克隆载体与表达载体.docx

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克隆载体与表达载体

克隆载体

基本性质

基本特征（或载体的构建）

原理机制

常用的载体

克隆载体

质粒载体

质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；不相容性；可转移性（基因工程中采用非接合性质粒）

（1）具有合适的复制起始位点（ORI）

（2）具有合适的选择性标记基因（3）若干限制性切酶的单一位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。

当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。

不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。

（抗菌素选择原理）

pSC101

ColE1

pBR322

pUC18

pUC19

TA载体

噬菌体载体

λ噬菌体

其DNA两端的5′末端各带有12个碱基的互补单链，即cos位点。

有可替代区，即非必需区。

用外源DNA片段替代这个区域，不会影响噬菌体颗粒的形成。

（1）基因组大小；去除非必需区，建立外源DNA片段的克隆或替换位点

（2）在DNA的非必需区插入选择标记：

lacZ基因；基因cⅠ失活（cI基因：

溶源过程控制基因）；Spi筛选（野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感）

1）通过裂解过程增殖载体2）载体与外源DNA的酶切3）外源DNA与载体的连接4）重组噬菌体的体外包装5）包装噬菌体颗粒的感染6）筛选（λ噬菌体载体的克隆原理）

插入式载体

置换型载体（取代型载体）

M

13噬菌体载体

M13噬菌体的基因组为单链DNA。

噬菌体颗粒的大小受其DNA端点制约的，不存在包装限制。

只感染雄性大肠杆菌

基因间隔区（intergenicregion,IG区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。

②IG区只有一个BsuI切点。

（2）加入酶切位点，在IG区加入单一切酶位点。

M13mp1在IG区插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列）。

使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。

而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb

1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。

2、RFDNA在宿主细胞能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。

3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。

（M13噬菌体产生单双链DNA的机制）

M13mpnn代表系列数字②对M13mp1的改进加上常用的酶切位点。

M13mp2：

LacZ’5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoRI切点

噬菌体-质粒杂合载体

黏粒载体

考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。

能像-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：

45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力

粘粒（cosmid）是带有cos序列的质粒。

cos序列是噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。

黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr），cos位点，因而能象质粒一样转化和增殖。

克隆的最大DNA片段可达45kb。

有的粘粒载体含有两个cos位点，在某种程度上可提高使用效率。

设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。

其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。

凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。

因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。

重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。

噬菌粒载体

能像质粒那样在受体细胞中自主复制能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA

重组操作简便，筛选容易

噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬菌体载体优点，含有ColEl复制起始位点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌体DNA间隔区（含有噬菌体DNA复制起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用元件）

它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体

1.具有较小分子量基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个ampr基因作为选择记号，便于转化子的选择；3.拷贝数含量高4.存在着一个多克隆位点区，因此多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照IPTG显色反应试验筛选6.lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7含有质粒的复制起点，可复制形成大量的双链DNA分子8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；9.；在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA

pUC118和pUC119

人工染色体

染色体具有复制功能，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体

其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展，甚至可以跟染色体的大小相媲美。

人工染色体载体拷贝数少，制备困难，通常采取“穿梭载体”的策略来解决

含有质粒载体所必备的第一受体（大肠杆菌）质粒复制起始位点，这样的载体在大肠杆菌可以按质粒复制形式进行高拷贝复制，含有第二受体（如酵母）端粒（TEL）、DNA复制起始位点（ARS）和着丝粒（CEN）以及合适的选择标记。

载体在体外与目的DNA重组后转化到第二受体细胞，按照染色体复制的形式进行复制和传递。

筛选第一受体的克隆子一般采用抗生素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子常用与受体互补的营养缺陷型。

酵母人工染色体载体YAC

细菌人工染色体载体BAC

P1噬菌体人工染色体载体PAC

质粒载体总结

质粒载体

类型

长度

选择标记

克隆位点

pSC101

天然质粒，属严紧型、低拷贝型

9.09kb

四环素抗性Tetr

7个克隆位点：

EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI、SamI

主要使用EcoRI

ColE1

天然质粒，属松弛型多拷贝型

6.3kb

大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）

EcoRI位于E1部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）

pBR322

元件来源①复制起点orip

MB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②Ampr基因pSP2124质粒的Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。

4363bp

氨苄青霉素和四环素抗性

24个克隆位点。

其中9个会导致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；

3个会导致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。

pUC系列

（i）来自pBR322质粒的复制起点（ori）；（ii）氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它不再含有原来的核酸切限制酶的单识别位点；（iii）大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ′基因；（iv）位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能

2.7kb

Ampicillin抗性和lacZ的α肽互补（蓝白斑）相结合。

10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。

TA载体

耐热聚合酶可在PCR产物的3’端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷（A）。

根据这一特点研制出线性TA质粒载体，其5’端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶（T），用该载体可进行PCR产物的直接克隆。

TA载体构建：

在一般质粒载体的基础上构建。

方法1：

先采用限制性切核酸酶酶切使质粒载体线性化，再通过K1enow片段将酶切的线性载体末端补平

方法2：

利用产生平末端的限制性切核酸酶酶切产生平末端，最后将线性化钝末端质粒载体加T反应形成。

目前有很多公司推出了TA质粒载体。

λ噬菌体载体

λ噬菌体

载体

分类

插入式载体

一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体

λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。

cI基因插入失活：

如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。

外源基因插入后将导致cI基因的失活。

cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。

相反，产生混浊的噬菌斑。

LacZ基因插入失活：

如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）

置换型载体（取代型载体）

具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源DNA片段所取代。

野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段

这些载体是用Lac5替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择标记

使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。

而后，感染E.coli使之在E.coli繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。

置换型λ噬菌体是使用最广泛的载体。

人工染色体

类别

元件

优点

酵母人工染色体载体

YAC

是最常用来克隆很大DNA片段（2Mb）的系统。

为构建YAC需要结合四个短序列：

即二个端粒、一个着丝粒和一个ARS元件，并将一适当大小的外源DNA连接成一线性DNA分子，而端粒序列位于正确的末端。

YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中繁殖的，酵母细胞却具有这样的能力

细菌人工染色体载体

BAC

是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体

每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制子oriS（Shizuyaetal.1992），一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB,和parC）

①以大肠杆菌为寄主，转化率高，构建BAC文库比YAC文库更容易；②BAC载体以环型超螺旋状态存在，从大肠杆菌中提取质粒较方便，而从酵母中分离DNA较困难；

③BAC的复制子来源于F因子，可稳定遗传，嵌合及重组现象少；④可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方便快捷；⑤BAC载体在克隆位点的两侧具有T7和Sp6聚合酶启动子，可以用于转录获得RNA探针或直接用于插入片段的末端测序。

表达载体

分类

结构组成及表达元件

特点或优点

备注

质粒表达载体

原核表达载体

1启动子、

2转录终止子（防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性）

3核糖体结合位点

表达方式有：

组成型表达，

诱导型表达。

融合型表达，

分泌型表达。

启动子类型：

根据作用方式及功能分类①组成型启动子

②组织特异启动子又称器官特异性启动子。

③诱导型启动子

酵母表达载体

来自pBR322基本骨架含有该质粒复制起始位点（ori），lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因。

含有URA3、HIS3、LEU2、TRPl、LYS2与特定的宿主营养缺陷突变体互补筛选或利用zeocin、basticidin（杀稻瘟菌素）的抗性基因筛选。

启动子有GAP、AOXl、AUGl和GAL1等。

GAP是组成型启动子。

其余是诱导型启动子。

酵母表达载体多为穿梭载体：

既可以在大肠杆菌中繁殖，获得足够的载体DNA进行体外操作，又可以在酵母中复制、表达和选择。

融合蛋白表达载体：

于外源基因插入位点的C端或N端插入了1个6×His标签，或在5’端插入了α-因子作为分泌信号

由于原核生物和真核生物存在糖基化、酰基化等翻译后修饰反应机制的差异，真核基因的原核表达难以获得有活性的蛋白。

酵母成为真核表达的首选系统。

Ti质粒表达载体

一元载体

一元载体就是含目的基因的中间表达载体与改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体，也称为共整合载体。

由于该载体的T-DNA区与Vir区紧密连锁，也称为顺式载体（cis-vector）

Ti质粒是根癌农杆菌中发现的可引发植物产生冠瘿瘤的质粒。

根据冠瘿瘤合成的冠瘿碱种类，Ti质粒可分为章鱼碱、农杆碱、农杆菌素和琥珀碱4种不同类型Ti质粒可分为T-DNA、Vir、Con和Ori4个功能区。

T-DNA区是Ti质粒中能转移到植物细胞的区域。

Vir区位于T-DNA区的上游，其表达产物可激活T-DNA向植物细胞的转移，这一个区域也称为致病区。

Con区该区含有与农杆菌之间接合转移有关的基因（tra），这些基因受宿主细胞合成的冠瘿碱激活，使Ti质粒在细菌之间转移。

Ori区调控Ti质粒的自我复制，为复制起始区

构建的基本原理：

引入分子质量较小的中间载体，将欲转化的目的基因及抗性标记基因构建到中间载体上。

将Ti质粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉，仅保留其两边界及与T-DNA转移所必需的25个碱基序列，构建成所谓卸甲载体。

在卸甲载体的T-DNA区被删除致瘤基因位点插入中间载体同源的质粒序列，将中间载体转入含有卸甲载体的根癌农杆菌中，构建在中间载体上目的基因可通过同源重组整合到卸甲载体Ti质粒的T-DNA区，并与卸甲载体Ti质粒一起复制。

二元载体

双元表达载体系统主要包括两个部分：

　一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

另一部份是微型Ti质粒，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及LacZ基因等。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA的转移。

与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌独立复制

双元表达载体构件方便，转化效率高于一元载体。

病毒表达载体

杆状病毒表达载体

杆状病毒表达系统的基本元件：

（1）启动子：

多个启动子同时表达多个外源基因。

（2）polyA加尾信号：

（3）同源重组序列。

（4）穿梭载体必需元件。

除带有病毒自身的复制起始位点外，还带有pUC质粒的复制子及以ampr，可以在细菌进行扩增。

（5）筛选标记。

①重组蛋白具有完整的生物学功能：

接近天然蛋白。

②能进行翻译后的加工修饰：

研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。

③表达水平高：

最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50％。

④能容纳大分子的插入片段：

上限未知。

⑤能同时表达多个基因：

在同一细胞同时表达多个基因。

⑥能表达基因组DNA：

昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能。

⑦对重组蛋白进行定位的功能：

如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等。

杆状病毒科病毒，杆状病毒颗粒，双链闭合环状DNA病毒，专一性感染无脊椎动物

将外源基因先克隆到转移载体上，再与病毒基因组共同转染细胞，通过细胞的同源重组获得带有外源基因的重组病毒的策略。

腺病毒载体

腺病毒DNA末端结构突出特点1）带有100bp反向的末端重复序列（ITR），而且在每一条单链的5’-末端还共价地连接着末端结合蛋白，对病毒的复制有重要作用。

2）当它从病毒颗粒中分离出来之时，便会自发地环化起来，尔后许多环形分子又聚合成多聚体

腺病毒载体是目前最为广泛应用的基因载体，也是唯一基因药物的载体双链DNA的分子大小约为36kb.

可应用于1.基因治疗2.表达真核基因3.研制疫苗

首先构建一个含多克隆位点和筛选标志的转移质粒，该质粒含有病毒基因组某段早期序列；然后将一个含有启动子一外源基因-polyA的表达盒插入到上述质粒中腺病毒E1、E3或E4至右侧的ITR区之间，构建成载有外源基因的穿梭质粒。

反转录病毒载体

泡沫病毒类

从5’端开始依次是：

①5’长末端重复序列（5’-LTR），带有增强子和启动子序列；②psi序列，又称ψ序列，是病毒包装所必须的信号序列；③gag，编码病毒衣壳蛋白；④pol，编码反转录酶和整合酶（Int）；⑤env，编码病毒颗粒外层包装蛋白；⑥3’长末端重复序列（3’-LTR），带有polyA加尾信号序列。

一类含单链RNA的动物病毒。

它的基因组含有2条相同的正链RNA分子，包装成二倍体病毒颗粒。

（1）在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因（onc）都能够在正常的细胞中转录。

2）反转录病毒的寄主围相当广，包括无脊椎动物和脊椎动物。

3）反转录病毒具有强启动子，外源基因可得到有效表达。

4）反转录病毒不但感染效率高，而且不招致寄主细胞的死亡

载体的构建:

分离原病毒DNA→删去部分序列→组入选择性标记基因、目的基因和调控元件→克隆到含有大肠杆菌复制起始位点的克隆载体→转化大肠杆菌→获得反转录病毒克隆载体→辅助细胞系（包装细胞系）→扩增

慢病毒类

致癌病毒类

SV40病毒型转化载体

根据SV40DNA进入敏感动物细胞的转方向，分为早期转录区和晚期转录区。

早期转录区包括与病毒感染相关的t抗原基因（smallT-antigen）和T抗原基因（largeT-antigen）等；含有BamHI等限制性切核酸酶识别位点；晚期转录区包括与病毒壳蛋白合成相关的基因，含有EcoRi等限制性切核

酸酶识别位点。

①含有能够被真核细胞识别的有效的启动子。

②有许多种动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。

③有些动物病毒具有控制自己复制的顺式元件和反式作用因子。

④有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。

⑤病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接受器。

用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒，即构成了一种高效的转化体系

猿猴空泡病毒40（Simianvacuolatingvirus40,SV40）基因组是一种环形双链的DNA，其大小仅有5243bp，很适于基因操作。

导致人体癌变的可能性极低，对人体是安全的。

一些质粒型表达载体带有来自SV40DNA的个别调控区，位于病毒的早期与晚期转录单位之间，包括1、DNA复制起始位点2、早期与晚期mRNA转录的起始位点3、能激活复制起始位点并可自动调节早期转录的T抗原结合位点4、可被细胞转录因子识别的一般由3个G/C丰富的21bp同向复制区组成的序列5、组成SV40早期增强子的2段72bp同向重复序列。

大片段表达载体

TAC-可转移人工载体

结合了PAC和双元载体的优点：

1、具有多克隆位点，2、具有P1复制子和RI质粒复制子能在大肠杆菌和农杆菌中以单拷贝的形式穿梭复制。

3、其T-DNA 右边界处插入了植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt ）和Pnos 启动子。

4、在TAC 载体中重组筛选标记是卡那霉素抗性基因和sacB 基因

应用TAC载体在获得目的克隆后可不必进行烦琐的亚克隆，而可直接进行植物转化并开展功能互补分析，可大大促进功能基因的精细定位和图位克隆。

TAC 载体具有克隆大片段DNA 和借助于农杆菌直接转化植物的功能。

TAC还具有以下优越性：

①可通过农杆菌介导直接进行基因功能互补实验。

TAC 载体中具有P1 裂解子，可以在IPTG 的诱导下产生5-20个拷贝，提高了质粒产量。

MAC-哺乳动物人工染色体

1外源DNA片段的容量大；②不整合到宿主染色体上，不会破坏宿主基因组的结合和功能，可以稳定地存在；③较少发生基因沉默现象

MAC构建的理论基础在于将哺乳动物染色体复制起始位点序列、端粒和着丝点分离出来，然后和一些载体元件组合构成人工染色体，可以将外源基因及其调控序列引入哺乳动物。

它与宿主细胞的染色体一样稳定，但并不整合人宿主基因组。