最新提RNA逆转录qRTPCR步骤汇总.docx
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最新提RNA逆转录qRTPCR步骤汇总
提RNA-逆转录-qRT-PCR步骤汇总
【一、提ＲNA】
一、实验准备：
1、试剂：
75%乙醇、Triｚｏl、１.5ｍL 进口EＰ管、氯仿、异丙醇、进口枪头（RNＡ专用）、
2、配75%乙醇（DＥPC水+无水乙醇）,放-２0℃冰箱预冷；
3、预冷离心机（1.5ｍL EP管用的）;
4、清洁桌面,酒精喷过之后擦干,新手套、两层口罩；
二、操作步骤：
0１、弃上清（不回收,直接倒去）;
０2、１mＬ／孔PBS洗两遍（不回收，直接倒去,随后用200μL枪吸尽PBS）;
０3、每孔加5０0μLＴrｉｚol,轻晃，随后室温放置2min左右;
０4、枪头吹打，吸出放入１．５mＬ进口EP管；
0５、加入100μＬ氯仿（即1／５体积的ｔｒizol）；
06、4℃离心机,12000g,1５miｎ;
07、吸200μL（可减少）上清放入新的1。
5mＬ进口ＥP管中（注意:
只能吸到上清）；
08、加入等体积异丙醇,充分混匀,常温放置10—3０ｍin（1５min）；
09、4℃离心机，120０0ｇ,1０ｍｉn;
10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀；
1１、4℃离心机,7500g,5min;
12、倒掉上清,加入1mL预冷的7５%乙醇,混匀;
１3、４℃离心机,７500g，5ｍin;
１4、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10ｍin，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠;
1５、每管中加入40μＬ（４0μ—6０μＬ）的DEPC水,吹打溶解；
１6、测浓度（先知楼２1楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）；
三、注意事项
01、如果当时不测ＲＮA浓度,可暂时把RNA放在-20℃冰箱.但长时间（>２4h）保存，需要放在-80℃冰箱;
02、异丙醇作用是沉淀ＲNＡ，作用比乙醇好；
03、
0４、
05、
0６、
07、
08、
09、
【二、测RNＡ浓度】
一、实验准备：
01、先知楼21楼-２10９教室，一个冰盒+ＤEPC水+10微升枪、灭菌ddH2O、10μL枪头（RNA专用）、本子+笔；
二、操作步骤:
01、登记;
02、打开电脑＝=〉打开“Ｎ”软件==＞点击“Nｕcleiｃaciｄ"==〉选择“OＫ”==〉选择“RNA＂；
03、灭菌ddH2O清洗2－3遍,擦干;
0４、DＥＰＣ水 校零:
即加DEPC水一滴，点击“Blank”，擦干；
05、测RNA:
加样品一滴,点击“measuｒe”，擦干,随后加下一个样品；
０６、记录数据,包括RNＡ浓度（〈10０0ｎg/μL）、２60/２8０;
07、灭菌dｄH2O清洗２-3遍，擦干；
０8、-80℃冰箱保存;
三、注意事项
23０nm代表有机物水平（碳水化合物），260nｍ代表RNA 水平，2８0nｍ代表蛋白水平,2６0／23０表示有机物量，260／280代表RNＡ提取量;ﻫ1。
A２6０nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0。
1—1.０。
如果不在此范围，稀释或浓缩样品,使之在此范围内;如果吸光度小于0.０5,检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。
DＮA 样品的A260吸光度值是否>0.1.（请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于 ０．１,其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值＜0。
1）;
２。
A280nm、A2７０ｎm是蛋白最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：
纯DNＡ的A260/Ａ28０比值为1．8,纯RNA为2。
0。
如果比值低,表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。
比值=1。
５相当于50%蛋白质/DNＡ溶液。
酚的最大吸收峰在270nｍ.
3。
Ａ230ｎｍ是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:
纯DＮA和RＮＡ的Ａ260／A２30比值为2。
5。
若比值小于2。
0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。
Ａ230产生负值主要是由于在很低 ＤNＡ浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。
在下一个测定中,需要降低样品的稀释度，A23０的负值会被校正。
ﻫ4.Ａ３２0nm或Ａ340nｍ为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。
该值应该接近0.0。
如果不是,标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
纯样品的Ａ3２0一般是0。
ﻫ5. Ａ２60／A2８0和A２６0／Ａ23０是核酸纯度的指示值.纯度好的ＤNA或ＲNA,在pH７—8。
5下Ａ260/A２8０的比值应该在2．0或2。
5。
纯净的样品比值大于1。
8（DＮA）或者2。
0（RＮＡ）。
如果比值低于1.8或者2。
0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物、盐（胍盐）等,较纯净的核酸A２６0/A230的比值大于2.0.当0。
5%BSA蛋白质污染时，蛋白污染会导致26０和280的数值都下降,其净结果是26０/28０比值下降,但260/2８0的比值变化并不显著,正如分子克隆3所说。
但蛋白残留会导致２3０的数值显著上升，显著影响2６0/２30的比值。
也就是说,如果ＲＮＡ样品的260／２80=1。
7,2６0/230＝0。
5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留.用分光光度计测量RＮA时，用水而不是用TＥ缓冲液稀释RＮA样品会造成A26０/A２８0比值下降。
原因是低离子强度和低pH溶液会增加2８0nm处的光吸收值。
加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污染,所以现在一般取400ｕl左右。
ﻫ6.当２60／230〈1时,只有两种情况.一是胍盐污染,二是蛋白污染。
【三、逆转录】
一、实验准备:
01、进口10μＬ枪头（qRT—PCR专用）、冰盒一个、２00μL进口ＥP管;
02、冰上融化1、2、4、2号试剂（提前半小时）;
03、
二、操作步骤：
试剂盒:
１. 2μＬ
2. 0。
5μL（最后加入）
3. 0。
5μL
4。
0.5μL
RNA １０00ｎg
DEPＣ水
-－—－—--——————---10μＬ体系
01、200μL进口管子:
EP管加相应DEPC水==〉加１号试剂（2μL）==>加3号试剂（0.５μL）＝=>加4号试剂（0。
５μＬ）==>加２号试剂（０。
５μL）==〉加ＲNA＝＝〉离心＝=〉上机；
02、上机:
ＯPEN==〉点击“Uｓｅr”菜单下的“ｃlx",点击“Ａccept”==〉选择“rｕｎ”下面的到“exｐ０01 rt”==〉修改体系“10μL”（默认为25微升）==〉点击“Staｒt",进入界面;
03、37.0℃ 1５min==〉85.0℃5s＝=〉４.0℃６0miｎ;
0４、４℃冰箱保存;
三、注意事项
01、加液尽量无气泡,枪不要打到底；
０２、严格冰上操作,防止RＮＡ降解;
【qRT—ＰCR】
一、实验准备:
01、试剂:
Roche的SｙＢrGreｅｎ（rox）
02、1。
5mＬ EP管、０。
2mLEP管、96孔板/八连冠；10μL、20μL、1０0μL、２00μL、2。
５μL、1００0μL枪;
03、冰盒一个、Rox化冻（避光）、引物化冻（ＧAPＤH）、cDＮＡ、ＤEPC水；
二、操作步骤:
01、 Ｒox 1０μL;
＋ddH2Ｏ 6μL；
+ P1（F）１
＋ Ｐ２（R） １
+cDNA 2
-—-—-—-—-———２0μL体系
02、计算：
每个样,X个抗体（至少包括ＧAPDH－内参,还有目的），三个副孔。
即如果六个样,２个抗体（ＧAＰＤH,PＬK1）,三个副孔。
6＊１＊３=1８≈20（ＰLK１）,6*1＊3=18≈2０（GAPDH）；
１
2
3
4
5
６
7
８
9
１０
１1
12
６/PＬK1
6/PLＫ1
6/ＰＬK1
５／PLＫ1
5／PＬＫ１
5/PLK1
６/GＡP
6/GAP
６／GAP
5/GＡP
5/GAP
5/ＧＡP
4/PＬK１
4/ＰLＫ1
4/PＬK1
3/PLK1
３/PLK１
3/PLK１
2/PLK１
2/PLK1
2／PLＫ1
1/PＬＫ1
1／ＰＬＫ１
1／PLK１
4/GAＰ
4/GＡP
４/ＧAP
3/GAP
3／GAP
3/GAＰ
２/GAP
2/GＡP
2/GAP
1／ＧAP
1/GAP
１／GAＰ
PLK1
Roｘ:
1０＊２0=200μＬ
DEＰC水：
6＊20=１20μＬ
Ｆ：
1*２0=20μＬ
R:
1＊20=20μL
GＡPDH
Rｏx：
１0＊２0=200μL
DEPC水:
６＊2０＝120μL
F:
1＊2０=２０μＬ
R：
１＊２０=20μL
03、稀释cDNA10倍（１8μLDEPC水+2μL）＝＝〉配置Mｉx（Rox+ＤEPC水+F+R）==>加样（一横排先加１8μＬmiｘ（ＧAPDH）,随后加入1８μLｍiｘ（PLK１）。
随后六个孔加同一个cDNＡ；
06、去除气泡：
加好样后，观察有无气泡。
如果有气泡,弹开,随后>2000rpm离心，时间不定（５s即可）;
07、上机+设置程序:
A、双击打开程序“ StepOnｅSoftwarev2．１”＝=〉点击“ＯK”=＝>点击“Iｇｎｏre&ＣontinuｅStａrtuｐ ”==>点击“Advaｎceｄ Setup＂==＞进入“ＥxpermｅｎtPropertｉeｓ界面";
B、ExpeｒmentPｒopertｉeｓ界面：
将ＥxprimentName从Untｉｔled修改为“日期,如2015-1２-１７",将UsｅｒName（Oｐtionaｌ）修改为“ＣZL”；
Ｗhichiｎｓtrumentareyoｕｕsingtｏｒuｎthｅexｐｅriment?
中选择“96wells”,一般无需修改；
Whattｙpｅofexperimｅntdoyouwanｔtoｓｅtup?
中选择“Quａntitation-Ｃｏmparａｔｉve CT（△△CＴ）”;
Ｗｈiｃhreagｅnｔsdo youwantto ｕseｔodetectｔhetargｅｔsequｅｎce ?
中选择“SYＢＲGreenＲｅａｇeｎｔｓ”;
Whichramｐｓｐｅeddoyouwaｎttｏuseinthe ｉnsｔruｍenｔｒｕn?
中选择“Faｓｔ（～40miｎｕtes tocoｍplｅte arun）”；
Ｃ、PｌatｅSｅtup界面—DefineTargｅts anｄSampｌｅs界面:
DｅfinｅＴargetｓ栏中:
如果有GＡPＤH、PLK1、Akｔ、PＩ3K三个引物，则点击“ AddＮeｗTargｅt”三下,出现“Ｔarget1、Tａrgｅt2、Ｔarget3、Target4”三个=＝>将其重命名;
Define Ｓａmples栏中:
如果有6个样品（Ｎ；１.5；３;6;9；1２），则点击“Add ＮｅwSaｍple"，出现“Sampｌe１、Sａmple2、Samｐle3、Sampｌe4、Ｓample5、Sａmpｌe6”六个＝=〉将其重命名;
PｌatｅＳeｔｕp界面-Aｓsigｎ Tarｇetｓ ａnd Samplｅｓ界面：
GAP/１
GAP/1
GAP/1
GＡP/２
GAＰ/2
GAP/2
GＡP/3
GAP/3
ＧAP/３
GＡＰ/４
GAP/4
GAＰ/4
Ｐlk1/1
Ｐｌk1／１
Plk1/1
Plｋ1/2
Plk１/２
Plk1/２
Ｐlk１/3
Plk１/3
Pｌk１/3
Plk１/4
Plk1/4
Pｌk1/4
Akt／1
Akt/１
Aｋｔ/１
Aｋt/2
Aｋｔ/２
Akt／2
Ａkt/3
Akt/3
Ａkt／3
Akt/4
Aｋｔ/4
Akｔ/４
PＩ３K/1
PＩ3Ｋ/1
ＰＩ3K／1
PＩ3K／2
PI３K/２
ＰI3K／2
PI３K/3
ＰI３K／3
PI3K/３
PI3K/4
ＰI3Ｋ／4
ＰＩ3K/4
ＧAＰ/5
GＡP／５
GAP／５
GＡP／6
GAP/６
ＧＡＰ/6
Plk1/5
Plｋ1／5
Plk1/5
Pｌk1/6
Plｋ1／6
Pｌk1／６
Akt／5
Akt/5
Ａｋt/５
Akｔ/6
Akt/6
Akｔ/6
ＰI3K/５
PＩ3K/5
PI3K/5
PＩ3Ｋ/6
PI3K/6
ＰI3Ｋ/６
D、Run Mｅthod界面:
设置温度;随后修改“ReactiｏnVolumePer Well”,将其改为“2０μＬ体系”；
E、点击“StarｔRｕn＂
三、注意事项
0１、注意一定要禁止气泡。
吸液体时,观察枪头中有没有气泡和液体;打加入液体时,延管壁加入,枪头只能打到第一档，随后观察枪头有没有打尽；
0２、加入引物时，一定要涡旋混匀;
03、Rox加入后,一定要避光；
04、加入的液体一定要等量;
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