植物组织内丙二醛MDA含量的测定实验设计.docx
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植物组织内丙二醛MDA含量的测定实验设计
实验设计
（一）
题目：
植物组织内丙二醛（MDA）含量的测定——比色法
组数：
第七组
组长：
杨曼
学校：
南通大学
年级：
13级
专业：
生物工程131
实验目的
1，根据待测植物的抗逆生理，掌握对待测植物做逆境处理的方法
2，比较同种胁迫逆境处理对待测植物不同部位生长的影响
3，比较不同胁迫逆境处理对待测植物生长的影响
4，了解植物组织内MDA积累水平对植物生理状态的影响
5，掌握比色法测定植物组织内MDA含量的方法和步骤
实验原理
1，植物抗逆是植物对抗不良环境，比如抗旱、抗盐碱、抗涝、抗风、抗冻、抗病虫害等的能力.
在自然界条件下，由于不同的地理位置和气候条件以及人类活动等多方面原因，造成了各种不良环境，超出了植物正常生长、发育所能忍受的范围，致使植物受到伤害甚至死亡。
这些对植物产生伤害的环境称为逆境（stress）或胁迫。
而植物对不良环境的适应性和抵抗力为抗逆性（stressresistance）或抗性.
逆境的种类多种多样，包括物理的、化学的、生物因素等，可分为生物逆境和非生物逆境两大类。
对植物产生重要影响的非生物逆境主要有水分（干旱和淹涝）、温度（高、低温）、盐碱、环境污染等理化逆境，生物逆境主要包括病害、虫害、杂草等。
理化逆境之间通常是相互联系的；例如水分亏缺通常伴随着盐碱和高温逆境，水分胁迫、低温胁迫、病虫害和大气污染等都可引起活性氧伤害。
2，文献研究结果表明,随着盐度增加,米草株高呈下降趋势,在高盐度（50%）下,米草叶面积、叶长等指标与对照组相比明显下降,鲜重与低盐度组比较显著下降。
【1】
提摩西草喜冷凉湿润气候。
越冬性好。
春季气温高于5℃时开始返青，秋季气温低于5℃停止生长。
较耐淹浸，不耐干旱。
在35℃以上的持续高温干燥条件下，不能安渡夏季。
要求中性及弱酸性土壤。
耐碱性较弱，在石灰质含量多的土壤上生长不良。
因此，根据待测植物护花米草和提摩西草的抗逆能力
并且考虑可行性，对提摩西草分别做碱逆境处理和高温逆境处理，然后再测量其体内丙二醛含量的变化。
3，植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，导致自由基（·O2，·OH等）积累，诱导细胞膜中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用，即膜脂过氧化反应。
丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位置释放出后，与蛋白质、核酸起反应修饰其特征；使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。
MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。
4，丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，所以其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。
在酸性和高温度条件下，它可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm，最小吸收波长在600nm。
5，但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加（植物在遭受低温、干旱、盐碱等逆境时，机体会响应这样的环境变化，而后调节有些酶的合成、活性等，结果是提高可溶性糖和氨基酸的浓度，提高细胞内渗透压，进而提高细胞的渗透吸水能力，适应逆境），因此测定植物组织MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的消光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100～300μg/gDW，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5μmol/L。
测量方法：
双组分分光光度计法
据朗伯-比尔定律：
D＝kCL，当液层厚度为1cm时，k=D/C，k称为该物质的比吸收系数。
当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于此混合液在该波长下各显色物质的消光度之和。
已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40，7.40。
MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸收系数为155，根据双组分分光度计法建立方程组，求解方程得计算公式：
C1（mmol/L）=11.71A450
C2（μmol/L）=6.45（A532－A600）－0.56A450
式中：
C1－为可溶性糖的浓度；
C2－为MDA的浓度；
A450、A532、A600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的消光度值。
实验器材
实验材料：
足量的提摩西草
实验试剂：
碳酸钠，碳酸氢钠，植物营养液，10%三氯乙酸（TCA）；0.6%硫代巴比妥酸（TBA）（先加少量的氢氧化钠（1mol/L）溶解，再用10％的三氯乙酸定容）;石英砂。
实验设备：
光照培养箱，烧杯（500mL），紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管3支；研钵三套；试管15支；pH试纸；量筒；刻度吸管：
10ml1支，2ml1支；剪刀1把。
样品采集
1，碱胁迫将两种碱性盐碳酸钠和碳酸氢钠按摩尔比1:
1混合，作为碱胁迫处理试剂。
设30,60,90，120和150mmol・/L5个浓度梯度（pH9.70~10.11）.选取长势均匀的提摩西14棵，随机分成7组，每组2棵，即为2次重复。
其中1组为对照，1组用于测定胁迫处理起始时的生物量，其余5组为胁迫处理组。
所有待测植物除浇灌液不同外，其他生长条件均相同，且生长环境温度为6~10℃。
以含有相应混合盐的营养液为处理液，每棵用200mL分三次透灌，对照用200mL营养液透灌。
连续处理12小时，在最后一次处理后的次日上午取样。
小心取出每棵中的叶片和根部，并根据组号对取出的叶片做相应的标记。
取出的叶片用蒸馏水洗净，并用吸水纸吸去附着的水分。
【2】
2，高温胁迫选取长势均匀的提摩西草9棵，随机分成3组，每组3棵。
其中1组为对照，1组用于测定胁迫处理起始时的生物量，其余1组为胁迫处理组。
将处理组置于37℃，光周期8h/16h（暗/光），光照强度4000lx的光照培养箱中，以进行高温胁迫处理.处理时间分别为3h,6h,9h,12h,15h。
每个时间点分别设置对照。
对照组在普通适宜环境下生长。
每处理时间点取处理组一部分叶片和对照组一部分叶片分别进行丙二醛含量的测定。
【3】
待测植物胁迫处理的数据记录表格如图所示
一，碱胁迫
处理
碱度
（mmol・/L）
植物叶片中MDA含量（μmol/g）
植物根部MDA含量（μmol/g）
碱胁迫处理起始
0
处理组
（1）
30
处理组
（2）
60
处理组
（3）
90
处理组
（4）
120
处理组
（5）
150
对照组
0
二，高温胁迫
处理
光照时间（h）
植物叶片中MDA含量（μmol/g）
对照组植物叶片中MDA含量（μmol/g）
高温胁迫处理起始
0
处理组
3
6
9
处理组
12
15
实验步骤
1，实验材料 受碱或低温逆境胁迫的提摩西草叶片或根部
2.MDA的提取 称取剪碎的试材1g，加入2ml10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆离心（4000×g）10min，上清液为样品提取液。
3.显色反应和测定 吸取离心的上清液2ml，加入2ml0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。
取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的
消光度。
4.计算含量
计算植物样品提取液中MDA的浓度：
C（μmol/L）=6.45（A532－A600）－0.56A450
计算测定样品中MDA的含量：
MDA（μmol/gFW）＝（MDA浓度（umol/L）*提取液体积（ml）））/植物组织鲜重（g）
实验预期结果
1.碱胁迫下，随着碱浓度的增加，植物体内MDA的含量也在不断增加，且根部MDA的含量稍大于叶片中MDA的含量。
2，高温胁迫下，随着光照时间的延长，植物体内MDA的含量不断增加。
3，将碱胁迫与高温胁迫得到的数据相比较，发现碱胁迫对提摩西草生长的影响较大
注意事项
1.0.1-0.5%的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适,若高于此浓度,其反应液的非专一性吸收偏高;
2.MDA-TBA显色反应的加热时间,最好控制沸水浴10-15min之间.时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降;
3.如待测液浑浊,可适当增加离心力及时间,最好使用低温离心机离心.
实验项目预期分配
姓名
任务
*曼
实验设计；定时透灌碱处理组营养液及对照组营养液；称取并剪碎试材，制得样品提取液；数据记录
*芳
待测植物选取，分组，贴标签；MDA显色反应和测定，MDA含量的计算
*晨
配制碱胁迫试剂；取胁迫完成后的处理组和对照组的叶片或根部，并且做相应的标签；准备好沸水浴锅
参考文献：
∙[1]肖强,郑海雷,陈瑶,黄伟滨,朱珠. 盐度对互花米草生长及脯氨酸、可溶性糖和蛋白质含量的影响[J].生态学杂志.2005（04）
∙[2]杨春武，李长有，张美丽，刘杰，石德成，鞠淼.盐碱胁迫下小冰麦体内的PH及离子平衡应用生态学报2008（05）
∙[3]杉木高温胁迫处理方案
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