜上，并不停吹洗，3-5分钟后吸干膜边缘的水分，将NC膜包于塑料薄膜中，放入暗盒盖上胶片，分别曝光1秒、3秒、5秒、1分钟、5分钟、8分钟后，洗片。

曝光时间可根据前面所冲胶片的背景决定，背景强则减少曝光时间，否则延长曝光时间。

0.125ml/pcm3,Roomtemperature,notextensivelight,for5minutes,

absorbtheWorkingsolution.FaceuptoX-rayfilm.

附：

常规蛋白质的近似分子量

δ-catenin:

133kD

KA2:

123kD

spinohilin:

120kD

KA1:

114kD

GluR2:

110kD

GluR1:

106kD

stat3:

90kD

synapsinⅠ:

80kD

NF-κB:

65kD

β-actin:

42kD

c-jun:

39KD

Caspase:

32kD

Bcl2:

26kD

Bax:

23kD

　　　　　　　　　GAS748kD

　　　　　　　　　　Tubulin55kD

　　　　　　　　　　　　　　　AKT260kD

PKA（全酶）150-170kD

PKA（催化亚基）50kD（sc-904）

CREB（rat）36kD（博士德）