《蜂花粉中赭曲霉毒素的测定方法》.docx
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《蜂花粉中赭曲霉毒素的测定方法》
《蜂花粉中赭曲霉毒素的测定方法》
编制说明
一、标准制定的任务来源及意义
1、任务来源
本标准是根据中华全国供销合作总社下达的任务，名称为《蜂花粉中赭曲霉毒素的测定方法》，计划编号为2013GH-1-018，由中华人民共和国江苏出入境检验检疫局负责制定，本标准由中华全国供销合作总社提出并归口。
2、制定标准的意义
赭曲霉毒素是赭色曲霉属和几种青霉属真菌产生的一种毒素，包括A、B、C等7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A（OTA）毒性最大[1]。
OTA对多种动物具有肾毒性和肝毒性，以及三致作用——致突变、致畸和致癌。
因此国际癌症研究机构IARC将其定为IIB类致癌物[2]。
赭曲霉毒素一般污染谷类、大豆类、干果类以及动物肾脏、酒类及葡萄汁、咖啡等，欧盟国家对赭曲霉毒素在食品中的限量标准极其严格，如在谷物中不得超过5µg/kg；在谷物制品中不得超过3µg/kg，在干鲜果品中不得超过10µg/kg[3]。
我国目前在国标规定谷物豆类中赭曲霉毒素的限量标准为5µg/kg[4]
蜂花粉为蜜蜂从显花植物花蕊内采集的花粉粒，混合了蜜蜂分泌的多种活性成分[5]如22种氨基酸、14种维生素、30多种常量和微量元素、94种活性酶、辅酶、植物蛋白等多种生长素、抗衰老物质,而且这些营养物质大多以游离状态存在，易为人体吸收和利用。
花粉具有健脑增智提神、护肤美容、抗衰老、防治心血管病、防治前列腺疾病等作用，因此是国际上公认的迄今人们发现的营养成分和功效最完全的物质，被誉为“浓缩的营养库之称”[6]。
因此受到包括中国、欧美及日韩等消费者的欢迎。
近年来，各国对于蜂花粉的进出口需求逐渐增大，对其质量要求也在不断增加。
而近年来，环境污染、农民在生产中无专业知识等行为对我国蜂产品的质量造成了很大的污染。
蜜蜂刚采回的鲜花粉含水量通常在20%以上，在常温下非常适合微生物的繁殖生长[7]，另外，蜂花粉在生产过程中，高温、高湿以及环境不卫生等诸多因素，也极易滋生赭曲霉毒素。
因此控制花粉中真菌毒素的含量非常必要。
目前国内外对于赭曲霉毒素的检测方法主要集中在谷物类基质，有薄层色谱法（TLC）[8]、酶联免疫法（ELSA）[9]，免疫亲和柱-HPLC法[10-12]以及液相色谱串联质谱法等[13-14]，TLC法操作较复杂，提取过程中所需的有机溶剂较多，易污染环境，对人体有较大危害，且灵敏度和特异性不高。
ELSA法虽然灵敏度较高，但假阳性率也较高，因而比较适合快速筛选。
目前免疫亲和柱联合液相色谱法用于检测赭曲霉毒素比较常见，免疫亲和柱特异性高，联合色谱法定量准确、灵敏度高，但缺点是价格昂贵，储存、运输条件要求高，且液相色谱法不是最终的确证方法。
近年来，在兽药残留检测方面，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术的应用越来越广泛，其在抗基质干扰能力、准确定性以及灵敏度方面具有较强的优势。
本文在研究采用液相色谱质谱检测的基础上，着重使用SPE技术来降低成本，实验证明，该方法准确，可靠，灵敏度高，能达到限量要求，且经济实用。
目前国内外对于花粉的研究还停留在检测营养成分的阶段，对于花粉可能的生物毒素的污染研究刚刚起步。
现行的国家标准或行业标准中，对赭曲霉毒素A的限量要求和检测方法针对的基质多是谷物和酒类，国内外也没有有关花粉生物毒素研究的相关报道。
本标准建立了蜂花粉中赭曲霉毒素A残留检测的方法。
适用于多种花粉基质，填补了蜂花粉中生物毒素残留检测的空白，结果准确可靠。
二、编制依据
本标准的编制遵循GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：
标准的结构和编写规则》[19]、GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：
化学分析方法》[20]以及SN/T0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》的要求进行编写制订的[21]。
三、标准制定过程
本标准起草单位在2013年1月收到中华全国供销合作总社任务下达文件后，立刻开始着手进行标准文本、编制说明和验证工作。
本标准起草人通过查询相关资料和文献，结合国内外文献中已有的检测基础，建立了蜂花粉中赭曲霉毒素的检测方法。
经实验研究验证后，方法的灵敏度、特异性和选择性均能满足相应的检测要求。
四、主要实验技术内容
1样品前处理条件的优化
1、提取溶剂的选择
赭曲霉毒素A是一种无色结晶化合物。
可溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液。
微溶于水。
在实验过程中，萃取溶剂的选择直接影响着回收率的高低，花粉中富含蛋白质、黄酮化合物等成份，基质较为复杂，因此结合赭曲霉毒素的理化性质与花粉的基质因素，我们考察了甲醇、乙腈以及甲醇-水、乙腈-水4种提取液的提取效果。
实验表明：
甲醇、乙腈提取效率较高，甲醇-水和乙腈-水体系相对提取效率较低。
另外，甲醇和甲醇-水提取时，提取液颜色较深，吸附了花粉中较多的色素杂质；而乙腈和乙腈-水提取体系，提取液颜色较浅。
由于乙腈还是较好的蛋白质沉淀剂，因此采用乙腈作为提取溶剂较为合适。
2、SPE小柱的选择
在真菌毒素类残留检测中，常用的净化手段是采用免疫亲和柱的方式，而对固相萃取净化方式却鲜有报道。
免疫亲和柱虽然特异性好，回收率也高，但价格昂贵，对储存和运输要求较高（需低温），批间差异较一般SPE柱大。
本文比较了HLB柱与免疫亲和柱两种净化方式，在采取外标法定量的方式下，这两种净化方式基质干扰较少，净化效果相当。
即使免疫亲和柱的生产成本日益下降，但相对于HLB来说，检测成本还是过于昂贵，因此在净化效果相差不多的情况下，采用HLB的固相萃取方式较为合适。
3、进样前的定容溶剂的选择
进样前样品的定容液的组分直接影响到赭曲霉毒素A在色谱柱中的分离行为和离子化效率，根据赭曲霉毒素A的理化性质，其易溶于极性有机溶剂，微溶于水。
为了选择最佳的定容溶剂，分别比较了乙腈、乙腈：
水=1:
1、乙腈：
水=3：
7三种定容溶剂。
虽然乙腈对于赭曲霉毒素A的溶解度最好，但由于流动相初始浓度水相占90%，进样后进样液与流动相混合时乙腈含量过大，导致色谱峰峰形很差，甚至有分峰现象出现。
而乙腈：
水=1:
1、乙腈：
水=3：
7定容则峰形变好，丰度也有所上升。
相较这两个浓度的乙腈-水体系，前者的峰响应强度更高一些。
另外，在实验过程中也发现，用1mL乙腈：
水=1：
1定容溶剂直接定容和先用500µL乙腈溶解残渣后再用500µL水稀释定容，其峰响应强度也有所不同，后者相对较高。
可能是因为赭曲霉毒素A更易溶于乙腈的原因。
因此，选择乙腈：
水=1:
1溶剂并采用先乙腈后水的定容方式比较合适。
2质谱条件优化
1、质谱参数的优化
在对赭曲霉毒素A标准溶液进行负离子一级质谱全扫描时发现，m/z402.0的[M-H]—信号最强，对其进行轰击来查找二级碎片，在二级全扫描图谱中，发现其主要特征碎片有2个，即m/z358.2和211.1。
根据采用子离子扫描的方式对子离子及碰撞能量进行优化选择，确定最终的质谱参数如下：
a）离子化模式：
电喷雾负离子模式（ESI－）；
b）质谱扫描方式：
多反应监测（MRM）；
c）电喷雾电压（IS）：
4500V；
d）雾化气压力（GS1）：
35Psi；
e）气帘气压力（CUR）：
30Psi；
f）辅助气流速（GS2）：
35Psi；
g）离子源温度（TEM）：
500C；
h）其他参考质谱条件见下表1。
表1赭曲霉毒素A碰撞电压、去簇电压质谱参数
化合物
母离子（Q1）
子离子（Q3）
CE
DP
EP
CXP
赭曲霉毒素A
402.0
358.2*
-28
-62
-10
-15
211.1
-37
-62
-10
-15
注:
“*”为定量离子对
2、基质效应的影响
由于花粉基质复杂，在实验中发现，分别以定容溶剂、阴性花粉乙腈直接提取定容的样品和经过净化后的空白花粉样品配制的相同浓度赭曲霉毒素A的溶剂标准溶液和基质标准溶液，以既定的色谱质谱条件进行分析，存在明显的基质效应。
阴性松花粉加标浓度为20ng/g的峰面积见表2
表2溶液标准和基质标准测定的20ng/g阴性松花粉的峰面积
定容溶剂
直接提取样品
经净化后的样品
峰面积
2.04e+005
5.54e+004
1.38e+005
由上表可知：
直接提取样品的基质抑制最强，经过SPE净化后，基质效应有较大程度的改善，但还是存在基质抑制效应，因此，采用基质匹配曲线可较好的校正基质效应。
3方法学验证
3.1校正曲线与线性范围
以空白样品作为稀释液，加入不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液配制标准工作曲线，使得工作液的浓度分别为5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL，按本标准确定的条件分别测定，以待测物峰面积对质量浓度作线性回归方程，结果表明：
赭曲霉毒素A在5-100ng/mL范围内呈现良好的线性关系，线性方程为y=1.27e+005x+4.63e+005（r=0.9952）。
图3赭曲霉毒素线性曲线
3.2测定低限
本方法的测定低限为5.0µg/kg。
3.3方法回收率和室内精密度数据
本标准方法分别以松花粉，玉米花粉，茶花粉，荷花粉，油菜花粉为空白样品基质，进行三个浓度水平的添加回收试验，每个浓度水平进行六次重复实验，测定各种基质赭曲霉毒素A的回收率范围和室内精密度。
实验内数据表明，方法的总体平均回收率78.4%～103.6%，方法的相对标准偏差为5.1%～13.2%，实验内数据参见表3。
基质空白图及基质加标图见图4。
图4-1松花粉空白基质色谱图
图4-2松花粉添加10.0µg/kg色谱图
图4-3玉米花粉空白基质色谱图
图4-4玉米花粉添加10.0µg/kg色谱图
图4-5茶花粉空白基质色谱图
图4-6茶花粉添加10.0µg/kg色谱图
图4-7荷花粉空白基质色谱图
图4-8荷花粉添加10.0µg/kg色谱图
图4-9油菜花粉空白基质色谱图
图4-10油菜花粉添加10.0µg/kg色谱图
表3赭曲霉毒素A回收率和精密度（n=6）
样品种类
添加水平
（μg/kg）
实测值（μg/kg）
平均回收率（%）
相对标准偏差RSD（%）
1
2
3
4
5
6
松花粉
5
3.68
3.72
4.04
4.82
3.98
3.28
78.4
13.2
10
7.85
8.07
9.92
8.55
7.06
7.94
82.3
11.6
20
16.31
15.76
14.88
19.12
18.06
17.96
85.1
9.5
玉米花粉
5
4.02
4.98
5.03
5.12
4.55
5.18
96.3
9.3
10
9.95
9.43
8.87
10.02
10.26
9.82
97.2
5.1
20
17.89
18.95
20.18
19.25
16.99
21.05
92.9
9.8
茶花粉
5
4.05
3.77
3.82
4.68
4.92
4.88
87.0
12.2
10
8.11
7.90
9.28
9.95
9.05
9.27
89.3
8.7
20
18.06
19.22
19.95
20.18
17.66
17.03
93.4
6.9
荷花粉
5
4.72
5.42
5.16
5.38
5.53
4.86
103.6
6.3
10
8.27
9.23
10.82
10.05
11.62
9.67
99.4
11.9
20
20.15
21.03
19.52
17.83
21.33
22.04
101.6
7.4
油菜花粉
5
4.22
5.08
4.10
4.92
3.98
4.77
90.2
10.4
10
8.18
7.45
9.09
9.25
8.76
8.04
84.6
8.2
20
16.75
15.38
18.04
19.92
17.99
18.28
88.6
8.6
四、结论
综合上述情况，本检测方法各项技术指标均符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：
化学分析方法》的要求。
故本方法申请作为供销总社行业标准，用于蜂花粉中赭曲霉毒素的残留检测。
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