常见流式项目检测.docx

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常见流式项目检测

常见流式项目检测（SOP）

CD55/CD59测定

方法

流式细胞仪（BDFACScantoll）

原理：

双色直接免疫荧光法。

近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。

血细胞（红细胞和白细胞）通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的单克隆抗体结合。

用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位     静脉采血

抗凝剂       EDTA或肝素抗凝血

要求   1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．溶血样本不能用。

试剂

品牌              剂型   规格   贮存

BD

1，单克隆抗体     液体   1ml   2—8℃

2，全血溶血试剂   液体  100ml    室温

3，鞘液           液体   20L     室温

4，清洗液         液体   5L      室温

5，荧光微球       液体   10ML    2-8℃质控品 BD公司产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次；遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BDFACScantoll

样本制备:

（一）白细胞CD55／CD59检测

1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记；分别加入CD55／CD5910ul和相应的同型对照10ul；分别向二管中加入样品100ul；避光15-20分钟。

2．溶血：

BDFACSLysing（按说明书进行原液10倍纯净水稀释后使用）

稀释的溶血素37℃水浴预温后每管加600ul混匀避光室温溶血8-10分钟。

3．用PBS洗涤离心；

4．上机测样；

（二）红细胞CD55／CD59检测

1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记

2．分别加入CD55／CD5910ul和相应的同型对照10ul。

3．向二管中加入1：

200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光15-20分钟。

4．洗涤离心。

5．混匀、上机测样。

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度   批内五次重复CV<2％

灵敏度   500—1000个荧光素分子

参考值

CD55>97%           CD59>97%

PNH的临界值：

RBC CD59>95%   WBC CD59>90%

PNH的诊断值：

RBC CD59>91%   大部分>80%

中性粒细胞CD59>84%

临床意义

用于AA和PNH的诊断和分型诊断。

PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。

HLA-B27测定

方法

流式细胞仪（BDFACScantoll）

原理：

双色直接免疫荧光法。

将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位     静脉采血

抗凝剂       EDTA或肝素抗凝血

要求   1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，             样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌              剂型   规格   贮存

BD

1，单克隆抗体     液体   1ml   2—8℃

2，全血溶血试剂   液体  100ml    室温

3，鞘液           液体   20L     室温

4，清洗液         液体   5L      室温

5，荧光微球       液体   10ML    2-8℃

质控品 BD公式产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：

遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BDFACScantoll

样本制备：

1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照（IgG2a-FITC／IgG1-PE）

2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3）混匀，避光，室温孵育15-20分钟

4）溶血：

BDFACSLysing（按说明书进行原液10倍纯净水稀释后使用）

稀释的溶血素37℃水浴预温后每管加600ul混匀避光室温溶血8-10分钟。

5）用PBS洗涤、离心、上机测样（备注：

测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）

报告结果

报告阴阳性

操作性能

精密度   批内五次重复CV<2％

灵敏度   500—1000个荧光素分子

参考值

阳性：

HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。

临床意义

HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。

T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测

方法

流式细胞仪（BDFACScantoll）

原理：

直接免疫荧光法。

肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培养（辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。

淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。

因此，利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量），然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位     静脉采血

抗凝剂       EDTA或肝素抗凝血

要求   1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，             样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核  细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

淋巴细胞培养体系（自配）

成分：

刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。

选白美国SIGMA公司。

单克隆抗体

CD4—PC5、IL-4-PE、IFN-γ-FITC选自美国BD公司。

质控品 BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：

遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BDFACScantoll

操作：

细胞培养与染色

取200ul抗凝血加入lOulCD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5％C0237℃孵育18小时，取出后以PBS洗一次。

用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。

将细胞分成两管，其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-γ-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。

流式细胞仪测定

打开流式细胞仪及氩激光光源（488nm）预热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光（FS）和测向散射光（SSC）散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-γ-FITC的表达。

●淋巴细胞在FS／SSC散点图中位置，即A门内细胞；

●A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞；

●B门内TH细胞亚群分布：

1区数值---Th1细胞 （%）

4区数值---Th2细胞 （%）

2区数值---Th0细胞 （%）

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度   批内五次重复CV<2％

灵敏度   500—1000个荧光素分子

正常参考值

Thl（IFN-γ）：

17.39±5.52%      Th2（IL-4）：

1.50±0.44%

ThO：

0.51±0.26%

临床意义

淋巴细胞均分泌多种细胞因子：

Thl细胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-γ和TNF-b／a等，Th2细胞主要分泌IL-4．IL-5．IL-6，IFN-γ为Thl最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。

Thl为IFN-γ+，Th2为IL-4+。

静息状态（人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的IFN-γ和IL-4也微乎其微。

当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中Th0即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-γ和IL-4也较多。

本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。

白血病免疫分型测定

方法

流式细胞仪（BDFACScantoll）

原理：

三色直接免疫荧光法。

正常血细胞的分化成熟过程中，细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关，因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。

利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色，通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析，由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。

三色染色在白血病免疫分型中较为常用。

根据分型需要，选择相应抗原的标记抗体，一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组，再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体，共三种抗体加入一管

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。

采集部位     腰穿采骨髓

抗凝剂       肝素抗凝

要求   1．样本量至少3ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，             样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌                  剂型    规格    贮存

BD

成分 1：

单克隆抗体          液体   1ML     2—8℃

2：

全血溶血试剂        液体   100ML   室温

3：

IntraPrepPermeabilizationReagent

成分1（固定剂）  液体   5ml     室温

成分2（透膜剂）  液体   5ml     室温

4：

鞘液                液体   20L      室温

5：

清洗液              液体   5L       室温

6：

荧光微球            液体   10ML    2-8℃

质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：

遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BDFACScantoll

操作-样本制备：

细胞膜表面抗原

1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。

2．首先每管中加入5ulCD45-PC5抗体。

3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul（注意：

必须是FITC和PE标记的抗体搭配）

4．各管中加入标本（骨髓或外周血）30～100u1（根据细胞的多少决定），振荡混匀，室温避光20～30分钟。

5．溶血：

BDFACSLysing（按说明书进行原液10倍纯净水稀释后使用）

稀释的溶血素37℃水浴预温后每管加600ul混匀避光室温溶血8-10分钟。

细胞浆和核抗原

1．准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。

2．首先每管中加入标本（骨髓或外周血）100ul（根据细胞的多少决定），5ulCD45-PC5抗体。

室温避光20分钟。

3．每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。

4．各管中加入PBS4ml。

5．300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。

（1500r/min*5min）

6．各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。

7．加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。

8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。

9．300g离心5分钟后，弃去上清液。

10．各管中加入PBS500ul，振荡混匀。

11．上机测样

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度   批内五次重复CV<2％

灵敏度   500—1000个荧光素分子

参考值

CD34+<5%     MPO+<5%

粒系<20%    淋系<30%

临床意义

用于血液病的诊断和分型诊断

红细胞膜蛋白结构测定

（红细胞抗体）

方法

流式细胞仪（BDFACScantoll）

原理：

直接免疫荧光法。

FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位     静脉采血

抗凝剂       EDTA或肝素抗凝血

要求   1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．溶血样本不能用。

试剂

品牌              剂型   规格   贮存

BD

成分 1：

单克隆抗体     液体   1ML     2—8℃

2：

多聚甲醛       液体   14ML    室温

3：

鞘液           液体   20L      室温

4：

清洗液         液体   5L       室温

5：

荧光微球       液体   10ML    2-8℃

质控品 BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：

遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BDFACScantoll

操作：

1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照（IgG-FITC）

2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血（1：

200稀释后）。

3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟

4）上机测样

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度   批内五次重复CV<2％

灵敏度   500—1000个荧光素分子

参考值

IgA<2.78%       IgG<2.98%

IgM<2.52%       IgD<2.88%

临床意义

自身溶血性贫血的分型诊断

粒细胞抗体测定

方法

流式细胞仪（BDFACScantoll）

原理：

直接免疫荧光法。

FITC标记的各型多克隆抗体，加到经溶血处理后的样本中，与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位     静脉采血

抗凝剂       EDTA或肝素抗凝血

要求   1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌              剂型   规格   贮存

BD

成分 1：

单克隆抗体     液体   1ML     2—8℃

2：

全血溶血试剂   液体   100ML   室温

3：

多聚甲醛       液体   14ML    室温

4：

鞘液           液体   20L     室温

5：

清洗液         液体   5L      室温

6：

荧光微球       液体   10ML    2-8℃

质控品 BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：

遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BDFACScantoll

操作：

1）溶血：

BDFACSLysing（按说明书进行原液10倍纯净水稀释后使用）

稀释的溶血素37℃水浴预温后每管加600ul混匀避光室温溶血8-10分钟。

2）分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照（IgG-FITC）

3）分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。

4）混匀，避光，室温孵育15-20分钟，洗涤离心

5）上机测样

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度   批内五次重复CV<2％

灵敏度   500—1000个荧光素分子

参考值

IgA<2.68%       IgG<2.66%

IgM<2.49%       IgD<3.4%

临床意义

白细胞减少症的分型诊断，大多数白细胞减少症患者抗体为阳性

淋巴细胞亚群测定（TBNK）

（CD系列）

方法

流式细胞仪（BDFACScantoll）

原理：

六色直接免疫荧光法。

荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过避光室孵育、溶血、等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数或绝对数。

淋巴细胞表面抗原分布如下：

T淋巴细胞：

CD3+；B淋巴细胞：

CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：

CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：

CD3+CD8+；NK细胞：

CD3-CDl6+56+等。

根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位     静脉采血

抗凝剂       EDTA或肝素抗凝血

要求   1．样本量至少2ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，             样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌              剂型   规格   贮存

BD

1：

单克隆抗体     液体   1ml     2—8℃

2：

全血溶血试剂   液体   100ml   室温

3：

鞘液           液体   20L     室温

4：

清洗液         液体   5L      室温

仪器

BDFACScantoll

样本制备：

1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul六色单克隆荧光抗体和同型对照

2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3）混匀，避光，室温孵育15-20分钟

4）溶血：

BDFACSLysing（按说明书进行原液10倍纯净水稀释后使用）

稀释的溶血素37℃水浴预温后每管加600ul混匀避光室温溶血8-10分钟。

5）上机测样

报告结果

报告百分数（和绝对值）

操作性能

精密度   批内五次重复CV<2％

灵敏度   500—1000个荧光素分子

参考值（百分数（绝对值））

CD3+ 60.8-75.4%（1141-1880）   CD4+ 29.4-45.8%（478-1072）

CD8+ 18.2-32.8%（393-742）     NK   9.5-23.5% （175-567）

Th/Ts 1.05-2.03

临床意义

1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。

临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。

Th／Ts比值升高：

表示免疫功能亢进：

见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。

Th／Ts比值减低：

表示免疫功能下降：

艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。

2：

NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。

NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。

NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。

血小板膜表面抗体测定

方法

流式细胞仪（BDFACScantoll）

原理：

直接免疫荧光法。

FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。

标本采集与处理

受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位     静脉采血

抗凝剂       EDTA或肝素抗凝血

要求   1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。

3．样本血小板计数应在150-450×109/L之间。

若>450×109/L，             样本需要稀释，用PBS稀释；若<150×109/L，应多采集进行富集达到流式检测的细胞数。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌              剂型   规格   贮存

BD

成分 1：

单克隆抗体     液体   1ML     2—8℃

2：

多聚甲醛       液体   14ML    室温

3：

鞘液           液体   20L      室温

4：

清洗液         液体   5L       室温

5：

荧光微球       液体   10ML    2-8℃

质控品 BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：

遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BDFACScantoll

操作：

富集血小板法：

1）800r/min*15min,取上清，

2）加4－5ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重