分子生物学实验理论与操作教程.docx
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分子生物学实验理论与操作教程
分子生物学实验理论与操作教程
分子生物学实验理论与操作教程
中国农科院研究生院
中国生化及分子生物学学会
植物病虫害生物学国家重点实验室
二零零四年七月
前言-----------------------------------------------------------I
第一部分核酸提取----------------------------------------------1
实验一：
基因组DNA提取--------------------------------------------1
实验二：
总RNA提取------------------------------------------------3
第二部分亚克隆技术---------------------------------------------8
实验三：
质粒DNA提取----------------------------------------------8
实验四：
DNA片段的酶切--------------------------------------------9
实验五：
DNA片段的酶修饰-脱磷-------------------------------------12
实验六：
DNA片段的连接--------------------------------------------13
实验七：
DNA片段的回收-------------------------------------------15
第三部分PCR技术-----------------------------------------------18
实验八：
PCR产物的克隆技术----------------------------------------18
八．1：
T-载体构建---------------------------------------------19
八．2：
PCR产物的T-载体克隆------------------------------------20
八．3：
PCR产物的平端克隆技术----------------------------------21实验九：
RT-PCR技术-----------------------------------------------21
实验十：
定量PCR-------------------------------------------------25
第四部分文库构建技术------------------------------------------29
实验十一：
mRNA的提取及纯化--------------------------------------29
实验十二：
cDNA文库构建技术-cDNA链的反转合成--------------------32实验十三：
1,cDNA文库构建技术-cDNA链的连接、包装及转染----------34
实验十三：
2,RACE技术---------------------------------------------36
第五部分核酸杂交技术-------------------------------------------40
实验十四：
DNA探针的标记------------------------------------------40
实验十五：
Southern杂交技术---------------------------------------44
第六部分：
基因及基因产物检测技术----------------------------------48
实验十六：
DNA的测序技术------------------------------------------48
实验十七：
基因表达1，基因的体外快速翻译-------------------------53
2，基因的诱导表达-----------------------------54
实验十八：
报告基因的应用------------------------------------------57
实验十九：
Western杂交技术----------------------------------------58
第七部分基因表达轮廓技术---------------------------------------67
实验二十：
DD-PCR技术---------------------------------------------73
实验二一：
SSH技术------------------------------------------------74
第八部分：
遗传转化技术-------------------------------------------75
实验二二：
感受态细胞制备-----------------------------------------75
实验二三：
重组基因的转化及筛选------------------------------------77
实验二四：
原生质体分离--------------------------------------------78
实验二五：
农杆菌转化技术------------------------------------------79
第九部分：
分子标记技术--------------------------------------------80
实验二六：
RFLP技术-----------------------------------------------86
实验二七：
RAPD技术-----------------------------------------------86
实验二八：
AFLP技术-----------------------------------------------87
实验二九：
SSR技术------------------------------------------------89
第十部分：
细胞技术-----------------------------------------------89
实验三十：
细胞凋亡------------------------------------------------89
十一：
附录一----------------------------------------------------92
二-----------------------------------------------------96
第一部分核酸提取
目的基因主要可以通过以下途径加以分离获取。
对于序列已知或部分已知的寡聚核苷酸基因片断或基因可通过DNA的人工合成直接获取；或利用PCR、RT-PCR及RACE技术，直接扩增出相应的基因片段；对于未知序列的基因或基因片断利用dd-PCR等差异显示技术、转坐子标签技术、分子标记技术、图位克隆及电子杂交等手段分离出相应目的基因或探针片段，建立基因组文库或CDNA文库，再用探针从相应文库中钓相关基因。
本部分主要介绍基因组DNA的提取纯化，RNA提取纯化等实验方法，其余内容见相应章节。
实验一:
基因组DNA的提取
DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。
在DNA提取过程中应做到1,根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2,尽量排除其它大分子成分的污染（蛋白质、多糖及RNA等）；3,保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。
下面结合不同的研究对象列出几种相应的DNA提取方法。
方法1，基因组总DNA的大量提取
本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。
一：
仪器高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪
二：
试剂细胞裂解液（100mMTris-HCl5mMEDTA500mMNaCl1%SDSpH7.5）；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3MNaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液
三:
操作动植物材料10g（鲜组织）0.5g（干冻组织）
液氮,研碎
10ml裂解液（含1/10体积酚）,（65℃预热）,
加入等体积氯仿,65℃放置30分钟，
间隔5－10min轻摇一次,
离心（12000-15000rpm,15min）
上清液
静止下
0.6体积冷异丙醇,
0.1体积3MpH5,2乙酸钠,
挑取絮状体,70%冷乙醇洗涤,真空干燥,
2mlTE（或水）＋10ulRNase，65℃,10-30分复溶和除RNA
等体积酚/氯仿,氯仿抽提
（轻轻混匀、冰浴沉淀5min，5000RPM离心5min，取上清）
上清液
2V无水乙醇、1/10VnaAC,
-20,2或-80℃，30min
10000RPM,10min
沉淀
70%冷乙醇洗涤
真空干燥
干粉-20℃保存，
或复溶于0.5-1mlTE或水中,分装成小体积,-20℃或4℃保存
四：
鉴定
所提DNA进行Agarose胶分析（电泳过程见附），紫外观测仪观测，凝胶成像系统拍摄。
注意:
1,裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解
2，酚一定要碱平衡
3,各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解
4,取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.
5,异丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
6,本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省线的特点。
7,此方法也适合菌类基因组DNA的大量提取.
方法二：
细菌基因组DNA的微量提取法
本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分
一：
仪器：
同方法一
二：
试剂：
TE、TAE缓冲液；10%SDS；５ＭNaCL；
20mg/ml蛋白酶Ｋ；CTAB/NaCL溶液（10%CTAB，0.7MNaCL4.1gNaCL溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解）；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇;24/1,氯仿/异戊醇；异丙醇；７０％及100%乙醇
三：
操作
1.5ml对数生长期细菌细胞
离心，5000rpm,1min
沉淀
溶于500μlTE缓冲液中混匀
30μl10%SDS,3μL蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1小时
100μlNaCL（5M）混匀
80μl的CTAB/NaCL,*混匀；65℃10min（可不做）
加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，
离心12000rpm,4-5min
取上清，以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、复溶等步骤一致。
注意１，*此步操作后，离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M，否则DNA将与CTAB共沉淀。
2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。
对于菌体样品,通过此流程,可以获得较为完整的DNA分子。
方法三：
酵母菌基因组DNA的提取
一：
仪器：
同方法一
二：
试剂：
SE缓冲液（1M山梨醇，0.1MEDTApH7.5）；溶菌酶（50mg/ml）；20％PVP；蛋白酶K缓冲液（10mMTrispH7.60.5%SDS1mMEDTA）；其余同前
三：
操作
1.5ml对数生长期细菌细胞
离心，12000rpm,1-2min
沉淀
溶于590ulSE缓冲液中混匀+10ul溶菌酶37℃,1hr
离心，12000rpm,8-10min
沉淀
溶于100μL，0.5μl蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1hr
加入1.2ml的CTAB/NaCL,200μl20%PVP混匀65℃,30min
等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,
离心,12000rpm,4-5min
上清,以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、复溶等步骤一致。
实验二：
总RNA的提取
完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。
所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即１）：
样品细胞或组织的有效破碎；２），有效地使核蛋白复合体变性；３），对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；5），对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。
RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径，1）,提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2）,直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。
第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。
方法一:
总RNA的试剂盒快速提取
一些公司推出的总RNA提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA。
该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧（GTC）和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。
GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。
而进一步从复合体中纯化RNA,则根据Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。
低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。
水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。
进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。
一：
仪器
恒温水浴,冷冻高速离心机,紫外分光光度计,取液器,电泳仪,电泳槽
二：
试剂
RNA提取试剂盒,0.05%焦碳酸二乙酯（DEPC）,75%乙醇
操作步骤
（一）:
细胞或组织破碎
A:
微生物材料
１：
发酵３－４天（或对数生长期）的菌体，离心收集菌丝体（动植物材料无需此步处理）
２：
用经DEPC处理的水洗菌丝体２－３次，并尽量除去残存的水
３：
加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA
４：
研磨后的样品转移至１２ml变性液的容器中匀浆。
B:
动植物细胞培养材料（适用的样品量为细胞:
108）
1:
细胞或组织培养:
按常规方法进行
2:
深层悬浮培养细胞的破碎:
（1）细胞收集:
含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中,4℃,3000g离心5分钟
（2）细胞洗涤:
上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤,然后4℃,3000g离心5分钟,
（3）细胞破碎:
在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液,用无菌处理过的匀浆器匀浆
3:
表面培养细胞的破碎:
（1）确定培养瓶数量,使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108
（2）细胞收集:
将培养液倒掉,用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次,在培养瓶中加入8毫升预冷变性液,转动培养瓶,使细胞溶解,此时可见粘度加大.
（3）用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶,旋转,溶解细胞,再吸入第三个培养瓶,以此类推,直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次,然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液,将所有培养瓶洗一次.
（4）将上述12毫升含细胞的变性液转移至一50毫升无菌离心管中,匀浆破碎细胞.
C:
植物组织破碎（适用的样品量为0.05g组织）
（1）将600ul变性液置于1.5ml离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟.
（2）将0.05g新鲜组织用液氮冰冻
（3）在液氮下,研磨组织块
（4）待液氮挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管中.
D:
动物组织破碎（适用的样品量为1克组织）
（1）将12毫升变性液置于50毫升离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟.
（2）在上述管中加入1克新鲜或冰冻动物组织,匀浆粉碎.
注1:
研磨组织块用于RNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。
2:
变性液及相应的离心管需预冷
（二）:
RNA的抽提
在经变性液匀浆的细胞或组织600ul＋60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器
600ul酚\氯仿\异戊醇（25\24\1）,彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒
冰裕中10-15分钟,
离心,4℃，10000g,20分钟
上层水相吸至无菌离心管中+等体积的异丙醇,-70℃,30分钟沉淀RNA
离心4℃，10000g,20分钟
沉淀RNA,冷冻干燥15分钟,RNA沉淀重新溶于300ul变性液中,可振荡（有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短）
60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器
600ul酚\氯仿\异戊醇（25\24\1）,彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒
冰裕中10-15分钟,
离心,4℃，10000g,20分钟
上层水相吸至无菌离心管中
等体积异丙醇二次沉淀（-70℃,30分钟）,７５％乙醇洗沉淀,沉淀冷冻干燥,复溶于去RNA酶的水中（对于准备长期保存的RNA可加入pH5.0的乙酸钠至终浓度为0.25M，再加入2.5体积的乙醇，－７０℃保存。
）
注：
1变性液组成：
25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB（42mMpH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mMβ-巯基乙醇），65℃溶解，过滤灭菌，4℃预冷。
2酸性酚配制：
55℃时，500g酚溶入500ml50mM,pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500ml50mM,pH4.0乙酸钠,直到pH<4.1。
方法二:
氯化锂法提取总RNA
本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。
仪器：
同上
试剂：
氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g（3M）尿素、360g（6M）加水至1L，过滤灭菌】
悬浮液【10mMTris-HCL（pH7.6）,1mMEDTA（pH8,0）,0.5%SDS】
其余同上
操作步骤：
1：
对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中
2：
匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟
3：
取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2
4：
沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟
5：
取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。
6：
70％乙醇洗沉淀一次。
真空干燥。
7：
RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。
方法三：
蛋白酶－热酚法
本方法适合于病毒RNA的提取
仪器：
同上
试剂：
蛋白酶K（终浓度50ug/ml）
2×缓冲液：
1%SDS20mMTris-HCL（pH7.6）0.2MnaCL
其余同上
操作：
1，提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟
2，加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。
3，离心，取上清，氯仿抽提一次
4，取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心（10000g,10min）。
5，70％乙醇洗沉淀一次。
真空干燥。
6，RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。
上面介绍了一些核酸（DNA、RNA）提取方法，在进行具体实验时，应根据研究对象的性质，提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。
以下一些原则和建议对核酸提取的操作可能会有一定的裨益。
1：
在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，以释放更多的游离核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。
2：
有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高到50－60℃，并将反应时间缩短到15－25min，但酶用量必须提高10－20倍。
溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子对酶有抑制。
3：
许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的锟类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。
PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离。
且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。
另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
4：
许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。
克服多糖污染可采用以下一些办法
（1）CTAB多次抽提。
（2）在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度（可到10倍左右），对低浓度样品再进行沉淀。
（3）在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。
异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。
但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
5：
在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。
酚的变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性，也可用单一酚作变性己，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。
6：
在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作。
7：
在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。
8：
在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，－70℃下>30min;－20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。
9：
在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储藏稳
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