分子生物技术在动物系统分类上之应用.docx

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分子生物技术在动物系统分类上之应用

分子生物技术在动物系统分类上之应用

分子生物技術在動物系統分類上之應用

邵廣昭

國立臺灣海洋大學海洋生物研究所

中央研究院動物研究所

摘要

隨著分子生物技術之飛躍進展，將其應用在生物系統分類與演化方面之研究也成為目前極為熱門的一項課題。

它雖可增加許多基因層次的形質，提供系統分類研究一項嶄新與具突破性之工具，協助解決或印證若干過去以傳統方法所難以解決的問題，但這些方法的本身也有其問題或缺點存在。

本文係將筆者於本年度於中山大學所舉辦之「分子生物技術在生物分類上之應用」研習會中之演講內容予以整理而成。

由於筆者之專長並非在分子生物技術，故僅能就動物系統分類學原理與方法之演進，分子生物技術應用於動物分類學之進展與現況予以介紹，並舉若干實例予以說明。

文末並特別列述若干重要之書籍，文獻與電腦分析軟體，使有志於利用分子生物技術從事動物系統分類研究的同仁或學生，能多一份有用的參考資料。

一、生物分類觀念與方法之演變

早期生物學的研究領域只有系統分類學（systematics），特別從林奈（Linnaeus）1758年開始對生物有正式命名之分類系統時起。

當時的分類和生物的進化尚無關連，直到Darwin1859,Haeckel1866才倡導分類系統最好能符合生物之演化關係（Mayr1983,Mayr&Ashlock1991）。

支序分類學派（cladistics）更是強調只有符合生物類緣關係的分類系統才是最自然的，最正確的。

在種之觀念上亦強調親緣種（phylogeneticspecies）而摒棄Mayr的生物種（biologicalspecies）觀念；亦即由子孫共有或可鑑別之形質（synapomorphicordiagnosticcharacters）所定義或進化來的單元體系（monophyleticgroup）才是建立生物分類系統或親緣關係的正確方法。

在此期間，雖然亦有不同分類學派分別提出不同的分類原則或理念，特別是較早的表型分類學派（phenetics）倡導分類的目的，不一定要反映生物之血緣關係，只要根據生物之所有形質之表型相似性即可，既客觀又方便。

由於支序與表型二學派之基本理念不同，涉及哲理問題而難以用科學試驗來證明孰是孰非或孰優孰劣。

因此使目前之分類理論與分類結果有許多不一致或矛盾的情形。

在分類實際操作方法方面，另一歸類方法是分成

（一）傳統或稱古典分類（Traditional,classicaltaxonomy），主要利用形態為依據；

（二）細胞分類學（Cytotaxonomy）根據染色體之數目或形態；（三）化學分類學（Chemotaxonomy）包括免疫電泳或蛋白質、酵素、次級新陳代謝產物之有機化合物等；（四）分子分類學（Moleculartaxonomy），利用DNA或RNA之序列比較。

另外所謂的數值分類學（NumericalTaxonomy）因本身並不會產生新的形質或特徵（Characters），只是利用前述四項方法所得到的形質，予以整理變成數值予以分析，故實際上只是一種數值或多變值統計分析方法而已，不應該和上述四種分類方法并列。

本文所介紹的分子生物技術即屬於分子分類學的範疇，它能夠獲得過去無法得知之基因庫的分子資料，因此不但多了一個新的形質組（Charactersuit），而且可以增加形質的數目甚多，對探討生物彼此間之血緣關係或分類系統又開啟了另一扇大門。

然而以上四種方法所獲得之資料，均可以用表型或支序的原理或方法來分析，並不一定只能用支序學派的方法。

分子生物技術所獲得之資料亦然，在這方面本文不擬詳予討論。

二、分子生物技術應用於動物分類學之興起

廿世紀以來之系統分類研究可說分成兩方面，一為由systematists研究phylogeny，一為由populationgenetists研究microevolutionarychange。

而事實上兩者關係十分密切。

過去分類學家均借重形態或行為上之資料，直到1960年開始隨遺傳學之發展而開使採用細胞與生物巨分子的資料。

如免疫方法應用在系統分類，最早是Goodman（1961）研究hominoids之進化；同功異構（Isozyme）之電泳技術研究果蠅種間之蛋白質變異（Hubby&Lewontin,1966），如今此方法已成為最普遍之分子系統分類學技術（Avis,1974,Lewontin1974,Buth1984）。

自從Zuckerkandal&Pauling（1962）提出胺基酸序列可推知「分子時鐘」（molecularclock）後，分子資料更是廣泛被應用在推算生物種間分歧或拓殖之年代。

分子資料可以量化來計算遺傳距離，確是過去傳統形態、生態、行為等形質所不易作到的。

染色體構造及數目的變異也提供分類及種間關係許多重要的資料（White,1973）。

十年來核酸技術之突破更是使許多分類學家得以利用核內、粒線體內或葉綠體內之DNA或RNA之變異來研究生物系統分類。

這些技術依照HillisandMoritz（1990）之MolecularSystematics一書所載可分為：

蛋白質之同功異構脢電泳（proteinⅠ:

IsozymeElectrophoresis）

蛋白質之免疫學技術（proteinⅡ:

ImmunologicalTechniques）

染色體之細胞分子生物學（Chromosome:

MolecularCytogenetics）

核酸之DNA分子雜合實驗（NucleicAcidsⅠ:

DNA-DNAHybridization）

核酸之限制內切脢切位分析（NucleicAcidsⅡ:

RestrictionSiteAnalysis）

核酸之序列分析（NucleicAcidⅢ:

Sequencing）

有關利用分子生物技術於系統分類學研究之進展與現況，Gibbons（1991）在Science上曾有一篇很好的review，題目為"SystematicsGoestoMolecular"，文中記述到1960年代當分子生物技術開始應用在系統分類時曾與傳統形態分類學家發生過激烈的爭辯，遭到許多博物館內資深分類學家強烈的抵制。

但由於分子生物技術逐漸成熟精進，與應用成功的例証愈來愈多，在80年代後已開始為許多博物館的分類學家或決策者所接受。

如今世界上許多著名的博物館如SmithsonianInstitute,AmericanMuseumofNaturalHistoryinNewYork,BritishMuseum,FieldMuseuminChicago,.....等等無不斥資改建舊館為新的分子生物技術實驗室，增添設備，聘請熟諳分子生物技術的年輕分類學家來結合資深的傳統分類學者（curators），共同合作在過去傳統分類的既有基礎上去尋找新的分類証據與答案，或是解決過去遺留下來無法解決的分類、進化問題。

U.C.Berkeley的AllenWilson是早期發展動物分子生物系統分類的先驅者。

他在1967年利用分子生物資料提出人類與黑猩猩的共同祖先大約只生活在四～六百萬年前一說時曾甚為轟動，此乃因此一年齡遠比古生物學家所預測的為短。

Wilson之實驗室25年來曾培養訓練出許多傑出的分子生物分類學家，分散在世界各地的博物館內從事系統分類的研究（圖一）。

其中的TomWhite更是在聚合連鎖反應（PCR,PolymeraseChainReaction）的技術上有所突破，此種方法可以利用在標本館中已被固定保存的標本來做。

故在1987年PCR技術商業化後，迄今短短幾年內已開始被大家一窩蜂地採用。

此項技術因為可以應用在不論是已絕跡的種或存活短暫的單一族群的標本，而不再只侷限於活的或新鮮的生物標本，同時它也只需要很微量的樣本即可進行。

因此，分子生物的技術可以說又進入了一個更新的紀元。

三、分子生物技術應用於動物系統分類應有之觀念與作法

由於分子生物技術的日新月異，從研究任何一個個體，族群或種的遺傳基因，分子結構或序列，到許多不同的族群，不同的種或種以上的分類階層（categories）之後；就可以用來比較這些不同生物群（taxa）之間之相似或相異性去推知其親緣關係。

換言之，分子生物的資料正如同任何一門其他不同的生命科學的領域一樣，如形態、細胞、遺傳、生理、生化、內分泌、生態、行為、地理分布等也算是「分類形質」（taxonomiccharacters）中的一類而已，都可以用來從事分類系統或類緣關係的推斷。

只是採用這些不同形質所作出來的結果常不相一致，以致於引起許多爭辯。

事實上生物的進化在不同的內在或外在，分子或形態，生理或生態等的形質間並不是一定平行一致的，也就是所謂的mosaicevolution。

造成這種形質進化不一致（incongruent）現象，也可能是本來生物的進化就是如此，也可能是由於個體的變異或人為取樣測量的誤差所造成。

這類問題也就是數值分類學（NumericalTaxonomy）中所謂的承異同形性（homoplasy），包括平行演化（parallelism），趨同演化（convergence）及逆轉（reversal）等的現象，它們可以由不同的表型（phenetic）或支序（cladistic）方法予以檢出。

但除非發明時光隧道之類的機器，讓我們可以看到過去，否則永遠無法証明生物真正的演化過程或親緣關係（truephylogeny），或真正的種的界定（truespecies）。

因此目前實在不必要去爭論究竟那一類的分類形質或那一種資料分析的方法才是最好的。

要綜合這些不同形質或不同方法（既便是分子生物資料本身也有許多不同的形質種類和不同的分析方法）所作出來的結果，目前大概只能用所謂的公同樹（consensustree）或公同指標（consensusindex）方法來加以整理。

分子生物技術只是一種最現代化的尖端技術，可用來作為系統分類學研究的工具。

它本身仍有許多限制或缺點，它也絕不是萬靈丹（panacea）。

它只是用來輔助過去利用形態、細胞、生態、行為....等形質無法解決的一些分類或進化的問題，特別是對族群或種間判別或兩似種（siblingspecies）間鑑別的有力工具。

分子生物技術的進展太快也會產生一些錯誤或過於大膽的推斷，以及盲目蒐集過多不需要的資料，甚至超過目前分類進化理論或分析方法的能力範圍。

因此如何針對重要有顯著意義或有學術價值的生物分類問題，再來挑選適當的分子生物技術來作，才不會浪費寶貴的人力物力。

四、分子生物技術應用於動物系統分類之一些研究實例

由於篇幅有限，以下僅就分子生物技術在動物系統分類方面的利用的一些較具代表性的學術報告略作介紹。

（一）免疫學（Immunology）--基於血緣關係近者，蛋白質之抗體反應會較強之原理，用免疫之方法來研究動物的系統分類。

但由於技術較難，故雖已有60年以上的歷史，並未被廣泛使用。

Leone（1964）曾有綜合整理。

最近由於技術上有顯著改進，已有不少報告從事抗原反應之定量研究。

Chamgionetal（1974）提出microcomplementfixation之技術，以及免疫遺傳或免疫電泳法使得血清應用在生物系統分類之研究仍得以持續。

例一：

Collier&O'Brien（1985）--印度豹Cheetah（Aconyx）在形態上一直認為是離獅虎最遠，但分子資料卻顯示它比其它貓科的屬更近於獅虎類。

（二）巨分子（macromolecules）--從早期用filterpaper之diffusionchromatography，到後來以cellulosemembrane,starch,polyacrylamide製作gel之電泳（electrophoresis）方法；由單向到雙向（twodimensionalseparation）將不同電性及大小的蛋白質或酵素之分子分離，經由組織染色或螢光法予以顯現。

由於電泳圖常有種之特異性，且隨親緣關係之遠近成正比，故可用來研究分類與進化的問題。

電泳方法可應用在蛋白質、同功異構（Isozyme）核DNA、粒線體DNA、rRNA等等各種不同之巨分子種類上。

例一：

Shaoetal（1975）--利用不同篩孔大小之polyacrylamidgel分析魚體之水溶性萃取蛋白（myogens）判定本省俗稱之肥帶與瘦帶確為兩不同種白帶魚。

例二：

Chen（1990）--以isozymes檢討本省產庫氏天竺鯛之相近種群間的血緣關係及其生態區位，支持資源分配之理論。

以isozyme來探討生物之種群判別、類緣關係、及地理隔離、種化問題或地理變異等之報告甚多。

以魚為例，有人利用巴拿馬兩側大西洋與東太平洋產兩種相似雀鯛間之遺傳距離因符合巴拿馬隆起隔絕兩洋的地質年代，因而支持分子時鐘之假說。

此外利用isozyme分析採自各地虱目魚族群間之差異，提出虱目魚在中西太平洋區共分成三個大的族群。

狐馧之傳統分類不易，過去認為只有一種，但利用isozyme目前已知應有分大西洋與印度洋兩種。

利用Isozyme作材料也有下列的若干疑慮與缺失，包括遺傳距離與分子時鐘假設之有效性仍屬存疑，isozyme究竟應適用於「族群」、「種」、「屬」或「亞科」等的那一層次上仍待通盤檢討；DNA鹼基或胺基酸之替代因遠多於電泳所可能之檢測，故分析結果即有其誤差。

同時此類方法需有新鮮之標本，但國外借閱或採集之標本常無法作到。

例三：

Hillis&Davis（1986）--研究rDNA之restrictionsitemapping，推測青蛙Rana屬之親緣關係。

例四：

Fieldetal（1988）--以18rRNA之比較，將無脊椎動物所有的門重新分類。

（三）蛋白質或核酸之序列--比較不同種的同源DNA或RNA上鹼基數之差異來表示突變的數目或遺傳的距離（Goodman,1982）。

如用在比較胺基酸序列則由於geneticcode之degeneracy，故其所提供之資訊較少。

目前已有許多巨分子之胺基酸序列已知（Dayhoff,1973,1976,1979）。

它們的演化速率通常histones改變甚慢，cytochromeC相當慢，globins普通，fibrinopeptides改變非常快。

故當研究的分類層級不同，所應採用的蛋白質亦應不同。

例一：

KingandWilson（1975）--由hemoglobins和fibrinopeptides中胺基酸序列比較，得知人和黑猩猩之間的血緣關係甚近。

例二：

BeverleyandWilson（1985）--研究夏威夷與北美果蠅hemolymphproteins之免疫距離得知夏威夷果蠅是約在4000萬年前自北美移入。

（四）DNA雜合（hybridization）--把DNA純化後，打斷成500bp之長度，放入100℃把兩股分開。

將其中一種生物之DNA（單股）標上同位素（探針,probe），去與另一種生物的單股混合，然後逐漸冷卻癒合（混股），看癒合的比例（反應在△值上）來推算遺傳距離。

例：

Sibley&Ahlquist（1983）--DNAbp差1％，約表500萬年前分化。

（五）粒線體DNA（mt-DNA）--高等動物之mtDNA為雙股封閉的環狀分子，約有16,000個basepair，包含13個蛋白質gene，22個tRNAgene，兩個rRNAgene和一個含Displacementloop（D-loop）的控制區。

mtDNA具有分子小，簡單，演化快速，種間差異大，族群內穩定性高，母系遺傳及遺傳性狀數目多（>350restrictionendonucleases）等特性，故常被用來以限制內切切位片段的多型性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP）上來獲得鹼基置換（basesubstitution），長度變異（lengthvariation）或序列重排（sequencerearrangement）之資料藉以推斷動物不同種或族群間之差異。

然而由於mtDNA之方法需純度高、量多；且假設大小相同之片段，其sequence相同；分歧度之計算只能考慮substitution，而非insertion、deletion或duplication之情形；mtDNA每段之變異速率都不等，故mtDNA之RFLP應只適用於種內的研究。

例一：

Meyeretal（1990）--非洲Victoria湖中之慈鯛Haplochromis屬有近200種，由於Victoria湖歷史不足百萬年，故比對14種該湖之慈鯛與其他23種非洲慈鯛之803個鹼基對後，結果支持Victoria湖之慈鯛為monophyly，且分化時間與湖泊形成年代相吻合，是explosiveevolution之最佳例證。

例二：

Tzengetal（1990）--兩種體色不同的台灣淡水纓口鰍（Crossostomalacustre及C.tengi）過去認為不同種，但以mtDNA之14種endonuclease分析結果，兩者相異甚少，且可雜交，故應未達不同種的程度。

例三：

BowenandArise（1990）--分析墨西哥灣與大西洋不同族群黑鱸mtDNA，顯示兩者為同源，隔離時間在50萬年前左右。

例四：

WayneandJenks（1991）--研究美國德州與路易斯安那州之紅狼（Canisrufus），原認為它是與美州小狼近似的有效種，且可以雜交，但mtDNA分析顯示紅狼具灰狼與美洲小狼兩者之一的mtDNA，顯示紅狼為灰狼與美洲小狼廣泛雜交所造成

BiochemicelGeneticsandTaxonomyofFish--TheFisheriesSocietyoftheBrifishIslesSymposium--A.Ferguson&E.Thorpe（eds.）Piper'sCroft,KilliecrankiePerthshire,Scotland.

六、分子生物技術與動物系統分類或進化有關之主要學術期刊

SystematicZoology

JournalofMolecularEvolution

JournalofSystematicZoologyandEvolutionResearch

MolecularBiologicalEvolution

MolecularBiologyandEvolution

MolecularMarineBiologyandBiotechnology

MolecularPhylogeneticsandEvolution

Evolution

ProceedingofNationalAcademyofSciences,USA

TrendsinEcologyandEvolution（TREE）

Science

Nature

Genetics

NucleicAcidResearch

七、與分子生物系統分類資料分析有關之電腦軟體

分子生物之形質資料與一般傳統形態形質資料之性質不同，故在計算生物（或OTUs）間之相似度的方法或係數種類亦不同，特別需考慮sequencealignment之問題，而並單純或直接去比對各形質之異同。

以下所介紹之軟體係筆者所知可利用個人電腦（IBMPC或Macintosh）進行分析之軟體名稱、作者、價格及出版或經銷商或個人之聯絡地址等資料。

1.PHYLIP（Ver.3.3）--PhylogenyInferencePackage，內含卅餘種獨立程式可分析各種類型之資料及選用不同的分析方法。

作者為JoeFelsenstein（Dept.ofGeneticsSK-50,Univ.ofWashington,Seattle,Washington98195），免費但需寄空白磁片。

2.PAUP/PC（Ver.3.0）--PhylogeneticAnalysisUsingParsimony，根據支序學派之進化儉約說之原則進行分析。

作者為DavidSwofford（IllinoisNaturalHistorySurvey,NaturalResourcesBuilding,607EastPeabodyDrive,Champaign,Illinois61820），US$50。

3.BIOSYS-1or-2--AnalysisofAllelicVariationinPopulationGeneticandBiochemicalSystematics,主要在分析isozymes之基因頻度資料。

作者同上。

US$35。

4.MacClade（Ver.1or2）--Discrete-stateparsimonymethodsincludingDNAandproteinparsimonybyusingMacintoshcomputer,作者為WayneMaddison,（Dept.ofIntegrativeBiology,Univ.ofCalifornia,Berkeley,CA94720），US$8。

5.TreeAlign--MultiplesequencealignmentprogramthatbuildstreesasitalignsDNAorproteinsequence。

作者為JotunHein（Univ.ofMontreal），免費。

6.Hennig86--由J.F.Farris所著之支序分析方法，如需採購，需寫信給Dr.ArnoldKluge（Div.Amphibians&Reptiles,Mus.OfZool.,Univ.ofMichigan,AnnArbor,MI48109-1079），US$60。

7.RESTSITE--Constructphylogeniesfromrestrictionsiteorrestrictionfragmentdata,針對粒線體DNA分析資料而撰。

作者為JoyceMille（Dept.ofAgronomy,Univ.ofWisconsin,1575LindenDrive,Madison,Wisconsin53706），免費。

8.NTSYS-PC--NumericalTaxonomyandMaltivariateAnalysisSystem,包括聚類分析與空間排序。

作者為F.J.Rohlf（經由ExeterSoftware代售，100NorthCountryRd.,SetauketNY11733,U.S.A.），US$250。

9.Turbotree--作者為DavidPenny（Dept.ofBotany&Zoology,MasseyUniv.PalmerstonNorth,NewZealand），免費。

10.VOSTORG--Programsforalignmentandanalyzingphylogenie